Name: partial hepatectomy in adult zebrafish
Uploaded: 2021-04-04T15:00:00
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I.M.O. è supportato dal NIAAA (F32AA027135). W.G. è supportato da R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 e dal Claudia Adams Barr Program for Excellence in Cancer Research. W.G. è uno studioso di scienze biomediche di Pew.

Zebrafish sono stati allevati e allevati secondo procedure standard. Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Brigham and Women's Hospital (2016N000405). I pesci zebra adulti sono stati digiunati per 24 ore prima dell'inizio del protocollo. L'acqua del sistema si riferisce all'acqua nei serbatoi di alloggiamento del pesce zebra nella struttura acquatica.
1. Preparazione e anestesizzazione
<ol><li>Preparare la soluzione di Tricaine ...

<ol>
	<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+liver+regeneration+and+growth+homeostasis.">Principles of liver regeneration and growth homeostasis.</a> Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).</li><li>Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+it+new+again:+insight+into+liver+development,+regeneration,+and+disease+from+zebrafish+research.">Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).</li><li>Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+biological+and+pathological+mechanisms+and+implications.">Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications.</a> Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).</li><li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration.">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).</li><li>Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+growth+in+the+embryo+and+during+liver+regeneration+in+zebrafish+requires+the+cell+cycle+regulator+uhrf1.">Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).</li><li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development.">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).</li><li>Dovey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+II+is+required+for+embryonic+development+and+liver+regeneration+in+zebrafish.">Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).</li><li>Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+growth+mechanisms+regulated+by+BMP+and+FGF+signaling+mediate+liver+regeneration+in+zebrafish+after+partial+hepatectomy.">Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy.</a> The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).</li><li>Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficiency+of+Def+activates+p53-dependent+TGF&#946;+signalling+and+causes+scar+formation+after+partial+hepatectomy.">Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGF&#946; signalling and causes scar formation after partial hepatectomy.</a> PLoS One. 9, (2014).</li><li>Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+characterization+of+the+dorsal+lobes+after+hepatectomy+of+the+ventral+lobe+in+zebrafish.">Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish.</a> BMC Genomics. 16, 979 (2015).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).</li><li>Grisham, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizational+principles+of+the+liver.">Organizational principles of the liver.</a> The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).</li></ol>

Le differenze anatomiche tra zebrafish e modelli di mammiferi per la rigenerazione del fegato presentano sfide uniche per la resezione epatica. Il fegato nei pesci zebra è nelle immediate vicinanze del cuore e dell'intestino; inavvertitamente dannoso per entrambi gli organi si traduce in un aumento della mortalità. Il fegato di zebrafish non è incapsulato, rendendo più difficile separarsi dall'intestino. Il fegato riceve sangue ricco di nutrienti dall'intestino attraverso le vene portale. Nei mammiferi, le vene che l...

Tra gli organi solidi nell'uomo, il fegato è l'unico organo in grado di rigenerazione1. Questo è fondamentale, in quanto il fegato è un organo essenziale, responsabile delle principali funzioni metaboliche, conservazione dell'energia, disintossicazione del sangue, secrezione di proteine plasmatiche e produzione di bile2. Gli epatociti persi a causa di danni tossici o infiammatori vengono sostituiti principalmente attraverso la divisione degli epatociti rimanenti1. Un modello sperimentale classico per lo studio della rigenerazione epatica è l'epatomia parziale, in cui vengono rimossi i singoli lobi del fegato, lasciando intatti i lobirimanenti 3. Questa procedura è stata inizialmente sviluppata nei ratti, in cui vengono rimossi circa due terzi della massa epatica. Dopo un'epatomia parziale nei mammiferi, la rigenerazione compensativa si verifica nei lobi rimanenti fino a quando il fegato non recupera la sua massa iniziale. In particolare, il fegato di mammifero non sostituisce i lobi mancanti.
I pesci zebra (Danio rerio) rappresentano un modello trattabile per lo studio della rigenerazione di organi adulti4. Il fegato di zebrafish, sebbene strutturalmente diverso dal fegato di mammifero, è costituito dagli stessi tipi di cellule e svolge la stessa funzione dei mammiferi2. È composto da tre lobi, con due lobi dorsali e un singolo lobo ventrale che sono appiattiti lungo l'intestino. L'epatotomia parziale è stata precedentemente eseguita in zebrafish, con resoconti contrastanti sulla modalità precisa di rigenerazione. Tipicamente, un'epatotectomia parziale di un terzo viene eseguita rimozione dell'intero lobo ventrale. I primi rapporti indicavano che dopo la rimozione del lobo ventrale, è stato completamente rigenerato entrouna settimana 5,6,7, suggerendo che a differenza del fegato di mammifero, il fegato di zebrafish è in grado di rigenerazione epimorfica. Studi successivi hanno dimostrato che la rimozione del lobo ventrale ha portato alla rigenerazione compensativa nei lobi dorsali, piuttosto che alla rigenerazione del lobo ventrale mancante e, in ultima analisi, al recupero della massa epatica entrouna settimana 8,9. La profilazione trascrittamica dei lobi dorsali a seguito della resezione del lobo ventrale ha rivelato cambiamenti significativi associati alla rigenerazionecompensativa 10. Dato che la modalità di rigenerazione epatica può variare con l'entità dellalesione 8, abbiamo ipotizzato che le discrepanze nei risultati possano essere dovute a variazioni tecniche nel protocollo parziale di epatomia tra gruppi di ricerca.
Questo protocollo descrive una procedura per eseguire un'epatotectomia parziale di un terzo sul pesce zebra adulto rimuovendo il lobo ventrale. Questa tecnica sarà preziosa per valutare i meccanismi di rigenerazione epatica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance</td>
			<td>Bay State Scale &#38; Systems, INC.</td>
			<td>WL-104-1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72997-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Discovery.V8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07CBSM53Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS10X Liquid Conc 4L</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>6505-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Micro Scissors, 3 1/4&#34; straight</td>
			<td>Biomedical Research Instruments</td>
			<td>11-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Syndel</td>
			<td>TRIC-M-GR-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

partial hepatectomy in adult zebrafish

L'insufficienza epatica è una delle principali cause di morte in tutto il mondo e la mortalità per malattie croniche del fegato sta aumentando bruscamente negli Stati Uniti. I fegati sani sono in grado di rigenerarsi da danni tossici, ma nelle malattie epatiche avanzate, la naturale capacità del fegato di rigenerarsi è compromessa. Zebrafish è emerso come un potente sistema sperimentale per lo studio della rigenerazione. Sono un modello ideale per studiare la rigenerazione epatica dall'epatomia parziale, una procedura con rilevanza clinica diretta in cui parte del fegato viene rimossa chirurgicamente, lasciando intatto il resto. Non esiste un protocollo standard per l'epatotomia parziale; studi precedenti che utilizzano questo modello hanno utilizzato protocolli leggermente diversi e riportato risultati disparati. Qui descritto è un protocollo efficiente e riproducibile per eseguire un'epatotectomia parziale nel pesce zebra adulto. Usiamo questa tecnica per dimostrare che i pesci zebra sono in grado di rigenerazione epimorfica del lobo reinsediato. Questo protocollo può essere utilizzato per interrogare ulteriormente i meccanismi necessari per la rigenerazione epatica nel pesce zebra.

Al fine di esaminare il potenziale rigenerativo del fegato di zebrafish adulto, abbiamo eseguito un'epatotectomia parziale (PHX) nel pesce zebra adulto. In generale, sono stati selezionati grandi adulti (30-40 mm di lunghezza), che vanno da 1,5 a 2,5 anni. All'interno dei singoli esperimenti, gli animali venivano selezionati dallo stesso serbatoio e corrispondevano all'età e alle dimensioni. Come controllo appropriato, abbiamo utilizzato interventi chirurgici fittizi in cui l'animale è stato anestetizzato e ha ricevuto...

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Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish

Questo protocollo descrive la procedura per rimuovere il lobo ventrale del fegato nel pesce zebra adulto per consentire lo studio della rigenerazione epatica.

Epatotectomia parziale nel pesce zebra adulto

Liver failure is one of the leading causes of death worldwide, and mortality from chronic liver disease is rising sharply in the United States. Healthy ...

Questo protocollo consentirà ai ricercatori di sfruttare gli strumenti chimici e genetici disponibili per studiare i meccanismi di rigenerazione epatica nel pesce zebra. L'epatomia parziale consente la rimozione precisa dei tessuti per stimolare la rigenerazione epatica senza la necessità degli effetti a livello corporeo di lesioni epatiche tossiche. Solo comprendendo i meccanismi molecolari e cellulari di rigenerazione epatica possiamo progettare nuove terapie per trattare pazienti con malattie epatiche avanzate.Per iniziare, rimuovere il pesce dal serbatoio di Tricaine usando le forcep e incorporarli nel solco di una spugna imbevuta di Tricaine con il lato ventrale verso l'alto. Quindi posizionare la spugna sotto un microscopio sezionato con illuminazione dall'alto verso il basso. Pizzicare la pelle e le squame appena posteriori al cuore con forcep fini e creare un buco nella cavità corporea facendo un taglio sotto le forcep con la forbice caricata a molla.Ruotare la spugna e fare un'incisione da tre a quattro millimetri lungo l'addome tagliando posterialmente verso le pinne pelviche. Quindi ruotare la spugna indietro. Spremere i lati della spugna con una mano per forzare gli organi viscerali fuori dalla cavità corporea.Il lobo ventrale del fegato è presente sopra l'intestino e il fegato è una struttura rosa o arancione distribuita sull'intestino marrone dorato e può essere chiaramente visualizzato con la fluorescenza CFP. Spremere le forcep fini in modo che i denti si tocchino a vicenda e far scorrere i denti tra il fegato e l'intestino. Quindi separare lentamente i denti per rompere gli attacchi delle vene portale tra il fegato e l'intestino.Ripetere questo processo fino a quando tutte le connessioni del portale tra fegato e intestino sono state recise e estrarre il lobo ventrale dall'intestino usando forcep fini. Tagliare il lobo ventrale libero dal resto del fegato. L'esame dell'animale con fluorescenza CFP dimostra che il lobo ventrale è stato rimosso.Al termine, trasferire attentamente il pesce dalla spugna nel serbatoio contenente acqua del sistema e trasmettere l'acqua del sistema sulle branchie per alcuni minuti fino a quando il pesce non si riprende e nuota da solo. Dopo aver eutanasiato il pesce, rimuoverlo dall'acqua ghiacciata. Posizionarlo nella scanalatura di una spugna con il lato ventrale verso l'alto e fare un'incisione della parete del corpo ventrale nella posizione posteriore anteriore del cuore.Quindi fare altre due incisioni dai bordi della prima incisione che corrono lungo l'asse posteriore anteriore alle pinne pelviche e sbucciare la pelle e il muscolo per rivelare gli organi viscerali. Gli organi viscerali possono ora essere visualizzati sia con il campo luminoso che con la microscopia a fluorescenza. Il recupero del fegato dopo l'epatomia parziale è stato stimato calcolando il rapporto fegato/peso corporeo, che era dell'1,8% per i maschi e del 3,3% per le femmine.Il rapporto fegato/peso corporeo di entrambi i sessi è stato determinato al giorno zero post-intervento e al settimo giorno in epatectomia parziale e controlli fittizi. Al giorno zero post-intervento chirurgico, gli animali fittizi hanno un lobo ventrale visibile, ma negli animali dell'epatomia parziale, il lobo ventrale era completamente assente, il che ha comportato una riduzione del 30% dei maschi e del 20% delle femmine dei rapporti fegato/peso corporeo. Al settimo giorno post-intervento chirurgico negli animali dell'epatomia parziale, il lobo ventrale non è stato rigenerato e i rapporti fegato/peso corporeo in epatomia parziale e controlli fittizi erano comparabili, indicando la massa epatica riconquistata dopo l'epatomia parziale.L'effetto del tempo sulla rigenerazione del lobo ventrale è stato determinato eseguendo un'epatectomia parziale completa di 1/3 e misurando il lobo ventrale al rapporto lunghezza intestino. Il lobo ventrale occupava dal 50 al 100% della lunghezza dell'intestino nei controlli fittizi, ma è stato gravemente ridotto in 1/3 animali epatectomia parziale. Gli animali dell'epatomia parziale nel giorno post-intervento 36 hanno avuto un aumento del rapporto lobo ventrale/intestino rispetto al primo giorno post-intervento chirurgico.Un aumento statisticamente significativo delle dimensioni del lobo ventrale è stato osservato negli animali che si stanno riprendendo dall'epatomia parziale nel giorno post-intervento 36 rispetto al primo giorno, ma non nei controlli fittizi. Alcuni animali hanno rigenerato il lobo ventrale, ma alcuni no, indicando variazioni nella risposta chirurgica. La parte più critica di questo protocollo è separare in modo pulito il fegato e l'intestino in modo che il lobo ventrale possa essere completamente rimosso.L'epatomia parziale nel pesce zebra può essere eseguita in linee mutanti o transgeniche per dire che il fabbisogno genetico per la rigenerazione epatica.

Research

JoVE Journal

Biology

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Dissezione del rene Zebrafish adulti

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Il prelievo di sangue per l&#39;analisi biochimica in Zebrafish Adult

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