Name: partial hepatectomy in adult zebrafish
Uploaded: 2021-04-04T15:00:00
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I.M.O. é apoiado pela NIAAA (F32AA027135). W.G. é suportado por R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 e pelo Programa Claudia Adams Barr de Excelência em Pesquisa do Câncer. W.G. é um estudioso de Ciências Biomédicas.

Os zebrafish foram criados e criados de acordo com os procedimentos padrão. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Brigham e da Mulher (2016N000405). Os zebrafish adultos foram jejuados por 24 horas antes do início do protocolo. A água do sistema refere-se à água em tanques de carcaça de zebrafish na instalação aquática.
1. Preparação e anestesia
<ol><li>Prepare 0,016% solução tricaine em água do sistema. ATENÇÃO...

<ol>
	<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+liver+regeneration+and+growth+homeostasis.">Principles of liver regeneration and growth homeostasis.</a> Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).</li><li>Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+it+new+again:+insight+into+liver+development,+regeneration,+and+disease+from+zebrafish+research.">Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).</li><li>Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+biological+and+pathological+mechanisms+and+implications.">Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications.</a> Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).</li><li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration.">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).</li><li>Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+growth+in+the+embryo+and+during+liver+regeneration+in+zebrafish+requires+the+cell+cycle+regulator+uhrf1.">Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).</li><li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development.">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).</li><li>Dovey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+II+is+required+for+embryonic+development+and+liver+regeneration+in+zebrafish.">Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).</li><li>Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+growth+mechanisms+regulated+by+BMP+and+FGF+signaling+mediate+liver+regeneration+in+zebrafish+after+partial+hepatectomy.">Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy.</a> The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).</li><li>Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficiency+of+Def+activates+p53-dependent+TGF&#946;+signalling+and+causes+scar+formation+after+partial+hepatectomy.">Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGF&#946; signalling and causes scar formation after partial hepatectomy.</a> PLoS One. 9, (2014).</li><li>Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+characterization+of+the+dorsal+lobes+after+hepatectomy+of+the+ventral+lobe+in+zebrafish.">Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish.</a> BMC Genomics. 16, 979 (2015).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).</li><li>Grisham, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizational+principles+of+the+liver.">Organizational principles of the liver.</a> The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).</li></ol>

As diferenças anatômicas entre zebrafish e modelos mamíferos para regeneração hepática apresentam desafios únicos à ressecção hepática. O fígado em zebrafish está próximo do coração e do intestino; inadvertidamente danificar qualquer órgão resulta em aumento da mortalidade. O fígado de zebrafish não é encapsulado, tornando mais difícil separar-se do intestino. O fígado recebe sangue rico em nutrientes do intestino através de veias portal. Nos mamíferos, veias que saem do intestino convergem em um...

Entre os órgãos sólidos em humanos, o fígado é o único órgão capaz de regenerar1. Isso é crítico, pois o fígado é um órgão essencial, responsável pelas principais funções metabólicas, armazenamento de energia, desintoxicação sanguínea, secreção de proteínas plasmáticas e produção de bile2. Hepatócitos perdidos devido a danos tóxicos ou inflamatórios são substituídos principalmente por divisão dos hepatócitos restantes1. Um modelo experimental clássico para estudar a regeneração hepática é a hepatectomia parcial, onde os lobos individuais do fígado são removidos, deixando os lóbulos restantes intactos3. Este procedimento foi inicialmente desenvolvido em ratos, nos quais aproximadamente dois terços da massa hepática é removida. Após hepatectomia parcial em mamíferos, a regeneração compensatória ocorre nos lóbulos restantes até que o fígado recupere sua massa inicial. Notavelmente, o fígado mamífero não substitui os lóbulos perdidos.
O zebrafish (Danio rerio) representa um modelo tratável para estudar a regeneração de órgãosadultos 4. O fígado de zebrafish, embora estruturalmente diferente do fígado mamífero, é composto pelos mesmos tipos de células e serve a mesma função dos mamíferos2. É composto por três lóbulos, com dois lobos dorsais e um único lobo ventral que são achatados ao longo do intestino. A hepatectomia parcial já foi realizada anteriormente em zebrafish, com relatos conflitantes quanto ao modo preciso de regeneração. Normalmente, uma hepatectomia parcial de um terço é realizada pela remoção de todo o lobo ventral. Relatórios iniciais indicaram que, após a remoção do lobo ventral, ele foi totalmente regenerado dentro de uma semana5,6,7, sugerindo que, em contraste com o fígado mamífero, o fígado de zebrafish é capaz de regeneração epimórfica. Estudos subsequentes demonstraram que a remoção do lobo ventral resultou em regeneração compensatória nos lobos dorsais, em vez da regeneração do lobo ventral perdido, e, finalmente, a recuperação da massa hepática dentro de uma semana8,9. O perfil transcriômico dos lobos dorsais após a ressecção do lobo ventral revelou alterações significativas associadas à regeneração compensatória10. Dado que o modo de regeneração hepática pode variar com a extensão da lesão8,especulamos que as discrepâncias nos resultados podem ser devido à variação técnica no protocolo de hepatectomia parcial entre grupos de pesquisa.
Este protocolo descreve um procedimento para a realização de uma hepatectomia parcial de um terço em zebrafish adulto, removendo o lobo ventral. Esta técnica será valiosa para avaliar mecanismos de regeneração hepática.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance</td>
			<td>Bay State Scale &#38; Systems, INC.</td>
			<td>WL-104-1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72997-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Discovery.V8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07CBSM53Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS10X Liquid Conc 4L</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>6505-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Micro Scissors, 3 1/4&#34; straight</td>
			<td>Biomedical Research Instruments</td>
			<td>11-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Syndel</td>
			<td>TRIC-M-GR-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

partial hepatectomy in adult zebrafish

A insuficiência hepática é uma das principais causas de morte em todo o mundo, e a mortalidade por doença hepática crônica está aumentando acentuadamente nos Estados Unidos. Fígados saudáveis são capazes de se regenerar de danos tóxicos, mas em doença hepática avançada, a capacidade natural do fígado de se regenerar é prejudicada. Os zebrafish emergiram como um poderoso sistema experimental para estudar a regeneração. São um modelo ideal para estudar a regeneração hepática a partir da hepatectomia parcial, procedimento com relevância clínica direta em que parte do fígado é removida cirurgicamente, deixando o resto intacto. Não há protocolo padrão para hepatectomia parcial; estudos anteriores utilizando este modelo têm usado protocolos ligeiramente diferentes e relatado resultados diferentes. Descrito aqui é um protocolo eficiente e reprodutível para a realização de uma hepatectomia parcial em zebrafish adulto. Usamos esta técnica para demonstrar que os zebrafish são capazes de regeneração epimórfica do lobo ressecado. Este protocolo pode ser usado para interrogar ainda mais os mecanismos necessários para a regeneração hepática em zebrafish.

Para examinar o potencial regenerativo do fígado de zebrafish adulto, realizamos hepatectomia parcial (PHX) em zebrafish adulto. Em geral, foram selecionados adultos grandes (30-40 mm de comprimento), variando de 1,5 a 2,5 anos. Dentro de experimentos individuais, os animais foram selecionados do mesmo tanque, e tinham idade e tamanho compatível. Como controle adequado, utilizamos cirurgias falsas nas quais o animal foi anestesiado e recebeu uma grande incisão na parede do corpo ventral, mas foi recuperado sem remover...

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Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish

Este protocolo descreve o procedimento para remover o lobo ventral do fígado em zebrafish adulto para permitir o estudo da regeneração hepática.

Hepatectomia Parcial em Zebrafish Adulto

Liver failure is one of the leading causes of death worldwide, and mortality from chronic liver disease is rising sharply in the United States. Healthy ...

Este protocolo permitirá que os pesquisadores aproveitem as ferramentas químicas e genéticas disponíveis para estudar os mecanismos de regeneração hepática em zebrafish. A hepatectomia parcial permite a remoção precisa do tecido para estimular a regeneração hepática sem a necessidade dos efeitos em todo o corpo da lesão hepática tóxica. Somente entendendo os mecanismos moleculares e celulares da regeneração hepática podemos projetar novas terapias para tratar pacientes com doença hepática avançada.Para começar, remova o peixe do tanque tricaine usando fórceps e incorpore-os no sulco de uma esponja encharcada de Tricaine com o lado ventral para cima. Em seguida, coloque a esponja sob um microscópio dissecando com iluminação de cima para baixo. Aperte a pele e escamas apenas posteriormente ao coração com fórceps finos e crie um buraco na cavidade corporal fazendo um corte sob os fórceps com a tesoura carregada de mola.Gire a esponja e faça uma incisão de três a quatro milímetros ao longo do abdômen cortando posterialmente em direção às barbatanas pélvicas. Então gire a esponja de volta. Aperte os lados da esponja com uma mão para forçar os órgãos viscerais a saírem da cavidade corporal.O lobo ventral do fígado está presente em cima do intestino, e o fígado é uma estrutura rosa ou laranja espalhada sobre o intestino marrom dourado, e pode ser claramente visualizada com fluorescência CFP. Aperte os fórceps finos para que as latas se toquem e deslizem as latas entre o fígado e o intestino. Em seguida, separe lentamente as latas para quebrar os laços da veia portal entre o fígado e o intestino.Repita este processo até que todas as conexões do portal entre o fígado e o intestino tenham sido cortadas, e puxe o lobo ventral do intestino usando fórceps finos. Corte o lobo ventral livre do resto do fígado. O exame do animal com fluorescência cfp demonstra que o lobo ventral foi removido.Quando terminar, transfira cuidadosamente o peixe da esponja para o tanque contendo água do sistema e flua a água do sistema sobre as brânquias por alguns minutos até que o peixe se recupere e nade por conta própria. Depois de eutanásia do peixe, remova-o da água gelada. Coloque-a no sulco de uma esponja com o lado ventral para cima e faça uma incisão da parede do corpo ventral na posição posterior anterior do coração.Em seguida, faça mais duas incisões das bordas da primeira incisão que correm ao longo do eixo posterior anterior até as barbatanas pélvicas, e retire a pele e o músculo para revelar os órgãos viscerais. Os órgãos viscerais agora podem ser visualizados com microscopia de campo brilhante e fluorescência. A recuperação hepática após hepatectomia parcial foi estimada pelo cálculo da relação peso hepático/corporal, que foi de 1,8% para os homens e 3,3% para as mulheres.A relação peso hepático/corporal de ambos os sexos foi determinada no dia zero pós-cirurgia, e no sétimo dia em hepatectomia parcial e controles falsos. No dia zero pós-cirurgia, os animais falsos têm um lobo ventral visível, mas em animais de hepatectomia parcial, o lobo ventral estava completamente ausente, o que resultou em uma redução de 30% no sexo masculino e redução de 20% nas proporções de peso hepático/corporal. No sétimo dia de cirurgia em animais de hepatectomia parcial, o lobo ventral não foi regenerado, e as relações hepáticos e de peso corporal em hepatectomia parcial e controles falsos foram comparáveis, indicando a recuperação da massa hepática após hepatectomia parcial.O efeito do tempo na regeneração do lobo ventral foi determinado pela realização de uma hepatectomia parcial de 1/3 e medição do lobo ventral à razão do comprimento do intestino. O lobo ventral ocupou de 50 a 100% do comprimento do intestino em controles falsos, mas foi severamente reduzido em animais de hepatectomia parcial de 1/3. Os animais parciais de hepatectomia no dia 36 pós-cirurgia apresentaram maior relação ventral ao intestino em comparação com o primeiro dia pós-cirurgia.Observou-se aumento estatisticamente significativo do lóbulo ventral em animais que se recuperam de hepatectomia parcial no dia 36 pós-cirurgia em comparação com o primeiro dia, mas não em controles falsos. Alguns animais regeneraram o lobo ventral, mas outros não, indicando variação na resposta à cirurgia. A parte mais crítica deste protocolo é separar o fígado e o intestino para que o lobo ventral possa ser totalmente removido.Hepatectomia parcial em zebrafish pode ser realizada em linhas mutantes ou transgênicas para avaliar os requisitos genéticos para a regeneração hepática.

Research

JoVE Journal

Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Transplante de Medula Renal inteiro em Zebrafish Adulto

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Biologia

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Retro-orbital de injeção no Zebrafish Adulto

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Dissecção de Órgãos do Zebrafish Adulto

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Injeção intraperitoneal em Zebrafish Adulto

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Dissecção do rim Zebrafish Adulto

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Dissecção do coração em larval, Zebrafish Juvenil e Adulto, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Em Eletroporação vivo de Morpholinos na Retina Zebrafish Adulto

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Na eletroporação in vivo de Morpholinos no Adulto Regeneração Zebrafish Cauda Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

Coleta de sangue para análise bioquímica em Zebrafish Adulto

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging Zebrafish Adulto

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...