Name: partial hepatectomy in adult zebrafish
Uploaded: 2021-04-04T15:00:00
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I.M.O. es compatible con el NIAAA (F32AA027135). W.G. cuenta con el apoyo de R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 y el Programa Claudia Adams Barr para la Excelencia en la Investigación del Cáncer. W.G. es un Pew Scholar en Ciencias Biomédicas.

Los peces cebra fueron criados y criados de acuerdo con los procedimientos estándar. Los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Brigham and Women's Hospital (2016N000405). El pez cebra adulto fue ayunado durante 24 h antes del inicio del protocolo. El agua del sistema se refiere al agua en los tanques de alojamiento de pez cebra en la instalación acuática.
1. Preparación y anestesia
<ol><li>Preparar solución Tricaine al 0,016% en agua...

<ol>
	<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+liver+regeneration+and+growth+homeostasis.">Principles of liver regeneration and growth homeostasis.</a> Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).</li><li>Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+it+new+again:+insight+into+liver+development,+regeneration,+and+disease+from+zebrafish+research.">Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).</li><li>Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+biological+and+pathological+mechanisms+and+implications.">Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications.</a> Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).</li><li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration.">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).</li><li>Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+growth+in+the+embryo+and+during+liver+regeneration+in+zebrafish+requires+the+cell+cycle+regulator+uhrf1.">Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).</li><li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development.">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).</li><li>Dovey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+II+is+required+for+embryonic+development+and+liver+regeneration+in+zebrafish.">Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).</li><li>Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+growth+mechanisms+regulated+by+BMP+and+FGF+signaling+mediate+liver+regeneration+in+zebrafish+after+partial+hepatectomy.">Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy.</a> The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).</li><li>Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficiency+of+Def+activates+p53-dependent+TGF&#946;+signalling+and+causes+scar+formation+after+partial+hepatectomy.">Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGF&#946; signalling and causes scar formation after partial hepatectomy.</a> PLoS One. 9, (2014).</li><li>Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+characterization+of+the+dorsal+lobes+after+hepatectomy+of+the+ventral+lobe+in+zebrafish.">Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish.</a> BMC Genomics. 16, 979 (2015).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).</li><li>Grisham, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizational+principles+of+the+liver.">Organizational principles of the liver.</a> The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).</li></ol>

Las diferencias anatómicas entre el pez cebra y los modelos de mamíferos para la regeneración hepática presentan desafíos únicos para la resección hepática. El hígado en el pez cebra está muy cerca del corazón y el intestino; inadvertidamente dañando cualquier órgano da lugar a mortalidad creciente. El hígado del pez cebra no está encapsulado, por lo que es más difícil separarse del intestino. El hígado recibe sangre rica en nutrientes del intestino a través de las venas porta. En los mamíferos, las v...

Entre los órganos sólidos en los seres humanos, el hígado es el único órgano capaz de regeneración1. Esto es crítico, ya que el hígado es un órgano esencial, responsable de las funciones metabólicas clave, el almacenamiento de energía, la desintoxicación de la sangre, la secreción de proteínas plasmáticas y la producciónde bilis 2. Los hepatocitos perdidos debido a daños tóxicos o inflamatorios se reemplazan principalmente a través de la división de los hepatocitos restantes1. Un modelo experimental clásico para estudiar la regeneración hepática es la hepatectomía parcial, donde se extirpan los lóbulos individuales del hígado, dejando intactos los lóbulos restantes3. Este procedimiento se desarrolló inicialmente en ratas, en las que se eliminan aproximadamente dos tercios de la masa hepática. Después de la hepatectomía parcial en mamíferos, la regeneración compensatoria se produce en los lóbulos restantes hasta que el hígado recupera su masa inicial. En particular, el hígado de los mamíferos no reemplaza los lóbulos que faltan.
El pez cebra(Danio rerio)representa un modelo manejable para el estudio de la regeneración de órganos adultos4. El hígado del pez cebra, aunque estructuralmente diferente del hígado de los mamíferos, está formado por los mismos tipos de células y cumple la misma función que en los mamíferos2. Se compone de tres lóbulos, con dos lóbulos dorsales y un solo lóbulo ventral que se aplanan a lo largo del intestino. Hepatectomy parcial se ha realizado previamente en el pez cebra, con cuentas contradictorias en cuanto al modo exacto de regeneración. Por lo general, una hepatectomía parcial de un tercio se realiza mediante la extirpación de todo el lóbulo ventral. Los informes iniciales indicaron que después de la eliminación del lóbulo ventral, se regeneró completamente dentro de una semana5,6,7,lo que sugiere que en contraste con el hígado de mamífero, el hígado de pez cebra es capaz de regeneración epimórfica. Estudios posteriores demostraron que la eliminación del lóbulo ventral dio lugar a la regeneración compensatoria en los lóbulos dorsales, en lugar de la regeneración del lóbulo ventral faltante, y en última instancia la recuperación de la masa hepática en el plazo de una semana8,9. El perfil transcriptómico de los lóbulos dorsales después de la resección del lóbulo ventral reveló cambios significativos asociados a la regeneración compensatoria10. Dado que el modo de regeneración hepática puede variar con la extensión de la lesión8,especulamos que las discrepancias en los resultados pueden deberse a la variación técnica en el protocolo de hepatectomía parcial entre los grupos de investigación.
Este protocolo describe un procedimiento para realizar un tercio de hepatectomía parcial en el pez cebra adulto mediante la eliminación del lóbulo ventral. Esta técnica será valiosa para evaluar los mecanismos de regeneración hepática.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance</td>
			<td>Bay State Scale &#38; Systems, INC.</td>
			<td>WL-104-1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72997-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Discovery.V8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07CBSM53Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS10X Liquid Conc 4L</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>6505-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Micro Scissors, 3 1/4&#34; straight</td>
			<td>Biomedical Research Instruments</td>
			<td>11-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Syndel</td>
			<td>TRIC-M-GR-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

partial hepatectomy in adult zebrafish

La insuficiencia hepática es una de las principales causas de muerte en todo el mundo, y la mortalidad por enfermedad hepática crónica está aumentando bruscamente en los Estados Unidos. Los hígados sanos son capaces de regenerarse a partir de daños tóxicos, pero en la enfermedad hepática avanzada, la capacidad natural del hígado para regenerarse se ve afectada. El pez cebra ha surgido como un poderoso sistema experimental para estudiar la regeneración. Son un modelo ideal para estudiar la regeneración hepática a partir de la hepatectomía parcial, un procedimiento con relevancia clínica directa en el que se extirpa quirúrgicamente parte del hígado, dejando el resto intacto. No existe un protocolo estándar para la hepatectomía parcial; los estudios anteriores que utilizaron este modelo han utilizado protocolos ligeramente diferentes y han reportado resultados dispares. Aquí se describe un protocolo eficiente y reproducible para realizar una hepatectomía parcial en peces cebra adultos. Utilizamos esta técnica para demostrar que los peces cebra son capaces de regeneración epimórfica del lóbulo resecado. Este protocolo se puede utilizar para interrogar más lejos los mecanismos requeridos para la regeneración del hígado en el pez cebra.

Con el fin de examinar el potencial regenerativo del hígado de pez cebra adulto, se realizó hepatectomía parcial (PHX) en el pez cebra adulto. En general, se seleccionaron adultos grandes (30-40 mm de longitud), variando de 1,5-2,5 años. Dentro de los experimentos individuales, los animales fueron seleccionados del mismo tanque, y fueron igualados por edad y tamaño. Como control apropiado, utilizamos las cirugías falsas en las cuales anestesiaron y recibieron al animal una incisión grande en la pared ventral del c...

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Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish

Este protocolo describe el procedimiento para eliminar el lóbulo ventral del hígado en el pez cebra adulto para permitir el estudio de la regeneración hepática.

Hepatectomía parcial en pez cebra adulto

Liver failure is one of the leading causes of death worldwide, and mortality from chronic liver disease is rising sharply in the United States. Healthy ...

Este protocolo permitirá a los investigadores aprovechar las herramientas químicas y genéticas disponibles para estudiar los mecanismos de regeneración hepática en el pez cebra. Hepatectomy parcial permite el retiro exacto del tejido para estimular la regeneración del hígado sin la necesidad de los efectos cuerpo-anchos de lesión del higado tóxica. Solamente entendiendo los mecanismos moleculares y celulares de la regeneración del hígado podemos diseñar nuevas terapias para tratar a pacientes con enfermedad del higado avanzada.Para comenzar, retire los peces del tanque Tricaine usando pezórceps e incorpórelos en el surco de una esponja empapada de Tricaine con el lado ventral hacia arriba. Luego coloque la esponja bajo un microscopio de disección con iluminación de arriba hacia abajo. Pellizque la piel y las escamas justo después del corazón con pinzas finas y cree un agujero en la cavidad corporal haciendo un corte debajo de las pinzas con la tijera cargada de resorte.Gire la esponja y haga una incisión de tres a cuatro milímetros a lo largo del abdomen cortando posterialmente hacia las aletas pélvicas. A continuación, gire la esponja hacia atrás. Apriete los lados de la esponja con una mano para forzar los órganos viscerales a salir de la cavidad corporal.El lóbulo ventral del hígado está presente en la parte superior del intestino, y el hígado es una estructura rosada o naranja extendida sobre el intestino marrón dorado, y se puede visualizar claramente con fluorescencia CFP. Apriete las esobrtesis finas para que los dientes se toquen entre sí y deslice los dientes entre el hígado y el intestino. Luego, separe lentamente los dientes para romper los accesorios de la vena porta entre el hígado y el intestino.Repita este proceso hasta que se hayan cortado todas las conexiones portales entre el hígado y el intestino, y tire del lóbulo ventral del intestino usando pórceps finos. Corte el lóbulo ventral libre del resto del hígado. La examinación del animal con fluorescencia de la PPC demuestra que el lóbulo ventral se ha quitado.Cuando termine, transfiera cuidadosamente el pez de la esponja al tanque que contiene agua del sistema y transmita el agua del sistema sobre las branquias durante unos minutos hasta que el pez se recupere y nade por sí solo. Después de la eutanasia de los peces, retírelo del agua helada. Colóquelo en el surco de una esponja con el lado ventral hacia arriba y haga una incisión de la pared del cuerpo ventral en la posición posterior anterior del corazón.Luego haga dos incisiones más desde los bordes de la primera incisión que se ejecutan a lo largo del eje posterior anterior hasta las aletas pélvicas, y desprenda la piel y el músculo para revelar los órganos viscerales. Los órganos viscerales ahora se pueden visualizar con microscopía de campo brillante y fluorescencia. La recuperación del hígado después del hepatectomy parcial fue estimada calculando el ratio del hígado al peso corporal, que era 1,8% para los varones y 3,3% para las hembras.El hígado al ratio del peso corporal de ambos sexos fue determinado en el día cero de la poste-cirugía, y el día siete en controles hepatectomy y del impostor parciales. En el día cero de la poste-cirugía, los animales ficticios tienen un lóbulo ventral visible, pero en animales hepatectomy parciales, el lóbulo ventral estaba totalmente ausente, que dio lugar a una reducción del 30% en varones y a una reducción del 20% en hembras del hígado a los ratios del peso corporal. En el día siete de la poste-cirugía en animales hepatectomy parciales, el lóbulo ventral no fue regenerado, y el hígado a los ratios del peso corporal en controles hepatectomy y del impostor parciales era comparable, indicando la masa recuperada del hígado después de hepatectomy parcial.El efecto del tiempo sobre la regeneración del lóbulo ventral fue determinado realizando un hepatectomy parcial completo 1/3 y midiendo el lóbulo ventral al ratio de la longitud del intestino. El lóbulo ventral ocupó 50 a el 100% de la longitud del intestino en controles del impostor, pero fue reducido seriamente en animales hepatectomy parciales del 1/3. Los animales hepatectomy parciales en el día 36 de la poste-cirugía tenían un cociente ventral creciente del lóbulo a del intestino con respecto al día uno de la poste-cirugía.Un tamaño creciente estadístico significativo del lóbulo ventral fue observado en los animales que se recuperaban de hepatectomy parcial en el día 36 de la poste-cirugía con respecto al día uno, pero no en controles del impostor. Algunos animales regeneraron el lóbulo ventral, pero otros no, lo que indica una variación en la respuesta a la cirugía. La parte más crítica de este protocolo es separar limpiamente el hígado y el intestino para que el lóbulo ventral se pueda quitar totalmente.La hepatectomía parcial en pez cebra se puede realizar en líneas mutantes o transgénicas para probar que los requisitos genéticos para la regeneración hepática.

Research

JoVE Journal

Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

El trasplante de médula del riñón entero en adultos de pez cebra

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Investigación

Biología

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Retro-orbital de inyección en adultos de pez cebra

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

La disección de los órganos del pez cebra adultos

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Inyección intraperitoneal en adultos de pez cebra

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

La disección del riñón adultos de pez cebra

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

La disección del corazón en las larvas, juveniles y adultos de pez cebra, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

En electroporación in vivo de Morpholinos en la retina de pez cebra adultos

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

En electroporación in vivo de Morpholinos en la regeneración de adultos de pez cebra Aleta de cola

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

Extracción de sangre para análisis bioquímicos en adultos de pez cebra

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavage adultos de pez cebra

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...