Name: partial hepatectomy in adult zebrafish
Uploaded: 2021-04-04T15:00:00
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I.M.O.は、NIAAA(F32AA027135)によってサポートされています。W.G.は、R01DK090311、R01DK105198、R24OD017870、およびがん研究の卓越性のためのクラウディア・アダムス・バー・プログラムによってサポートされています。W.G.は生物医学のピュー学者です。

ゼブラフィッシュは、標準的な手順に従って飼育され、飼育されました。実験はブリガム・アンド・ウィメンズ病院の施設動物の世話と使用委員会(2016N000405)によって承認されました。成体ゼブラフィッシュは、プロトコルの開始前に24時間断食した。システム水とは、水生施設のゼブラフィッシュの収容タンク内の水を指します。
1. 準備と麻酔
<ol><li>システム水に0.016%...

<ol>
	<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+liver+regeneration+and+growth+homeostasis.">Principles of liver regeneration and growth homeostasis.</a> Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).</li><li>Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+it+new+again:+insight+into+liver+development,+regeneration,+and+disease+from+zebrafish+research.">Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).</li><li>Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+biological+and+pathological+mechanisms+and+implications.">Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications.</a> Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).</li><li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration.">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).</li><li>Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+growth+in+the+embryo+and+during+liver+regeneration+in+zebrafish+requires+the+cell+cycle+regulator+uhrf1.">Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).</li><li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development.">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).</li><li>Dovey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+II+is+required+for+embryonic+development+and+liver+regeneration+in+zebrafish.">Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).</li><li>Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+growth+mechanisms+regulated+by+BMP+and+FGF+signaling+mediate+liver+regeneration+in+zebrafish+after+partial+hepatectomy.">Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy.</a> The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).</li><li>Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficiency+of+Def+activates+p53-dependent+TGF&#946;+signalling+and+causes+scar+formation+after+partial+hepatectomy.">Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGF&#946; signalling and causes scar formation after partial hepatectomy.</a> PLoS One. 9, (2014).</li><li>Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+characterization+of+the+dorsal+lobes+after+hepatectomy+of+the+ventral+lobe+in+zebrafish.">Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish.</a> BMC Genomics. 16, 979 (2015).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).</li><li>Grisham, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizational+principles+of+the+liver.">Organizational principles of the liver.</a> The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).</li></ol>

肝臓再生のためのゼブラフィッシュと哺乳類モデルの解剖学的な違いは、肝臓切除に独特の課題を提示する。ゼブラフィッシュの肝臓は心臓と腸の近くにあります。誤ってどちらかの臓器にダメージを与えると、死亡率が増加する。ゼブラフィッシュの肝臓はカプセル化されておらず、腸から分離することがより困難になります。肝臓は、門脈を介して腸から栄養豊富な血液を受け取ります....

ヒトの固体器官の中で、肝臓は再生可能な唯一の器官である1.これは肝が必須臓器であるため、重要な代謝機能、エネルギー貯蔵、血液解毒、血漿タンパク質の分泌、胆汁産生を担う重要な2である。毒性または炎症性の損傷のために失われた肝細胞は、主に残りの肝細胞の分裂によって置換される1.肝臓再生を研究するための古典的な実験モデルの1つは、肝臓の個々の葉が除去され、残りの葉がそのまま残っている部分肝切除術である3.この手順は、最初にラットで開発されました, 肝臓の質量の約3分の2が除去されます.哺乳類の部分的な肝切除術の後、肝臓が最初の質量を回復するまで残りの葉に代償性再生が起こる。特に、哺乳類の肝臓は欠けている葉を置き換えません。
ゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ)は、成人臓器再生4を研究するための難解なモデルを表す。ゼブラフィッシュ肝臓は、哺乳類の肝臓と構造的に異なるが、同じ細胞タイプで構成され、哺乳動物2と同じ機能を果たす。それは3つの葉で構成され、2つの後部葉と腸に沿って平らにされる単一の腹側葉がある。部分的な肝切除術は、以前にゼブラフィッシュで行われ、再生の正確なモードに関して矛盾するアカウントを持つ。典型的には、腹側葉全体の除去によって3分の1分の肝切除術が行われる。最初の報告では、腹側葉を除去した後、1週間5、6、7以内に完全に再生し、哺乳類の肝臓とは対照的に、ゼブラフィッシュ肝臓はエピモルフィック再生が可能であることを示唆した。その後の研究では、腹側葉の除去は、行方不明の腹側葉の再生ではなく、後部葉の代償性再生をもたらし、最終的には週8、9以内に肝臓質量の回復をもたらした。腹側葉の切除後の側葉の転写的プロファイリングは、代償性再生10に関連する有意な変化を明らかにした。肝再生の様式は傷害8の程度によって変化する可能性があることを考えると、結果の不一致は研究グループ間の部分肝切除プロトコルの技術的変動によるものかもしれないと推測した。
このプロトコルは、腹側葉を除去することによって成体ゼブラフィッシュに3分の1の部分肝切除術を行うための手順を記述する。この技術は、肝再生のメカニズムを評価するために有用である。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance</td>
			<td>Bay State Scale &#38; Systems, INC.</td>
			<td>WL-104-1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72997-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Discovery.V8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07CBSM53Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS10X Liquid Conc 4L</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>6505-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Micro Scissors, 3 1/4&#34; straight</td>
			<td>Biomedical Research Instruments</td>
			<td>11-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Syndel</td>
			<td>TRIC-M-GR-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

partial hepatectomy in adult zebrafish

肝不全は世界的に主要な死因の一つであり、慢性肝疾患による死亡率は米国で急激に増加している。健康な肝臓は、毒性の損傷から再生することができるが、先進の肝疾患では、再生する肝臓の自然な能力が損なわれる。ゼブラフィッシュは、再生を研究するための強力な実験システムとして登場しました。それらは部分的な肝切除術からの肝臓再生を研究するための理想的なモデルであり、肝臓の一部が外科的に除去され、残りはそのまま残る直接的な臨床的関連性を有する処置である。部分肝切除術のための標準的なプロトコルはありません。このモデルを使用した以前の研究では、わずかに異なるプロトコルを使用し、異なる結果を報告しました。ここで説明する、成体ゼブラフィッシュの部分肝切除術を行うための効率的で再現可能なプロトコルである。この技術を用い、ゼブラフィッシュが切除された葉のエピモルフィック再生が可能であることを実証する。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの肝臓再生に必要なメカニズムをさらに調べるのに使用できます。

成体ゼブラフィッシュ肝臓の再生ポテンシャルを調べるために、成体ゼブラフィッシュで部分肝切除術(PHX)を行った。一般に、1.5〜2.5歳の範囲で、大きな成人(長さ30〜40mm)が選択された。個々の実験の中で、動物は同じタンクから選択され、年齢とサイズが一致した。適切な対照として、我々は、動物が麻酔を受け、腹側の体壁に大きな切開を受けたが、組織を除去せずに回収されたシャム手...

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Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish

このプロトコルは、肝臓再生の研究を可能にするために、成体ゼブラフィッシュの肝臓の腹側葉を除去するための手順を説明します。

成虫ゼブラフィッシュの部分肝切除術

Liver failure is one of the leading causes of death worldwide, and mortality from chronic liver disease is rising sharply in the United States. Healthy ...

このプロトコルは、研究者がゼブラフィッシュの肝臓再生のメカニズムを研究するために利用可能な化学的および遺伝的ツールを利用することを可能にする。部分肝切除術は、組織の正確な除去を可能にし、毒性肝損傷の身体全体の影響を必要とせずに肝臓再生を刺激する。肝再生の分子・細胞機構を理解することによってのみ、高度な肝疾患患者を治療するための新しい治療法を設計することができます。まず、鉗子を使用してトリケーヌタンクから魚を取り出し、腹側を上にしてトリケーヌ浸したスポンジの溝に埋め込みます。その後、スポンジをトップダウン照明で解剖顕微鏡の下に置きます。皮膚をつまみ、細かい鉗子で心臓の後部にちょうどスケールし、スプリングロードされたはさみで鉗子の下にカットを行うことによって、体腔に穴を開けます。スポンジを回転させ、骨盤のフィンに向かって後で切断することによって腹部に沿って3〜4ミリメートルの切開を行います。その後、スポンジを後ろに回転させます。片手でスポンジの側面を絞り、内臓を体腔から強制的に外します。肝臓の腹側葉は腸の上に存在し、肝臓は黄金色の腸に広がるピンクまたはオレンジの構造であり、CFP蛍光で明確に視覚化することができる。細かい鉗子を絞って、尖叉が互いに触れ合い、肝臓と腸の間の尖叉をスライドさせます。その後、ゆっくりと肝臓と腸の間のポータル静脈の添付ファイルを破るために尖叉を分離します。肝臓と腸の間のすべての門脈が切断されるまでこのプロセスを繰り返し、細かい鉗子を使用して腸から腹側葉を引っ張ります。腹側葉を肝臓の残りの部分から自由に切ります。CFP蛍光を有する動物の検査は、腹側の葉が除去されたことを示す。完了したら、慎重にシステムの水を含むタンクにスポンジから魚を転送し、魚が回復し、自分で泳ぐまで、数分間エラの上にシステム水をストリーミングします。魚を安楽死させた後、氷水から取り除きます。腹側を上にしてスポンジの溝に入れ、心臓の前部後部位置で腹側の体壁の切開を行います。次に、前部後軸に沿って走る最初の切開の端から骨盤のひれまでさらに2つの切開を行い、皮膚と筋肉を剥がして内臓を明らかにする。内臓は、明視野と蛍光顕微鏡の両方で視覚化できるようになりました。部分肝切除後の肝臓回復は、肝臓対体重比を計算することによって推定され、これは男性で1.8%、女性で3.3%であった。両性の肝臓と体重の比率は、手術後ゼロで決定され、7日目は部分肝切除術および偽のコントロールで決定された。手術後のゼロでは、シャム動物は目に見える腹側葉を持っていますが、部分的な肝切除動物では、腹側葉は完全に存在せず、男性が30%減少し、肝臓の体重比が20%減少しました。部分肝切除動物の手術後7日目には、腹側葉は再生されず、部分肝切除術および偽のコントロールにおける肝臓と体重の比率は同等であり、部分肝切除後に肝臓質量が回復したことを示す。腹側葉の再生に対する時間の影響は、完全な1/3部分肝切除術を行い、腹側葉を腸長比に測定することによって決定した。腹側葉は、恥のコントロールで腸長の50〜100%を占めていたが、1/3分の肝切除動物では著しく減少した。術後36日目の部分肝切除動物は、手術後1日目と比較して腹側葉と腸の比率が増加した。腹側葉の統計的に有意な大きさは、手術後36日目に部分的な肝切除術から回復した動物では、1日目と比較して観察されたが、シャムコントロールでは観察されなかった。一部の動物は腹側葉を再生したが、一部は手術応答の変動を示さなかった。このプロトコルの最も重要な部分は、腹側の葉を完全に除去できるように、肝臓と腸をきれいに分離することです。ゼブラフィッシュの部分肝切除術は、肝臓再生のための遺伝的要件をアッセイするために変異体またはトランスジェニックラインで行うことができる。

Research

JoVE Journal

Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

アダルトゼブラフィッシュの全腎骨髄の移植

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

アダルトゼブラフィッシュにおける眼窩インジェクション

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

アダルトゼブラフィッシュからの臓器の解剖

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

アダルトゼブラフィッシュへの腹腔内注射

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

アダルトゼブラフィッシュ腎臓の解剖

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

幼虫の心臓の解剖、少年と大人ゼブラフィッシュ、ゼブラフィッシュ</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

アダルトゼブラフィッシュ網膜にモルフォの in vivoエレクトロポレーションに

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

リジェネアダルトゼブラフィッシュテールフィンにMorpholinos の in vivoエレクトロポレーションで

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

大人のゼブラフィッシュの生化学的解析のための採血

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavagingアダルトゼブラフィッシュ

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...