Name: partial hepatectomy in adult zebrafish
Uploaded: 2021-04-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish at JoVE.com

I.M.O. støttes av NIAAA (F32AA027135). W.G. støttes av R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 og Claudia Adams Barr Program for Excellence in Cancer Research. W.G. er en Pew Scholar i biomedisinsk vitenskap.

Sebrafisk ble hevet og oppdrettet i henhold til standardprosedyrer. Eksperimenter ble godkjent av Brigham and Women's Hospital's Institutional Animal Care and Use Committee (2016N000405). Voksen sebrafisk ble fastet i 24 timer før starten av protokollen. Systemvann refererer til vannet i sebrafiskhustanker i vannanlegget.
1. Forberedelse og bedøvelse
<ol><li>Forbered 0,016% trikainoppløsning i systemvann. FORSIKTIG: Trikain er irriterende hvis den kommer i kontakt med øyne, hud eller ...

<ol>
	<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+liver+regeneration+and+growth+homeostasis.">Principles of liver regeneration and growth homeostasis.</a> Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).</li><li>Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+it+new+again:+insight+into+liver+development,+regeneration,+and+disease+from+zebrafish+research.">Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).</li><li>Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+biological+and+pathological+mechanisms+and+implications.">Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications.</a> Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).</li><li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration.">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).</li><li>Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+growth+in+the+embryo+and+during+liver+regeneration+in+zebrafish+requires+the+cell+cycle+regulator+uhrf1.">Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).</li><li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development.">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).</li><li>Dovey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+II+is+required+for+embryonic+development+and+liver+regeneration+in+zebrafish.">Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).</li><li>Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+growth+mechanisms+regulated+by+BMP+and+FGF+signaling+mediate+liver+regeneration+in+zebrafish+after+partial+hepatectomy.">Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy.</a> The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).</li><li>Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficiency+of+Def+activates+p53-dependent+TGF&#946;+signalling+and+causes+scar+formation+after+partial+hepatectomy.">Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGF&#946; signalling and causes scar formation after partial hepatectomy.</a> PLoS One. 9, (2014).</li><li>Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+characterization+of+the+dorsal+lobes+after+hepatectomy+of+the+ventral+lobe+in+zebrafish.">Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish.</a> BMC Genomics. 16, 979 (2015).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).</li><li>Grisham, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizational+principles+of+the+liver.">Organizational principles of the liver.</a> The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).</li></ol>

De anatomiske forskjellene mellom sebrafisk og pattedyrmodeller for leverregenerering gir unike utfordringer for leverreseksjon. Leveren i sebrafisk er i nærheten av hjertet og tarmen; utilsiktet skade på begge organene resulterer i økt dødelighet. Sebrafiskleveren er ikke innkapslet, noe som gjør det vanskeligere å skille seg fra tarmen. Leveren mottar næringsrikt blod fra tarmen gjennom portalårer. Hos pattedyr konvergerer årer som forlater tarmen på en primær portalåre som deretter deler seg når den komme...

Blant de faste organene hos mennesker er leveren det eneste organet som er i stand til regenerering1. Dette er kritisk, da leveren er et viktig organ, ansvarlig for viktige metabolske funksjoner, energilagring, blod avgiftning, sekresjon av plasmaproteiner og galleproduksjon2. Hepatocytter tapt på grunn av giftig eller inflammatorisk skade erstattes hovedsakelig via deling av de resterende hepatocyttene1. En klassisk eksperimentell modell for å studere leverregenerering er delvis hepatektomi, hvor individuelle lober i leveren fjernes, slik at de resterende lobene erintakte 3. Denne prosedyren ble opprinnelig utviklet hos rotter, hvor omtrent to tredjedeler av levermassen fjernes. Etter delvis hepatektomi hos pattedyr oppstår kompenserende regenerering i de resterende lobes til leveren gjenoppretter sin opprinnelige masse. Spesielt erstatter pattedyrlever ikke de manglende lobene.
Sebrafisk (Danio rerio) representerer en omsettelig modell for å studere voksen organregenerering4. Sebrafiskleveren, mens den er strukturelt forskjellig fra pattedyrleveren, består av samme celletyper og tjener samme funksjon som hos pattedyr2. Den består av tre lober, med to dorsale lober og en enkelt ventral lobe som er flatt langs tarmen. Delvis hepatektomi har tidligere blitt utført i sebrafisk, med motstridende kontoer om den nøyaktige regenereringsmodusen. Vanligvis utføres en tredjedel delvis hepatektomi ved fjerning av hele ventral lobe. Innledende rapporter indikerte at etter fjerning av ventral lobe, ble den fullstendig regenerert innen en uke5,6,7, noe som tyder på at i motsetning til pattedyrleveren er sebrafiskleveren i stand til epimorfisk regenerering. Etterfølgende studier viste at fjerning av ventral lobe resulterte i kompenserende regenerering i dorsale lober, i stedet for regenerering av den manglende ventral lobe, og til slutt utvinning av levermasse innen en uke8,9. Transkripsjonsprofilering av dorsale lober etter reseksjon av ventral lobe avslørte betydelige endringer forbundet med kompenserende regenerering10. Gitt at modusen for leverregenerering kan variere med skadeomfanget8, spekulerte vi i at avvikene i resultatene kan skyldes teknisk variasjon i den delvise hepatektomiprotokollen mellom forskningsgrupper.
Denne protokollen beskriver en prosedyre for å utføre en tredjedel delvis hepatektomi på voksen sebrafisk ved å fjerne ventral lobe. Denne teknikken vil være verdifull for å vurdere mekanismer for leverregenerering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance</td>
			<td>Bay State Scale &#38; Systems, INC.</td>
			<td>WL-104-1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72997-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Discovery.V8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07CBSM53Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS10X Liquid Conc 4L</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>6505-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Micro Scissors, 3 1/4&#34; straight</td>
			<td>Biomedical Research Instruments</td>
			<td>11-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Syndel</td>
			<td>TRIC-M-GR-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

partial hepatectomy in adult zebrafish

Leversvikt er en av de ledende dødsårsakene over hele verden, og dødeligheten av kronisk leversykdom øker kraftig i USA. Sunn lever er i stand til å regenerere fra giftig skade, men i avansert leversykdom er leverens naturlige evne til å regenerere svekket. Sebrafisk har dukket opp som et kraftig eksperimentelt system for å studere regenerering. De er en ideell modell for å studere leverregenerering fra delvis hepatektomi, en prosedyre med direkte klinisk relevans der en del av leveren er kirurgisk fjernet, slik at resten er intakt. Det finnes ingen standardprotokoll for delvis hepatektomi. tidligere studier med denne modellen har brukt litt forskjellige protokoller og rapportert ulike resultater. Beskrevet her er en effektiv, reproduserbar protokoll for å utføre en delvis hepatektomi hos voksen sebrafisk. Vi bruker denne teknikken for å demonstrere at sebrafisk er i stand til epimorfisk regenerering av den resected lobe. Denne protokollen kan brukes til å forhøre mekanismene som kreves for leverregenerering i sebrafisk ytterligere.

For å undersøke det regenerative potensialet til den voksne sebrafiskleveren, utførte vi delvis hepatektomi (PHX) hos voksen sebrafisk. Generelt ble store voksne (30-40 mm lange) valgt, alt fra 1,5-2,5 år. Innenfor individuelle eksperimenter ble dyr valgt ut fra samme tank, og var alders- og størrelsestilpasset. Som en passende kontroll brukte vi skamoperasjoner der dyret både ble bedøvet og fikk et stort snitt i ventral kroppsvegg, men ble gjenopprettet uten å fjerne noe vev. Overlevelsesraten for sham-kontrolle...

Watch this Scientific Journal Video about Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish at JoVE.com

Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish

Denne protokollen beskriver prosedyren for å fjerne leverens ventrale lobe i voksen sebrafisk for å muliggjøre studiet av leverregenerering.

Delvis Hepatektomi hos voksne sebrafisk

Liver failure is one of the leading causes of death worldwide, and mortality from chronic liver disease is rising sharply in the United States. Healthy ...

Denne protokollen vil tillate forskere å dra nytte av tilgjengelige kjemiske og genetiske verktøy for å studere mekanismene for leverregenerering i sebrafisk. Delvis hepatektomi gjør det mulig for presis fjerning av vev å stimulere leverregenerering uten behov for kroppsomfattende effekter av toksisk leverskade. Bare ved å forstå molekylære og cellulære mekanismer for leverregenerering kan vi designe nye terapier for å behandle pasienter med avansert leversykdom.Til å begynne med, fjern fisken fra Tricaine-tanken ved hjelp av tang og legg dem inn i sporet av en Tricaine gjennomvåt svamp med ventralsiden opp. Plasser deretter svampen under et dissekerende mikroskop med ovenfra og ned belysning. Klem huden og skalerer bare bakre til hjertet med fine tang og lag et hull i kroppshulen ved å lage et kutt under tangene med den fjærbelastede saksen.Roter svampen og lag et tre til fire millimeter snitt langs magen ved å kutte posterialt mot bekkenfinner. Roter deretter svampen tilbake. Klem sidene av svampen med en hånd for å tvinge de viscerale organene ut av kroppshulen.Leverens ventrale lobe er tilstede på toppen av tarmen, og leveren er en rosa eller oransje struktur spredt ut over den gyldne brune tarmen, og kan tydelig visualiseres med CFP fluorescens. Klem de fine tangene slik at tinderne berører hverandre og skyv tinderne mellom leveren og tarmen. Deretter skiller du sakte tines for å bryte portalvenen vedlegg mellom leveren og tarmen.Gjenta denne prosessen til alle portalforbindelsene mellom leveren og tarmen er kuttet, og trekk ventral lobe fra tarmen ved hjelp av fine tang. Klipp ventral lobe fri fra resten av leveren. Undersøkelse av dyret med CFP-fluorescens viser at ventral lobe er fjernet.Når du er ferdig, overfør fisken forsiktig fra svampen til tanken som inneholder systemvann og stream systemvannet over gjellene i noen minutter til fisken gjenoppretter og svømmer alene. Etter euthanizing fisken, fjern den fra isvann. Plasser den i sporet av en svamp med ventralsiden opp og gjør et snitt av den ventrale kroppsveggen i hjertets fremre bakre posisjon.Lag deretter to snitt fra kantene på det første snittet som går langs den fremre bakre aksen til bekkenfinner, og skrell tilbake huden og muskelen for å avsløre de viscerale organene. De viscerale organene kan nå visualiseres med både lyst felt og fluorescensmikroskopi. Levergjenoppretting etter delvis hepatektomi ble estimert ved å beregne forholdet mellom lever og kroppsvekt, som var 1,8% for menn og 3,3% for kvinner.Leveren til kroppsvekt forholdet mellom begge kjønn ble bestemt på post-kirurgi dag null, og dag syv i delvis hepatectomy og sham kontroller. På post-kirurgi dag null, sham dyr har en synlig ventral lobe, men i delvis hepatectomy dyr, ventral lobe var helt fraværende, noe som resulterte i en 30% reduksjon i menn og 20% reduksjon i kvinner i lever til kroppsvekt forhold. På post-kirurgi dag syv i delvis hepatectomy dyr, ventral lobe ble ikke regenerert, og leveren til kroppsvekt forhold i delvis hepatectomy og sham kontroller var sammenlignbare, noe som indikerer gjenvunnet levermasse etter delvis hepatectomy.Effekten av tid på ventral lobe regenerering ble bestemt ved å utføre en full 1/3 delvis hepatektomi og måle ventral lobe til tarmen lengde forholdet. Den ventrale lobe okkuperte 50 til 100% av tarmlengden i sham-kontroller, men ble sterkt redusert hos 1/3 delvis hepatektomi dyr. Delvis hepatektomi dyr på post-kirurgi dag 36 hadde en økt ventral lobe til tarm forhold sammenlignet med post-kirurgi dag én.En statistisk signifikant økt størrelse på ventral lobe ble observert hos dyr som kom seg etter delvis hepatektomi på postkirurgisk dag 36 sammenlignet med dag én, men ikke i sham-kontroller. Noen dyr regenererte ventral lobe, men noen gjorde det ikke, noe som indikerer variasjon i kirurgirespons. Den mest kritiske delen av denne protokollen er å skille leveren og tarmen rent slik at ventral lobe kan fjernes helt.Delvis hepatektomi i sebrafisk kan utføres i mutant eller transgene linjer for å analyse at genetiske krav til leverregenerering.

Research

JoVE Journal

Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo electroporation av Morpholinos til Adult sebrafisk Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo electroporation av Morpholinos i Regenerating Adult sebrafisk Halefinner

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

Blood Collection for biokjemisk analyse i Voksen sebrafisk

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging Adult Sebrafisk

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...