Name: partial hepatectomy in adult zebrafish
Uploaded: 2021-04-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish at JoVE.com

I.M.O. NIAAA (F32AA027135) tarafından desteklenir. W.G., R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 ve Claudia Adams Barr Kanser Araştırmalarında Mükemmellik Programı tarafından desteklenmektedir. W.G. Biyomedikal Bilimler alanında bir Pew Bursiyeridir.

Zebra balıkları standart prosedürlere göre yetiştirildi ve yetiştirildi. Deneyler Brigham ve Kadın Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (2016N000405) tarafından onaylandı. Yetişkin zebra balıkları, protokolün başlamasından önce 24 saat boyunca oruç tuttu. Sistem suyu, su tesisindeki zebra balığı muhafaza tanklarındaki suyu ifade eder.
1. Hazırlık ve anestezi
<ol><li>Sistem suyunda %0,016 Trikain çözeltisi hazırlayın. DİkKAT: Trikain gözlere, ...

<ol>
	<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+liver+regeneration+and+growth+homeostasis.">Principles of liver regeneration and growth homeostasis.</a> Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).</li><li>Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+it+new+again:+insight+into+liver+development,+regeneration,+and+disease+from+zebrafish+research.">Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).</li><li>Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+biological+and+pathological+mechanisms+and+implications.">Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications.</a> Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).</li><li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration.">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).</li><li>Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+growth+in+the+embryo+and+during+liver+regeneration+in+zebrafish+requires+the+cell+cycle+regulator+uhrf1.">Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).</li><li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development.">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).</li><li>Dovey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+II+is+required+for+embryonic+development+and+liver+regeneration+in+zebrafish.">Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).</li><li>Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+growth+mechanisms+regulated+by+BMP+and+FGF+signaling+mediate+liver+regeneration+in+zebrafish+after+partial+hepatectomy.">Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy.</a> The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).</li><li>Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficiency+of+Def+activates+p53-dependent+TGF&#946;+signalling+and+causes+scar+formation+after+partial+hepatectomy.">Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGF&#946; signalling and causes scar formation after partial hepatectomy.</a> PLoS One. 9, (2014).</li><li>Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+characterization+of+the+dorsal+lobes+after+hepatectomy+of+the+ventral+lobe+in+zebrafish.">Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish.</a> BMC Genomics. 16, 979 (2015).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).</li><li>Grisham, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizational+principles+of+the+liver.">Organizational principles of the liver.</a> The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).</li></ol>

Karaciğer yenilenmesi için zebra balığı ve memeli modelleri arasındaki anatomik farklılıklar karaciğer rezeksiyonu için benzersiz zorluklar ortaya koyuyor. Zebra balıklarındaki karaciğer kalbe ve bağırsaya yakındır; yanlışlıkla her iki organa da zarar vermek mortalitenin artmasına neden olur. Zebra balığı karaciğeri kapsüllenmemiştir, bu da bağırsaktan ayrılmasını zorlaştırır. Karaciğer, portal damarlardan bağırsaktan besin bakımından zengin kan alır. Memelilerde, bağırsaktan ay...

İnsanlardaki katı organlar arasında karaciğer yenilenebilen tek organdır1. Karaciğer, temel metabolik fonksiyonlardan, enerji depolamadan, kan detoksifikasyonundan, plazma proteinlerinin salgılanmasından ve safra üretiminden sorumlu temel bir organ olduğu için bu kritiktir2. Toksik veya enflamatuar hasar nedeniyle kaybedilen hepatositler öncelikle kalan hepatositlerin bölünmesi ile değiştirilir1. Karaciğer yenilenmesini incelemek için klasik deneysel modellerden biri, karaciğerin bireysel loblarının çıkarıldığı ve kalan lobların sağlam kaldığı kısmi hepatektomidir3. Bu prosedür başlangıçta karaciğer kütlesinin yaklaşık üçte ikisinin çıkarıldığı sıçanlarda geliştirilmiştir. Memelilerde kısmi hepatektomiden sonra, karaciğer ilk kütlesini geri alana kadar kalan loblarda telafi edici rejenerasyon meydana gelir. Özellikle, memeli karaciğeri eksik lobların yerini almaz.
Zebra balığı (Danio rerio) yetişkin organ rejenerasyonunu incelemek için çekişli bir modeli temsil eder4. Zebra balığı karaciğeri, yapısal olarak memeli karaciğerinden farklı olsa da, aynı hücre türlerinden oluşur ve memelilerde olduğu gibi aynı işleve hizmet eder2. İki sırt lob ve bağırsak boyunca düzleştirilmiş tek bir ventral lob ile üç lobdan oluşur. Kısmi hepatektomi daha önce zebra balıklarında, kesin rejenerasyon modu ile çelişen hesaplarla gerçeklenmiştir. Tipik olarak, tüm ventral lobun çıkarılmasıyla üçte bir kısmi hepatektomi yapılır. İlk raporlar, ventral lobun çıkarılmasından sonra,5, 6,7hafta içinde tamamen yenilendiğini vememelikaraciğerinin aksine zebra balığı karaciğerinin epimorfik rejenerasyon yapabileceğini göstermektedir. Daha sonraki çalışmalar, ventral lobun çıkarılmasının, eksik ventral lobun yenilenmesi yerine sırt loblarında telafi edici yenilenme ile sonuçlendiğini ve sonuçta karaciğer kütlesinin bir hafta içinde iyileşmesine neden olduğunu göstermiştir8,9. Ventral lobun rezeksiyonunu takiben sırt loblarının transkriptomik profillemesi, kompanzasyon rejenerasyonu ile ilişkili önemli değişiklikler ortaya koydu10. Karaciğer rejenerasyon modunun yaralanmanın boyutuna göre değişebileceği göz önüne alındığında8, sonuçlardaki tutarsızlıkların araştırma grupları arasındaki kısmi hepatektomi protokolündeki teknik varyasyondan kaynaklanabileceğini tahmin ettik.
Bu protokol, ventral lobun çıkarılmasıyla yetişkin zebra balıklarında üçte bir kısmi hepatektomi yapılması için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu teknik karaciğer yenilenme mekanizmalarının değerlendirilmesi için değerli olacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance</td>
			<td>Bay State Scale &#38; Systems, INC.</td>
			<td>WL-104-1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72997-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Discovery.V8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07CBSM53Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS10X Liquid Conc 4L</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>6505-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Micro Scissors, 3 1/4&#34; straight</td>
			<td>Biomedical Research Instruments</td>
			<td>11-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Syndel</td>
			<td>TRIC-M-GR-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

partial hepatectomy in adult zebrafish

Karaciğer yetmezliği dünya çapında önde gelen ölüm nedenlerinden biridir ve Amerika Birleşik Devletleri'nde kronik karaciğer hastalığından ölüm oranı keskin bir şekilde artmaktadır. Sağlıklı karaciğerler toksik hasardan yenilenebilir, ancak ileri karaciğer hastalığında karaciğerin doğal yenilenme yeteneği bozulur. Zebra balığı, yenilenmeyi incelemek için güçlü bir deneysel sistem olarak ortaya çıkmıştır. Karaciğerin bir kısmının cerrahi olarak çıkarıldığı, geri kalanının sağlam bıraktığı doğrudan klinik alaka düzeyine sahip bir prosedür olan kısmi hepatektomiden karaciğer yenilenmesini incelemek için ideal bir modeldir. Kısmi hepatektomi için standart bir protokol yoktur; bu modeli kullanan önceki çalışmalar biraz farklı protokoller kullanmış ve farklı sonuçlar bildirmiştir. Burada açıklanan, yetişkin zebra balıklarında kısmi hepatektomi yapmak için verimli, tekrarlanabilir bir protokoldür. Zebra balıklarının resected lobun epimorfik rejenerasyonunu yapabildiğini göstermek için bu tekniği kullanıyoruz. Bu protokol zebra balıklarında karaciğer yenilenmesi için gerekli mekanizmaları daha fazla sorgulamak için kullanılabilir.

Yetişkin zebra balığı karaciğerinin rejeneratif potansiyelini incelemek için yetişkin zebra balıklarında kısmi hepatektomi (PHX) yaptık. Genel olarak, 1,5-2,5 yaş arasında değişen büyük yetişkinler (30-40 mm uzunluğunda) seçildi. Bireysel deneylerde, hayvanlar aynı tanktan seçildi ve yaş ve boyutla eşleşti. Uygun bir kontrol olarak, hayvanın hem uyuşturulduğu hem de ventral vücut duvarında büyük bir kesi aldığı ancak herhangi bir doku çıkarılmadan kurtarıldığı sahte ameliyatlarda...

Watch this Scientific Journal Video about Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish at JoVE.com

Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish

Bu protokol, karaciğer yenilenmesinin incelenmesini sağlamak için yetişkin zebra balıklarında karaciğerin ventral lobunun çıkarılması prosedürünü açıklar.

Yetişkin Zebra Balıklarında Kısmi Hepatektomi

Liver failure is one of the leading causes of death worldwide, and mortality from chronic liver disease is rising sharply in the United States. Healthy ...

Bu protokol, araştırmacıların zebra balıklarındaki karaciğer yenilenme mekanizmalarını incelemek için mevcut kimyasal ve genetik araçlardan yararlanmalarını sağlayacaktır. Kısmi hepatektomi, toksik karaciğer hasarının vücut çapındaki etkilerine gerek kalmadan karaciğer yenilenmesini teşvik etmek için dokunun kesin olarak çıkarılmasını sağlar. Ancak karaciğer yenilenmesinin moleküler ve hücresel mekanizmalarını anlayarak ileri karaciğer hastalığı olan hastaları tedavi etmek için yeni tedaviler tasarlayabiliriz.Başlamak için, balıkları tokaları kullanarak Tricaine tankından çıkarın ve ventral tarafı yukarı olacak şekilde Tricaine ıslatılmış bir süngerin oluğuna gömün. Daha sonra süngeri yukarıdan aşağıya aydınlatmalı bir kesme mikroskobu altına yerleştirin. İnce önps ile cildi ve pulları kalbe hemen arka olarak sıkıştırın ve yaylı makasla tokaların altında bir kesim yaparak vücut boşluğunda bir delik oluşturun.Süngeri döndürün ve pelvik yüzgeçlere doğru arka arka keserek karın boyunca üç ila dört milimetrelik bir kesi yapın. Sonra süngeri geri döndürün. Visseral organları vücut boşluğundan çıkarmak için süngerin kenarlarını bir elinizle sıkın.Karaciğerin ventral lobu bağırsağın üstünde bulunur ve karaciğer altın kahverengi bağırsağa yayılmış pembe veya turuncu bir yapıdır ve CFP floresan ile açıkça görselleştirilebilir. İnce kaleleri, tinelerin birbirine değmesi için sıkın ve tineleri karaciğer ve bağırsak arasında kaydırın. Daha sonra karaciğer ve bağırsak arasındaki portal damar bağlantılarını kırmak için tenekeleri yavaşça ayırın.Karaciğer ve bağırsak arasındaki tüm portal bağlantıları kopana kadar bu işlemi tekrarlayın ve ince tokparlamalar kullanarak ventral lobunu bağırsaktan çekin. Ventral lobun karaciğerin geri kalanından arındırın. Hayvanın CFP floresan ile incelenmesi, ventral lobun çıkarıldığını göstermektedir.Bittiğinde, balıkları süngerden sistem suyu içeren tanka dikkatlice aktarın ve balık kendi kendine iyileşene ve yüzene kadar sistem suyunu birkaç dakika solungaçların üzerinden akar. Balıkları ötenazi ettikten sonra buzlu sudan çıkarın. Ventral tarafı yukarıda olan bir süngerin oluğuna yerleştirin ve kalbin ön arka pozisyonunda ventral vücut duvarının bir kesisini yapın.Daha sonra ön arka eksen boyunca pelvik yüzgeçlere kadar uzanan ilk kesinin kenarlarından iki kesi daha yapın ve visseral organları ortaya çıkarmak için cildi ve kası soyun. Viseral organlar artık hem parlak alan hem de floresan mikroskopi ile görselleştirilebiliyor. Kısmi hepatektomi sonrası karaciğer iyileşmesi, erkeklerde %1,8, kadınlarda %3,3 olan karaciğerin vücut ağırlığı oranı hesaplanarak tahmin edildi.Her iki cinsiyetin karaciğer-vücut ağırlığı oranı ameliyat sonrası sıfır, kısmi hepatektomi ve sham kontrollerinde yedinci günde belirlendi. Ameliyat sonrası sıfır gününde, sham hayvanların görünür bir ventral lobları vardır, ancak kısmi hepatektomi hayvanlarında, ventral lob tamamen yoktu, bu da erkeklerde% 30 azalmaya ve karaciğer kadınlarının vücut ağırlığı oranlarına% 20 azalmasına neden oldu. Kısmi hepatektomi hayvanlarında yedinci ameliyat sonrası günde, ventral lob yenilenmedi ve kısmi hepatektomi ve sham kontrollerinde karaciğerden vücut ağırlığı oranları karşılaştırılabilirdi, bu da kısmi hepatektomi sonrası karaciğer kütlesinin geri kazanıldığını gösteriyordu.Zamanın ventral lob rejenerasyonuna etkisi tam 1/3 kısmi hepatektomi yapılarak ve ventral lobun bağırsak uzunluğu oranına ölçülmesi ile belirlendi. Ventral lob, sham kontrollerinde bağırsak uzunluğunun% 50 ila 100'ünü işgal etti, ancak 1/3 kısmi hepatektomi hayvanlarında ciddi şekilde azaldı. Ameliyat sonrası 36. günde kısmi hepatektomi hayvanlarında ilk gün ameliyat sonrası ile karşılaştırıldığında ventral lobdan bağırsak oranına kadar artış gözlendi.Ameliyat sonrası 36. günde kısmi hepatektomiden iyileşen hayvanlarda ilk güne göre istatistiksel olarak anlamlı bir artmış ventral lob büyüklüğü gözlenmiştir, ancak sahte kontrollerde gözlenmemiştir. Bazı hayvanlar ventral lobu yenilemiş, ancak bazıları değil, ameliyat tepkisinde değişim olduğunu gösterir. Bu protokolün en kritik kısmı, ventral lobun tamamen çıkarılabilmesi için karaciğeri ve bağırsağı temiz bir şekilde ayırmaktır.Zebra balıklarında kısmi hepatektomi, karaciğer yenilenmesi için genetik gereksinimleri test etmek için mutant veya transgenik çizgilerde yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Yetişkin Zebra balığı Tüm Böbrek İliği Nakli

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Yetişkin Zebra balığı retro-orbital Enjeksiyon

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Yetişkin Zebra balığı Organları diseksiyonu

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Yetişkin Zebra balığı içine intraperitoneal enjeksiyon

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Yetişkin Zebra balığı Böbrek diseksiyonu

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Larvaların Kalp Diseksiyon, Çocuk ve Yetişkin Zebra balığı, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Morpholinos in vivo Elektroporasyon Yetişkin Zebra balığı Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Yenileyici Yetişkin Zebra balığı Tail Fin içine Morpholinos in vivo olarak Elektroporasyon

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

Yetişkin Zebra balığı Biyokimyasal Analiz için Kan Alma

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

Yetişkin Zebra balığı Gavaging

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...