Name: partial hepatectomy in adult zebrafish
Uploaded: 2021-04-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish at JoVE.com

I.M.O. stöds av NIAAA (F32AA027135). W.G. stöds av R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 och Claudia Adams Barr Program for Excellence in Cancer Research. W.G. är en Pew Scholar i biomedicinska vetenskaper.

Zebrafisk höjdes och uppföddes enligt standardprocedurer. Experimenten godkändes av Brigham and Women's Hospital's Institutional Animal Care and Use Committee (2016N000405). Vuxna zebrafiskar fastades i 24 h innan protokollet började. Systemvatten avser vattnet i zebrafiskhustankar i vattenanläggningen.
1. Förberedelse och bedövning
<ol><li>Förbered 0,016% Tricaine-lösning i systemvatten. VARNING: Tricaine är irriterande om det kommer i kontakt med ögon, hud eller andningsorgan...

<ol>
	<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+liver+regeneration+and+growth+homeostasis.">Principles of liver regeneration and growth homeostasis.</a> Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).</li><li>Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+it+new+again:+insight+into+liver+development,+regeneration,+and+disease+from+zebrafish+research.">Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).</li><li>Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+biological+and+pathological+mechanisms+and+implications.">Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications.</a> Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).</li><li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration.">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).</li><li>Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+growth+in+the+embryo+and+during+liver+regeneration+in+zebrafish+requires+the+cell+cycle+regulator+uhrf1.">Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).</li><li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development.">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).</li><li>Dovey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+II+is+required+for+embryonic+development+and+liver+regeneration+in+zebrafish.">Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).</li><li>Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+growth+mechanisms+regulated+by+BMP+and+FGF+signaling+mediate+liver+regeneration+in+zebrafish+after+partial+hepatectomy.">Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy.</a> The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).</li><li>Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficiency+of+Def+activates+p53-dependent+TGF&#946;+signalling+and+causes+scar+formation+after+partial+hepatectomy.">Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGF&#946; signalling and causes scar formation after partial hepatectomy.</a> PLoS One. 9, (2014).</li><li>Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+characterization+of+the+dorsal+lobes+after+hepatectomy+of+the+ventral+lobe+in+zebrafish.">Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish.</a> BMC Genomics. 16, 979 (2015).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).</li><li>Grisham, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizational+principles+of+the+liver.">Organizational principles of the liver.</a> The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).</li></ol>

De anatomiska skillnaderna mellan zebrafisk och däggdjursmodeller för leverregenerering utgör unika utmaningar för leverresektion. Levern i zebrafisk är i närheten av hjärtat och tarmarna; oavsiktligt skada något av organen resulterar i ökad dödlighet. Zebrafisklever är inte inkapslad, vilket gör det svårare att separera från tarmarna. Levern får näringsrikt blod från tarmarna genom portalvener. Hos däggdjur konvergerar vener som lämnar tarmarna på en primär portalven som sedan delas när den kommer ...

Bland de fasta organen hos människor är levern det enda organet som kan regenerering1. Detta är kritiskt, eftersom levern är ett viktigt organ, ansvarigt för viktiga metaboliska funktioner, energilagring, blod avgiftning, utsöndring av plasmaproteiner och gallproduktion2. Hepatocyter som förlorats på grund av toxiska eller inflammatoriska skador ersätts främst via delning av de återstående hepatocyterna1. En klassisk experimentell modell för att studera leverregenerering är partiell hepatektomi, där enskilda lober i levern avlägsnas, vilket lämnar de återstående lobernaintakta 3. Detta förfarande utvecklades ursprungligen hos råttor, där ungefär två tredjedelar av levermassan avlägsnas. Efter partiell hepatektomi hos däggdjur sker kompensatorisk regenerering i de återstående loberna tills levern återhämtar sin ursprungliga massa. Särskilt ersätter däggdjurslever inte de saknade loberna.
Zebrafisk (Danio rerio) representerar en dragbar modell för studier av vuxen organregenerering4. Zebrafisklever, även om den strukturellt skiljer sig från däggdjurslever, består av samma celltyper och tjänar samma funktion som hos däggdjur2. Den består av tre lober, med två dorsala lober och en enda ventral lob som plattas ut längs tarmarna. Partiell hepatectomy har tidigare utförts i zebrafisk, med motstridiga konton om det exakta läget för regenerering. Vanligtvis utförs en tredjedel partiell hepatectomy genom avlägsnande av hela ventrala caudaben. De första rapporterna visade att efter avlägsnandet av ventralloben regenererades den helt inom en vecka5,6,7, vilket tyder på att zebrafisklever i motsats till däggdjurslever kan epimorfa regenerering. Efterföljande studier visade att avlägsnande av ventrala caudaben resulterade i kompensatorisk regenerering i dorsala lober, snarare än regenerering av den saknade ventrala lob, och slutligen återhämtning av levermassa inom en vecka8,9. Transkriptomisk profilering av dorsala lober efter samband av ventrala caudaben visade betydande förändringar i samband med kompensatoriska regenerering10. Med tanke på att leverregenereringssättet kan variera med skadans omfattning8, spekulerade vi att skillnaderna i resultat kan bero på teknisk variation i det partiella hepatektomiprotokollet mellan forskargrupper.
Detta protokoll beskriver en procedur för att utföra en tredjedel partiell hepatectomy på vuxna zebrafish genom att ta bort ventrala caudaben. Denna teknik kommer att vara värdefull för att bedöma mekanismer för leverregenerering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance</td>
			<td>Bay State Scale &#38; Systems, INC.</td>
			<td>WL-104-1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72997-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Discovery.V8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07CBSM53Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS10X Liquid Conc 4L</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>6505-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Micro Scissors, 3 1/4&#34; straight</td>
			<td>Biomedical Research Instruments</td>
			<td>11-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Syndel</td>
			<td>TRIC-M-GR-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

partial hepatectomy in adult zebrafish

Leversvikt är en av de främsta dödsorsakerna i världen, och dödligheten från kronisk leversjukdom ökar kraftigt i USA. Friska lever kan regenerera från toxiska skador, men vid avancerad leversjukdom försämras leverns naturliga förmåga att regenerera. Zebrafisk har dykt upp som ett kraftfullt experimentellt system för att studera regenerering. De är en idealisk modell för att studera leverregenerering från partiell hepatektomi, ett förfarande med direkt klinisk relevans där en del av levern avlägsnas kirurgiskt, vilket lämnar resten intakt. det finns inget standardprotokoll för partiell hepatectomy; tidigare studier med denna modell har använt något olika protokoll och rapporterat olika resultat. Beskrivs här är ett effektivt, reproducerbart protokoll för att utföra en partiell hepatectomy i vuxna zebrafisk. Vi använder denna teknik för att visa att zebrafisk kan epimorfa regenerering av den resected lob. Detta protokoll kan användas för att ytterligare förhöra de mekanismer som krävs för leverregenerering hos zebrafisk.

För att undersöka den regenerativa potentialen hos den vuxna zebrafisklever utförde vi partiell hepatektomi (PHX) hos vuxna zebrafiskar. I allmänhet valdes stora vuxna (30-40 mm i längd) från 1,5-2,5 år. Inom enskilda experiment valdes djur från samma tank och var ålders- och storleksmatchade. Som en lämplig kontroll använde vi falska operationer där djuret både bedövades och fick ett stort snitt i ventral kroppsväggen men återhämtades utan att ta bort någon vävnad. Överlevnaden för falska kontroller...

Watch this Scientific Journal Video about Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish at JoVE.com

Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish

Detta protokoll beskriver förfarandet för att ta bort ventrala lob i levern i vuxna zebrafisk för att möjliggöra studier av lever regenerering.

Partiell hepatektomi hos vuxna zebrafiskar

Liver failure is one of the leading causes of death worldwide, and mortality from chronic liver disease is rising sharply in the United States. Healthy ...

Detta protokoll kommer att göra det möjligt för forskare att dra nytta av tillgängliga kemiska och genetiska verktyg för att studera mekanismerna för leverregenerering hos zebrafisk. Partiell hepatektomi gör det möjligt att exakt ta bort vävnad för att stimulera leverregenerering utan behov av kroppsomfattande effekter av toxisk leverskada. Endast genom att förstå de molekylära och cellulära mekanismerna för leverregenerering kan vi utforma nya terapier för att behandla patienter med avancerad leversjukdom.För att börja, ta bort fisken från Tricaine-tanken med tång och bädda in dem i spåret av en Tricaine blötsvamp med ventralsidan upp. Placera sedan svampen under ett dissekerande mikroskop med uppifrån och ner-belysning. Nyp ihop huden och fjällen precis bakom hjärtat med fina tångar och skapa ett hål i kroppshålan genom att göra ett snitt under tången med den fjäderbelastade saxen.Rotera svampen och gör ett snitt på tre till fyra millimeter längs buken genom att skära posterialt mot bäckenfenorna. Vrid sedan tillbaka svampen. Pressa svampens sidor med en hand för att tvinga ut de viscerala organen ur kroppshålan.Leverns ventrala lob finns ovanpå tarmarna, och levern är en rosa eller orange struktur spridd över den gyllene bruna tarmen och kan tydligt visualiseras med CFP fluorescens. Pressa de fina tångarna så att pinnarna rör vid varandra och skjut pinnarna mellan levern och tarmarna. Separera sedan långsamt pinnarna för att bryta portalens ventillbehör mellan levern och tarmarna.Upprepa denna process tills alla portalanslutningar mellan lever och tarm har brutits och dra ventralloben från tarmarna med fina tångar. Skär ventralloben fri från resten av levern. Undersökning av djuret med CFP fluorescens visar att ventrala caudaben har tagits bort.När den är klar överför du försiktigt fisken från svampen till tanken som innehåller systemvatten och strömmar systemvattnet över gälarna i några minuter tills fisken återhämtar sig och simmar på egen hand. Efter att ha avlivat fisken, ta bort den från isvatten. Placera den i spåret av en svamp med ventralsidan uppåt och gör ett snitt av den ventrala kroppsväggen i hjärtats främre bakre position.Gör sedan ytterligare två snitt från kanterna på det första snittet som löper längs den främre bakre axeln till bäckenfenorna och skala tillbaka huden och muskeln för att avslöja de viscerala organen. Viscerala organ kan nu visualiseras med både ljus fält och fluorescensmikroskopi. Lever återhämtning efter partiell hepatectomy uppskattades genom att beräkna lever till kroppsvikt förhållandet, som var 1,8%för män och 3,3%för kvinnor.Lever till kroppsvikt förhållandet mellan båda könen fastställdes vid dag noll efter kirurgi och dag sju i partiell hepatectomy och sham kontroller. Vid dag noll efter operationen har falska djur en synlig ventral lob, men i partiell hepatektomi djur var ventrala lob helt frånvarande, vilket resulterade i en 30%minskning av män och 20%minskning av kvinnor av lever till kroppsvikt förhållanden. Vid post-surgery dag sju i partiell hepatectomy djur, ventrala caudat var inte regenereras, och lever till kroppsvikt förhållanden i partiell hepatectomy och sham kontroller var jämförbara, vilket indikerar återvunna lever massa efter partiell hepatectomy.Effekten av tiden på ventrala lob regenerering fastställdes genom att utföra en fullständig 1/3 partiell hepatectomy och mäta ventrala lob till tarm längd förhållandet. Ventrala caudaben upptog 50 till 100%av tarmlängden i falska kontroller, men minskades kraftigt i 1/3 partiella hepatectomy djur. Partiell hepatectomy djur vid post-surgery dag 36 hade en ökad ventrala caudat från tarmförhållande jämfört med post-surgery dag ett.En statistiskt signifikant ökad storlek på ventrala caudaben observerades hos djur som återhämtade sig från partiell hepatektomi vid postkirurgi dag 36 jämfört med dag ett, men inte i falska kontroller. Vissa djur regenererade ventrala lob, men vissa gjorde det inte, vilket indikerar variation i kirurgi svar. Den mest kritiska delen av detta protokoll är att rent separera levern och tarmarna så att ventralloben kan avlägsnas helt.Partiell hepatektomi hos zebrafisk kan utföras i mutanta eller transgena linjer för att analysera att genetiska krav för leverregenerering.

Research

JoVE Journal

Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Transplantation av hela Njure Marrow i vuxen Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Retro-orbital injektionsvätska till vuxna Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Dissektion av organ från vuxna Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Intraperitoneal injektion i vuxen Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Dissekering av vuxna Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Hjärta Dissection i Larvernas, unga och vuxna Zebrafish, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo elektroporering av Morpholinos i Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Elektroporering av Morpholinos i Regenerating Adult Zebrafish stjärtfenan

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

Blodinsamling för biokemisk analys i vuxen Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging vuxna zebrafisk

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...