Name: preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography
Uploaded: 2021-08-05T13:30:00
Duration: 7 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

تم تمويل هذا البحث كليا أو جزئيا من قبل Wellcome Trust (212916 / Z / 18 / Z). لغرض الوصول المفتوح ، قام المؤلف بتطبيق ترخيص حقوق الطبع والنشر العام CC BY على أي نسخة مخطوطة مقبولة من المؤلف تنشأ عن هذا التقديم.
تم تمويل هذا المشروع الذي تم تطوير هذه الطريقة من أجله من خلال منحة مجلس البحوث الطبية MR / P010288 / 1 الممنوحة لهيلين آر سيبيل ورولاند أ. فليك ومايكل جيه بلاكمان. نمت ثقافات P. falciparum في معهد فرانسيس كريك ، بدعم من أعضاء مجموعة مايكل جيه بلاكمان. يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور سير يينغ (ميشيل) تان على تقديم صور الفصام المعالج بالمركب 2 و E64 في مسحات الدم الرقيقة. تم إنتاج معظم الصفائح بدعم من الموظفين في eBIC ونحن ممتنون للوصول إلى Scios مزدوج الحزمة cryoFIB-SEM في اقتراح البحث NT21004. يقر المؤلفون أيضا بدعم برنامج زمالة صناعة الجمعية الملكية (INF \ R2 \ 202061) في مواصلة تطوير تقنية طحن FIB داخل CUI. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا هيلين ر. سيبيل على المناقشات المفيدة فيما يتعلق بورقة الأساليب هذه والإشراف على المشروع.

تم الحصول على الدم البشري من متبرعين مجهولي الهوية من خلال خدمة الدم وزرع الدم الوطنية في المملكة المتحدة ويستخدم في غضون 2 أسابيع من الاستلام. لا يلزم الحصول على موافقة أخلاقية لاستخدامه.
1. تحضير وتجميد خلايا الدم الحمراء المصابة بالمتصورة المنجلية
<ol><li>عزل الفصاميات الناضجة عن طريق الطرد المركزي (1580 × جم) على وسط تدرج كثافة متساوي التوتر بنسبة 70٪ (v / v) (للاطلاع على الإجراءات القياسية لكيفية زراعة مراحل الدم اللاجنسية ل 3D7 Plasmodium falciparum في كريات الدم الحمراء البشرية ، انظر Blackman M.J. ، 199537).</li>
	<li>ثبت أغشية الدم الرقيقة المجففة بالهواء على شريحة زجاجية تحتوي على ميثانول 100٪ للتحقق من التجانس المورفولوجي للفصام قبل تلطيخها بصبغة Giemsa بنسبة 10٪ في محلول فوسفات 6.7 mM ، درجة الحموضة 7.1. ملاحظة: لإثراء التحضير للشيزونات المتوقفة عند نقاط خروج محددة ، يمكن مزامنة الفصاميات بشكل أكبر مع مثبطات المركب 2 و E64 (انظر النتائج التمثيلية والشكل 1 للحصول على شرح لتأثير هذه المثبطات). تنبيه: المتصورة المنجلية هي أحد مسببات الأمراض البشرية ويجب التعامل معها فقط في منشأة احتواء مناسبة وفقا لإرشادات الصحة والسلامة المحلية.</li>
	<li>أجهزة طرد مركزي برفق (240 × جم) لتكويرها وإعادة تعليقها في حجم 2x من حبيبات الخلية لوسائط RPMI ، مما ينتج عنه تعليق هيماتوكريت بنسبة 50٪.</li>
	<li>على جهاز التجميد اليدوي ، قم بتطبيق 2.5 ميكرولتر من schizonts على جانب الكربون من تفريغ التوهج (استخدم إعدادات وحدة تفريغ التوهج 60 ثانية ، 30 مللي أمبير في الهواء ، ومعالجة جانب الكربون من الشبكة فقط) شبكة نحاسية 200 مع فيلم كربون هولي 2/4 وصمة عار ل ~ 20 ثانية من الجزء الخلفي من الشبكة باستخدام ورق ترشيح من الدرجة 1 بحافة ممزقة. الغطس في الإيثان السائل المبرد بالنيتروجين ونقل الشبكات إلى التخزين (انظر جدول المواد للمعدات المستخدمة في هذه الدراسة). ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا ، ويمكن تخزين الشبكات تحت النيتروجين السائل إلى أجل غير مسمى. تنبيه: النيتروجين السائل هو مادة خانقة ويسبب قضمة الصقيع. تعامل بحذر في بيئة مناسبة مع مراقبة الأكسجين. تنبيه: الإيثان السائل يسبب حروقا شديدة وقابل للاشتعال. استخدم في غطاء الدخان بعيدا عن مصادر الاشتعال. ملاحظة: لم تعد الغطس المجمدة قابلة للحياة. تم تحديد ذلك من خلال احتضان دم الإنسان بعدة شبكات ذهبية من شيزونتات الغطس المجمدة المذابة بالهواء وعدم ملاحظة أي نمو للطفيلي بعد عدة أيام ، مقارنة بالضوابط غير المجمدة. وبالتالي ، فإن شبكات schizonts المجمدة آمنة للتعامل معها خارج مرافق الاحتواء باستخدام إجراءات السلامة وإزالة التلوث العادية (القفازات ، تعقيم السطح / الأداة بإيثانول >70٪ والتخلص من الشبكات في >70٪ إيثانول).</li>
	<li>شبكات الشاشة باستخدام مرحلة التبريد للمجهر الضوئي ، مع إيلاء اهتمام خاص لتدرج الجليد عبر الشبكة. في المناطق الرقيقة من الجليد ، تحقق من مربعات الشبكة الفردية لتغطية الخلية. ملاحظة: يجب أن تكون أفضل المربعات بسمك خلية واحدة في وسط مربع الشبكة (الشكل 2). هذا يضمن إمكانية طحن الصفيحة عبر وسط المربع دون الاصطدام بالجليد السميك عند الحواف مقابل قضبان الشبكة. يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا ، ويمكن تخزين الشبكات تحت النيتروجين السائل إلى أجل غير مسمى. إذا كانت الخلايا تحمل علامة فلورية ، فيمكن أيضا فحص الشبكات بواسطة cryoCLEM لتحديد مواقع X / Y ذات الأهمية ، والتي يمكن ربطها بمواقع الشبكة في cryoFIB-SEM للطحن المباشر.</li>
</ol>2. طحن FIB على الشبكة للخلايا المجمدة الغاطسة
<ol><li>ضع علامة على الجزء الأمامي من جنوط autogrid الخاصة ب cryoFIB بقلم تحديد أسود لا يمحى للإشارة إلى مركز القسم المقطوع والجانب الآخر من الحافة (الشكل 3). قم بإعداد محطة القطع وشبكات القصاصات في جانب الكربون الحلقات المحدد لأسفل.</li>
	<li>قم بتحميل الشبكات في مكوك cryoFIB-SEM (عادة شبكتان ، اعتمادا على المكوك) من جانب الكربون لأعلى وقم بتطبيق طبقة رش بلاتينية في جو من الأرجون (5 × 10-2 ملي بار) (5 مللي أمبير لمدة 60 ثانية - السماكة متغيرة) أو طبقة دوارة من الكربون / البلاتين e-beam (~ 4 نانومتر سمك) على سطح الخلايا. ملاحظة: يساعد كلا النوعين من الطلاءات على تشتت الشحنة أثناء التصوير بالتسويق عبر محرك البحث. تتمثل فائدة الطلاء الدوار e-beam في أنه يمكن تحديد السماكة الدقيقة للطلاء.</li>
	<li>قم بتحميل المكوك في cryoFIB-SEM وقم بتقييم توزيع الخلايا على كل شبكة بواسطة SEM عند 5 كيلو فولت (13 pA أو 25 pA). ألق نظرة عامة على التكبير المنخفض (~ 100x) لإلقاء نظرة على التدرجات الجليدية عبر الشبكة. بعد ذلك ، التقط صورا عالية التكبير (~ 5000x) لإلقاء نظرة على مربعات الشبكة الفردية وتحديد مناطق الشبكة ذات الميزات الخلوية المرئية والتلوث السطحي المنخفض للمطحنة.</li>
	<li>ضع طبقة >2 ميكرومتر من البلاتين العضوي على سطح كل شبكة باستخدام نظام حقن الغاز (GIS). للقيام بذلك ، أدخل إبرة GIS في الغرفة أعلى الشبكة وقم بتسخين مصدر البلاتين العضوي إلى درجة حرارة محددة لفترة محددة (على سبيل المثال ، ~ 27 درجة مئوية لمدة 3-10 ثوان) لإنتاج تدفق بخار. ملاحظة: يجب تحسين زاوية التطبيق ودرجة الحرارة وتوقيت طبقة البلاتين العضوي عبر إبرة GIS لزيادة الطلاء المتساوي. سيعتمد هذا على cryoFIB-SEM المحدد المستخدم (انظر النتائج التمثيلية لمزيد من التوضيح).</li>
	<li>قم بإمالة العينة بحيث يكون مستوى الشبكة ~ 10 درجة من زاوية سقوط الحزمة الأيونية وحرك مركز مربع الشبكة المناسب ليتم رؤيته في كل من صور SEM و FIB.</li>
	<li>قم بمسح الشبكة باستخدام الحزمة الأيونية عند التيار المنخفض (اسميا 1.5 pA ، 30 kV) وانتقل إلى تكبير عالي بما يكفي (~ 7000x) لتصور الخلايا في مركز مربع الشبكة. ضع العينة في بؤرة التركيز عند تيار الطحن الأول (300 pA) وصحح الاستجماتيزم. اضبط السطوع والتباين ، ثم حدد نمطين مستطيلين للطحن ، أحدهما أعلى والآخر أسفل منطقة محمية بسمك 3 ميكرومتر ، مركزها هو الموقع المطلوب للصفيحة النهائية. ملاحظة: يعتمد العرض المختار للأنماط على تضاريس طبقة الخلية المحيطة وحجم الخلية. 7-20 ميكرومتر هو عرض مناسب للشيزونتات ، لكن الصفائح الأوسع تستغرق وقتا أطول للطحن. يعتمد الارتفاع المختار للأنماط لخطوة الطحن الأولى على سمك العينة ، بدءا من حوالي 6 ميكرومتر ؛ قد يحتاج هذا إلى التعديل أثناء الطحن. يتم الطحن بشكل اتجاهي من الحواف العلوية والسفلية الخارجية للأنماط باتجاه وجه الصفيحة. يمكن القيام بذلك بالتوازي ، حيث يتم طحن كلا النمطين بشكل متزامن أو متسلسل ، أولا إزالة المواد من أعلى الصفيحة ثم من الأسفل.</li>
	<li>ابدأ الطحن عند التيار الأول ؛ مراقبة التقدم المباشر في عرض الحزمة الأيونية وبشكل متقطع بواسطة SEM (5 كيلو فولت أو 13 أو 25 pA). تأكد من أن الحزمة الأيونية قد اخترقت العينة أعلى وأسفل المنطقة المحمية. إذا لم يكن كذلك ، فقم بزيادة ارتفاع الأنماط المستطيلة لإزالة المزيد من المواد. توقف عندما يكون السطح أعلى وأسفل الصفيحة أملسا تماما في عرض الحزمة الأيونية. ملاحظة: اخترق الشعاع الأيوني العينة أعلى وأسفل المنطقة المحمية عندما لا يحتوي الجزء الداخلي من الأنماط المستطيلة على أي ميزات في المستوى البؤري. قد تكون بعض الميزات، مثل أشرطة الشبكة، مرئية خارج نطاق التركيز في الخلفية.</li>
	<li>التغيير إلى تيار الطحن التالي (100 pA) ؛ التركيز وضبط السطوع / التباين. قم بتقليل المسافة بين النموذجين المستطيلين إلى 1.5 ميكرومتر وتقليل ارتفاع النموذج لتغطية المادة غير المطحونة فقط. ابدأ الطحن عند التيار الجديد حتى يصبح السطح أعلى وأسفل الصفيحة أملسا تماما.</li>
	<li>كرر هذه العملية تدريجيا حتى يتم الوصول إلى سمك 0.3 ميكرومتر ، مما يقلل من تيار الحزمة الأيونية في كل مرة وفقا لمخطط الطحن في الجدول 1.</li>
	<li>قم بطحن عدة صفائح (تعتمد الكمية على سمك العينة والوقت المتاح) على إحدى الشبكتين أو كليهما بسمك 0.3 ميكرومتر ، وسجل موضع X / Y / Z لكل صفيحة واحتفظ ~ 1-2 ساعة في نهاية الجلسة لتلميع الصفائح إلى سمكها النهائي (60-200 نانومتر).</li>
	<li>خذ نظرة عامة على SEM منخفضة التكبير للشبكة بأكملها وخطط لمسار تلميع يبدأ من الصفائح في مقدمة الشبكة (أقرب إلى مصدر الحزمة الأيونية) إلى الصفائح في الجزء الخلفي من الشبكة (الأبعد عن مصدر الحزمة الأيونية) (الشكل 5). ملاحظة: هذا يقلل من إعادة ترسب المواد المستأصلة مرة أخرى على سطح الصفائح المصقولة.</li>
	<li>قلل المسافة بين النمطين المستطيلين إلى 100-200 نانومتر وابدأ خطوة التلميع النهائية عند تيار شعاع أيوني يبلغ 30 pA. راقب التقدم بواسطة SEM عند 2-3 كيلو فولت (13 pA ، المسكن = 300 n ، 3072 × 2048 ، ~ 2 ثانية لإطار كامل) وتوقف عن التلميع عندما يتم فقد التباين في الصفيحة بواسطة SEM أو عندما يبدأ معطف البلاتين العضوي للصفائح نفسها في فقدان سلامتها.</li>
	<li>قبل إزالة الشبكات ، احصل على صورة SEM منخفضة التكبير للشبكة بأكملها واحفظ صورا لكل صفيحة. استخدمها للتحقق من الشبكة لاحقا في TEM. أوقف التجربة مؤقتا هنا وقم بتخزين الشبكات باستخدام الصفائح تحت النيتروجين السائل - تعامل معها بعناية. ملاحظة: يمكن طلاء الشبكات برفق عند إزالتها من cryoFIB-SEM ، مما قد يساعد في الحد من الانجراف والشحن في TEM عند التكبير العالي ، ولكن يجب القيام بذلك بحذر لأن الكثير من طلاء الرش يمكن أن يحجب المحتويات البيولوجية داخل الصفائح. من الممكن فحص الصفائح بحثا عن التألق في هذه المرحلة ؛ ومع ذلك ، فإن الحصول على إشارة كافية يعتمد على وفرة البروتين المسمى داخل سمك الصفيحة. يجب توخي الحذر الشديد في التعامل مع الشبكات للحد من الأضرار التي لحقت الصفائح ومنع تلوث السطح.</li>
</ol>3. اقتناء سلسلة الإمالة ونظرة عامة على معالجة البيانات
<ol><li>قم بتحميل الشبكات في TEM ، مع محاذاة اتجاه الطحن بشكل عمودي على محور إمالة المرحلة. ملاحظة: تتم محاذاة الشبكات بالعين باستخدام العلامات الموجودة على حافة الشبكة التلقائية. هامش الخطأ ~ 10 درجة مقبول ، وإلا فإن جدران الخندق على جانبي الصفيحة قد تحجب الصفيحة أثناء إمالة الشبكة.</li>
	<li>الحصول على خريطة منخفضة التكبير (~ 150x) للشبكة بأكملها وتحديد موقع الصفائح ؛ بعد ذلك ، احصل على خريطة تكبير متوسطة (~ 1500x ، اعتمادا على حجم الصفيحة) لكل صفيحة وحدد مناطق الاهتمام.</li>
	<li>قم بإمالة الشبكة مسبقا بمقدار ±10 درجات لجعل مستوى الصفيحة (وليس الشبكة) عموديا على المحور البصري ملاحظة: يمكن تحديد اتجاه الإمالة المسبقة من خلال موضع الحافة الأمامية للصفائح (تبحث عن الطبقة اليسرى فوق البلاتين العضوي) في خرائط التكبير المنخفضة والمتوسطة. بالنسبة ل TEM المستخدم هنا ، تتطلب الشبكات إمالة مسبقة + 10 درجات إذا كانت الحواف الأمامية للصفائح تشير إلى أعلى في الخرائط وتتطلب إمالة مسبقة -10 درجة إذا كانت تشير إلى أسفل. قد تختلف كل شبكة بسبب كيفية التقاطها وإدخالها في أداة التحميل التلقائي.</li>
	<li>احصل على سلسلة الميل المتماثلللجرعة 38 (على سبيل المثال ، -54 درجة إلى + 54 درجة مع زيادة قدرها 3-5 درجة) بحجم بكسل يسمح بكل من مجال الرؤية والدقة المطلوبة لمنطقة الاهتمام. استخدم نطاقا من قيم إلغاء التركيز البؤري بين -2 و -5 ميكرومتر. اجمع الأفلام التي تحتوي على 3-10 إطارات في كل زيادة ولهذا ، اضبط هذه المعلمات اعتمادا على حجم البكسل لتجميع جرعة إجمالية تبلغ ~ 150 e- / Å2 (ل 300 كيلو فولت TEM). ملاحظة: يجب تجنب التشققات في الصفيحة لأن هذه المناطق قد تنجرف. يجب أيضا تجنب تلوث السطح لأنه قد يحجب منطقة الاهتمام أو منطقة التركيز عند الميل العالي.</li>
	<li>قم بتصحيح الأفلام باستخدام برنامج مثل MotionCor239. قم بتطبيق مرشح ترجيح الجرعة على الصور المصححة (e-/image المتراكمة)40 وقم بتقدير إلغاء تركيز كل صورة باستخدام برنامج مثلCTFFIND4 41.</li>
	<li>استخدم المحاذاة غير الإيمانية (تتبع التصحيح) في برنامج مثل etomo (IMOD) 42 لحساب المحاذاة والعلاقة الزاوية للصور في سلسلة الإمالة.</li>
	<li>أدخل معلومات المحاذاة والتدوير ، جنبا إلى جنب مع قيم إلغاء التركيز في برنامج يمكنه تطبيق تصحيح CTF ثلاثي الأبعاد ، على سبيل المثال ، NovaCTF43. احسب التصوير المقطعي المصحح للحصول على صور مقطعية ناتجة مع عوامل binning ذات الصلة بتحليل المصب.</li>
	<li>قم بتحليل عمليات إعادة البناء والاستعداد لأي معالجة نهائية ، على سبيل المثال ، التصفية أو التجزئة أو متوسط التصوير المقطعي الفرعي.</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

في حين أن الطحن بالتبريد أصبح أكثر روتينية ، فإن إعداد العينات المثلى للطحن لم يحدث ؛ لذلك ، تحدث معظم الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول قبل أن تصل العينة إلى cryoFIB-SEM. يلزم تحسين العينة عن طريق جولات متعددة من تحضير الخلية ، وتجميد الغطس ، والفحص بواسطة المجهر الضوئي والإلكتروني لإنتاج أفضل عينة ممكنة قبل محاولة الطحن. إن الحصول على أفضل عينة ممكنة لا يزيد من فرص النجاح فحسب ، بل يحسن أيضا استخدام المعدات. لهذا السبب ، تتطلب معظم المرافق الوطنية دليلا على أنه تم إجراء تحسين كاف قبل منح الوقت على أجهزتها. بمجرد دخول cryoFIB-SEM ، يعد تعظيم فعالية طبقة البلاتين العضوي أمرا بالغ الأهمية من أجل إنتاج صفائح رقيقة بشكل موحد. أخيرا ، يعد الصبر والتعامل الجيد مع العينات مهارة أساسية من المستخدم ، الذي سيطلب منه الجلوس لعدة أيام لإنتاج ثم نقل الشبكات التي تحتوي على صفائح حساسة. قد يتغير هذا مع إدخال استراتيجيات الطحن الآلي47,48 ، ولكن حتى الآن ، لا تزال عملية الطحن بأكملها يدوية إلى حد كبير في معظم المرافق.
بينما ركز العمل فقط على P. falciparum schizonts ، يمكن تعديل الطريقة المعروضة هنا بسهولة لتحسين إعداد الشبكة والطحن لأنواع الخلايا الأخرى. العوامل المهمة التي يجب مراعاتها هي كثافة الخلايا التي يتم تطبيقها على الشبكة ، ونوع الشبكة (النحاس سام لبعض الخلايا) ، وحجم وتباعد الثقوب في فيلم الكربون ، ووقت النشاف ، وطريقة النشاف (أحادي / مزدوج الجوانب ، يدوي ، أو آلي). بالإضافة إلى ذلك ، إذا كانت الخلايا تزرع على الشبكات (عادة شبكات ذهبية مع فيلم كربوني هولي) ، يمكن التحقق من التقاء المجهر الضوئي قبل النشاف والتجميد. تعتمد استراتيجية الطحن على كيفية ترسيب الخلايا على الشبكة. بالنسبة لخلايا الدم الحمراء المصابة بالملاريا ، فإن الشبكة مغلفة بشكل أساسي بطبقة غير منقطعة من الخلايا ، أكثر سمكا في بعض المناطق وأرق في مناطق أخرى. يتم الطحن في نقاط متعددة في منطقة واحدة على طول هذا التدرج حيث يولد سمك الجليد صفائح ذات حجم مناسب للتصوير المقطعي. يعمل هذا الأسلوب بشكل جيد مع الخلايا الأصغر حيث يمكنك إنتاج صفائح تحتوي على شريحة عبر خلايا متعددة. بالنسبة للخلايا الأكبر حجما أو كتل الخلايا ، قد تكون الحالة هي أن خلية واحدة أو كتلة خلوية قد تنتج صفيحة واحدة.
تظل معالجة الشبكة ونقل العينات أحد التحديات الرئيسية لسير العمل هذا. يمكن أن تضيع الصفائح بسبب الكسور أو الشقوق ، والستائر المصنوعات اليدوية التي تحجب البيولوجيا ، والتلوث السطحي المفرط ، فضلا عن مشاكل توجيه الشبكة داخل TEM ، مما يتطلب خطوة معالجة إضافية لإعادة وضع الشبكة. تختلف درجة الخسائر من يوم لآخر ومن شبكة إلى أخرى ، ولكن يتم تحسينها من خلال الممارسة وتجربة التعامل مع مرور الوقت. في هذه الدراسة ، وجد أنه يمكن إعادة توجيه الشبكات بعناية في أداة التحميل الآلي عدة مرات دون تدمير الصفائح وهذا في بعض الأحيان له فائدة في غسل الجليد السطحي. القيد الرئيسي الآخر لسير العمل هذا هو الوقت المستغرق لإنتاج الصفائح. نظرا لأن الإنتاج بطيء ، فمن الأهمية بمكان الحصول على عينة محسنة بشكل صحيح ، مما يجعل الطحن فعالا قدر الإمكان.
تم مؤخرا إدخال عدد من التعديلات على طحن FIB للعينات البيولوجية الزجاجية. مغير قواعد اللعبة هو تنفيذ أدوات الرفع المبردة بالتبريد داخل غرفة cryoFIB-SEM التي تتيح طحن كتل أكبر من المواد من العينات المجمدة عالية الضغط. يمكن ربط الكتل بقضيب معدني أو التقاطها في قابض ونقلها إلى موضع عينة ثان ، يحتوي على شبكة EM معدلة خصيصا. يمكن بعد ذلك طلاء الكتل بالبلاتين العضوي وطحنها لتوليد الصفائح. تعني القدرة على طحن الصفائح من المواد المجمدة عالية الضغط أنه يمكن معالجة خلايا وأنسجة أكبر بكثير ، وتستهدف على وجه التحديد المناطق بواسطة المجهر الفلوري المترابط12. تشمل التعديلات الحديثة الأخرى على طريقة طحن FIB تقليل القطع الأثرية الستائرية عن طريق الطحن المسبق للعينة16 ، وتثبيت الموائع الدقيقةبالتبريد 49 والتنميط المجهري الضوئي لشبكات المجهر الإلكتروني لتحسين توزيع الخلايا50. أيضا ، ثبت أن طحن فجوات التمدد الجزئي على جانبي الصفيحة يمكن أن يخفف من الضغط بواسطة العينة المحيطة عندما تصل إلى نحافتها النهائية51. قد يكون هذا مفيدا بشكل خاص عند طحن طبقات الخلايا المستمرة ، مثل العينة في هذه الدراسة ، حيث يظهر انحناء الصفائح أحيانا أثناء خطوة التلميع النهائية.
من المحتمل أن يكون مستقبل المجهر الإلكتروني هو تحديد الهياكل الجزيئية في الموقع عن طريق متوسط التصوير المقطعي الفرعي ، ويعد طحن FIB أداة مهمة من شأنها تسهيل إنتاج العينات البيولوجية الزجاجية لهذه الأنواع من سير العمل. في حين أن طحن FIB لا يزال في مهده للتطبيقات البيولوجية ، فإن تطوير الأساليب يحدث بوتيرة سريعة بفضل العمل الشاق للباحثين ، سواء الأكاديمية أو في المرافق الوطنية ، بالإضافة إلى الاستثمار التجاري في تطوير تقنية cryoFIB-SEM لدعم البحث.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated from:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University
to:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
M. Alejandra Carbajal1 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

يمكن فقط تصوير المحتويات الخلوية للعينات البيولوجية <500 نانومتر بشكل فعال عن طريق المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) في درجات حرارة مبردة ، مما يحد من نطاق العينات للفيروسات وبدائيات النوى والكائنات الحية البسيطة أحادية الخلية والمناطق الرقيقة من الخلايا حقيقية النواةالأكبر 1. يتيح الطحن بالحزمة الأيونية المركزة على الشبكة (FIB) ترقق العينات البيولوجية المجمدة السميكة إلى صفائح شفافة للإلكترون عند درجات حرارة مبردة (< -150 درجة مئوية). ثم يتم نقل الصفائح الناتجة إلى TEM للتصور وجمع البيانات المقطعية ، مما يتيح إعادة بناء ثلاثية الأبعاد عالية الدقة للميزات الخلوية والجزيئية داخل الخلايا (للمراجعات ، انظر Rigort et al. ، 20122 ، Oikonomou et al. ، 20163 ، و Wagner et al. ، 20204).
ظهر طحن FIB من مجال علوم المواد ، حيث يتم تخفيف العينات بشكل روتيني لإعدادها لتحليل المصب5. يتم تنفيذه في مجهر إلكتروني ماسح (SEM) ، والذي يحتوي على عمودين بصريين: بصريات المجهر الإلكتروني الماسح التقليدي وعمود ثان يحتوي على بصريات قادرة على توليد والتحكم بدقة في شعاع أيوني مركز (FIB) - يسمى FIB-SEM. يسمح ذلك باستئصال منطقة معينة من العينة بواسطة الأيونات الناتجة عن مصدر الغاليوم ، وإزالة المواد الزائدة وترك الصفيحة6. تسترشد عملية الطحن بتصوير SEM لتضاريس العينة ، والذي يستخدم لتحديد المناطق ذات الأهمية ومراقبة تقدم الطحن. بالنسبة للتطبيقات البيولوجية ، يكون الإعداد الأساسي هو نفسه إلى حد كبير ، ولكن يتم الطحن في درجات حرارة مبردة. وقد تطلب ذلك تكييف FIB-SEMs القياسية للحصول على مراحل تبريد بالتبريد تحافظ على درجات حرارة ثابتة ومعدلات تلوث سطحية منخفضة ، بالإضافة إلى غرف معادلة الضغط لتسهيل نقل العينات دون انحراف أو تلوث. كما تم تعديل مكوكات العينات للسماح بتركيب مجموعة من الناقلات المختلفة داخل cryoFIB-SEM ، بما في ذلك شبكات TEM والعوالق والشعيرات الدموية. كانت عدة مجموعات رئيسية من الباحثين مركزية في تطوير هذه الأساليب والتقدم التكنولوجي المستمر في هذا المجال7،8،9،10،11،12. أصبحت الحلول التجارية متاحة الآن على نطاق أوسع للطحن البيولوجي FIB في درجة حرارة مبردة وأصبح طحن الصفائح على الشبكة أكثر روتينية ، بالنظر إلى عينة محسنة.
يمكن استخدام مجموعة من تقنيات درجة حرارة الغرفة وتقنيات cryoEM لتصور المعلومات الخلوية عبر جميع مستويات الحياة ، من الكائنات الحية متعددة الخلايا بأكملها بدقة متواضعة إلى فهم سياق العمليات المعقدة على المستوى الخلوي وبمزيد من التفصيل ، إلى تحديد in situ الهياكل الجزيئية13,14,15,16,17,18,19. تشمل تقنيات درجة حرارة الغرفة الكلاسيكية تقسيم الخلايا والأنسجة الثابتة والملطخة والراتنجية المدمجة بواسطة بضع الميكروبات لتحليل التشكل الخلوي بواسطة TEM (للمراجعة ، انظر Studer et al. ، 200820). تم تطوير تقنيات بديلة لاستغلال تشتت الإلكترون الثانوي بواسطة SEM لتصوير سطح كتل الخلايا المحفوظة ، قبل إزالة المواد تدريجيا إما بسكين (تصوير وجه الكتلة التسلسلية) أو حزمة أيونية مركزة21,22,23. كما تم تنفيذ هذه التقنية بنجاح في درجات الحرارة المبردة (يشار إليها باسم التصوير بحجم التبريد) باستخدام cryoFIB-SEM على كتل زجاجية غير ملوثة من الخلايا أو الأنسجة24. بدلا من ذلك ، يمكن طحن الصفائح السميكة (~ 15 ميكرومتر) ودراستها بواسطة تصوير العلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضيات25. باستخدام هذه التقنيات ، يمكن تصوير كتل كاملة تحتوي على العديد من الخلايا لجمع المعلومات السكانية أو يمكن تصوير عضو / كائن حي كامل وإعادة بنائه في 3D. ومع ذلك ، للوصول إلى المعلومات الجزيئية عالية الدقة من الخلايا ، يجب حفظ العينات في حالة شبه أصلية ومجمدة ، وبالتالي ، يجب تحضيرها في ظل ظروف مبردة. الفحص المجهري الإلكتروني بالتبريد للأقسام الزجاجية (CEMOVIS) هو تقنية يتم من خلالها تقسيم كتل المواد البيولوجية المجمدة عالية الضغط تحت ظروف مبردة باستخدام ميكروتوم فائق. ينتج عن ذلك شرائط من مقاطع التبريد (بسمك 40-100 نانومتر)26، والتي يتم توصيلها بشبكة EM ويتم تصويرها في TEM. ومع ذلك ، فإن التفاعل الجسدي للسكين مع العينة الزجاجية يسبب التشقق والضغط الذي يمكن أن يشوه بشدة البنية الخلوية27,28,29,30. المقاطع السميكة أكثر عرضة لهذه القطع الأثرية ، مما يجعل من غير العملي استخدام أقسام أكثر سمكا من ~ 70 نانومتر26. هذا القيد يقيد إلى حد كبير عرض 3D للبنية البيولوجية في التصوير المقطعي. لا يواجه طحن FIB في درجات حرارة مبردة هذه المشاكل ، ولكن له قطع أثرية خاصة به ناتجة عن معدلات الطحن التفاضلية عبر أجزاء من العينة ، مما يؤدي إلى سماكة متغيرة داخل الصفيحة - تسمى الستارة. يتم تخفيف هذه المشكلة عن طريق تطبيق طبقة من البلاتين العضوي يتم تطبيقها عبر نظام حقن الغاز (GIS) ، والذي يحمي الحافة الأمامية للصفيحة أثناء الطحن31. يتم تحديد الحد الأعلى لسمك العينة لطحن FIB على الشبكة من خلال القدرة على الغطس تجميد العينة مع إبقائها زجاجية32، على الرغم من إدخال تقنيات الرفع بالتبريد وناقلات العينات المكيفة للعينات البيولوجية ، يمكن أيضا استخدام طحن FIB لمعالجة العينات المجمدة عالية الضغط31,33,34,35. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن أن تكون العينات المجمدة الغاطسة رقيقة جدا حيث يجب أن يكون هناك ما يكفي من المواد البيولوجية لتوليد صفيحة ذات حجم معقول توفر مساحة سطح كافية لجمع سلسلة الميل عند التكبير المطلوب. يمكن تخفيف هذه المشكلة عن طريق طحن كتل من الخلايا الأصغر ، مثل البكتيريا أو الخميرة. عادة ما تملي سماكة الصفيحة النهائية (~ 100-300 نانومتر) من خلال سلامة العينة واستراتيجية الطحن. تعتبر الصفائح الرقيقة أفضل للعمل الهيكلي عالي الدقة ، مثل متوسط التصوير المقطعي الفرعي ، لكن الصفائح السميكة تحتوي على أحجام خلوية أكبر بكثير مما يمكن تحقيقه بواسطة CEMOVIS ، مما يوفر سياقا خلويا أكثر في عينة قريبة من المحفوظة أصلا. يمكن أيضا استخدام طحن FIB لرقيق بلورات البروتين المجمدة لدراسات حيود الإلكترون36.
يستحق طحن الخلايا الزجاجية FIB الوقت والجهد لتنفيذه إذا كان السؤال العلمي يتطلب تفاصيل جزيئية عالية الدقة للعينات شبه الأصلية في الموقع. مع إمكانية الوصول إلى المزيد من المرافق للإنتاج الروتيني للصفائح ، غالبا ما تكون خطوة تحديد المعدل هي تحسين العينة قبل الطحن ، حيث يجب أخذ الوقت للتأكد من أن العينة زجاجية وسمك مناسب لإنتاج صفائح قوية ورقيقة بشكل موحد. الموصوف هنا هو تحسين العينة لخلايا الدم الحمراء البشرية المجمدة التي تطحن FIB المصابة بطفيليات المتصورة المنجلية ، العامل المسبب للملاريا ، ولكن يمكن تكييف هذا النهج مع أي عينة معينة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>c-clips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Direct quote from Thermo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>Sub-angstrom</td>
			<td>CSA-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound 2</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-FIB specific autogrid rims</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1205101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E64</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emitech K100X glow discharge unit</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12633012</td>
			<td>Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>350864X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11562203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Sub-angstrom</td>
			<td>PB</td>
			<td>For clipped grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>For clipped grids - direct quote from Thermo Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Home-made manual plunge freezing rig</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human blood</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>UK National Blood and Transplant service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>n/a</td>
			<td>FIB-SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td>sputter coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE900</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td>e-beam rotary coater. In a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linkam cryo-stage for light microscope</td>
			<td>Linkam</td>
			<td>Model No. CMS196</td>
			<td>Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse E200 light microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C17nCuH2-01</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C17nCu20-01</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum PP3010 prep-chamber</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>n/a</td>
			<td>sputter coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage.</td>
			<td>FEI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>FIB-SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen</td>
			<td>Viking Direct</td>
			<td>ND538522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFS Titan Krios 300 kV TEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>TEM equipped with a K2 or K3 camera.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatmann grade 1 filter paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA1001150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Scope A1 light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td>with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography

يظهر هنا بروتوكول لتحضير الصفيحات البردية من الشبكات المجمدة من كريات الدم الحمراء البشرية المصابة بالمتصورة المنجلية ، والتي يمكن تكييفها بسهولة مع عينات بيولوجية أخرى. المبادئ الأساسية لإعداد العينات والطحن وعرض الصفائح مشتركة بين جميع الأدوات ويمكن اتباع البروتوكول كدليل عام لإعداد الصفيحة البردية على الشبكة للمجهر الإلكتروني بالتبريد (cryoEM) والتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد (cryoET). يتم تجميد شبكات المجهر الإلكتروني التي تدعم الخلايا في الإيثان السائل المبرد بالنيتروجين باستخدام مجمد غطس يدوي أو آلي ، ثم يتم فحصها على مجهر ضوئي مجهز بمرحلة التبريد. يتم نقل الشبكات المجمدة إلى مجهر إلكتروني ماسح بالتبريد مزود بحزمة أيونية مركزة (cryoFIB-SEM). يتم طلاء الشبكات بشكل روتيني قبل الطحن ، مما يساعد على تشتت تراكم الشحنة أثناء الطحن. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام طبقة دوارة e-beam لتطبيق طبقة من الكربون والبلاتين على الشبكات ، والتي يمكن التحكم في سمكها الدقيق بدقة أكبر. بمجرد دخول cryoFIB-SEM ، يتم تطبيق طلاء إضافي لمركب البلاتين العضوي على سطح الشبكة عبر نظام حقن الغاز (GIS). تحمي هذه الطبقة الحافة الأمامية للصفائح أثناء طحنها ، والتي تعتبر سلامتها أمرا بالغ الأهمية لتحقيق صفائح رقيقة بشكل موحد. يتم تحديد المناطق ذات الأهمية عبر SEM ويتم الطحن بطريقة تدريجية ، مما يقلل من تيار الحزمة الأيونية عندما تصل الصفيحة إلى شفافية الإلكترون ، من أجل تجنب توليد الحرارة الزائدة. ثم يتم نقل شبكة ذات صفائح متعددة إلى مجهر إلكتروني نافذ (TEM) في ظل ظروف مبردة لاكتساب سلسلة الميل. يعد سير العمل القوي والخالي من التلوث لإعداد الصفيحة خطوة أساسية لتقنيات المصب ، بما في ذلك cryoEM الخلوي ، و cryoET ، ومتوسط التصوير المقطعي الفرعي. ويحظى تطوير هذه التقنيات، لا سيما لرفع العينات المجمدة ذات الضغط العالي وطحنها، بأولوية عالية في هذا المجال.

Watch this Scientific Journal Video about Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

استخدام طحن الحزم الأيونية المركزة لإنتاج صفائح زجاجية على الشبكة من العينات البيولوجية المجمدة للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد.

تحضير الصفائح من العينات البيولوجية الزجاجية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ثنائي الحزمة للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

يحدد هذا البروتوكول تحضير الصفائح الزجاجية لخلايا الدم الحمراء المصابة بالمتصورة المنجلية للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد. وهذا يتيح المراقبة المباشرة للمعلومات الهيكلية التفصيلية حول كيفية تسبب الطفيلي في الملاريا. يسجل التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد معلومات عالية الدقة حول الدواخل الداخلية.إنه قوي بما يكفي لمراقبة مجمعات البروتين المفردة في الموقع ، والتي يمكن استخلاصها حسابيا ومتوسطها للكشف عن معلومات هيكلية ثلاثية الأبعاد حول البروتينات. يمكن تكييف هذا البروتوكول بسهولة مع أنواع الخلايا المختلفة ويمكن أن يكون نقطة انطلاق لشخص جديد في إنتاج الصفائح الزجاجية للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد. هذه هي أليخاندرا كارباجال، التي ستنفذ البروتوكول اليوم.للبدء ، قم بفحص الشبكات النحاسية المجمدة باستخدام CryoStage للحصول على مجهر ضوئي مع إيلاء اهتمام خاص لتدرج الجليد عبر الشبكة. تحقق من مربعات الشبكة الفردية لتغطية الخلايا في المناطق الرقيقة من الجليد. استخدم علامة سوداء لا تمحى لتحديد الجزء الأمامي والجانب الآخر من جنوط Autogrid الخاصة ب Cryo-FIB-SEM.قم بتحميل الشبكة المقطوعة في مكوك Cryo-FIB-SEM مع رفع جانب الكربون لأعلى ، وقم بتطبيق طبقة دوارة من الكربون أو البلاتين بسمك أربعة نانومتر على سطح الخلايا. قم بتحميل المكوك في Cryo-FIB-SEM وقم بتقييم توزيع الخلايا على كل شبكة بواسطة SEM عند خمسة كيلوفولت. ألق نظرة عامة على التكبير المنخفض عند 100 طاقة لإلقاء نظرة على التدرجات الجليدية عبر الشبكة.ثم التقط صورا تكبيرا أعلى عند طاقة 5000 للنظر إلى مربعات الشبكة الفردية. ضع طبقة من البلاتين العضوي 2 ميكرومتر على سطح كل شبكة عن طريق إدخال إبرة نظام حقن الغاز في الغرفة فوق الشبكة وتسخين مصدر البلاتين العضوي إلى درجة حرارة محددة لفترة محددة لإنتاج تدفق بخار. لمراقبة العينة ، قم بإمالة العينة بحيث يكون مستوى الشبكة حوالي 10 درجات من زاوية سقوط الحزمة الأيونية ، وحرك مركز مربع شبكة مناسب ليتم رؤيته في كل من صور SEM و FIB.باستخدام الحزمة الأيونية عند التيار المنخفض ، مسح الشبكة عند تكبير عال لتصور الخلايا في مركز مربع الشبكة. حدد نمطين مستطيلين للطحن ، أحدهما فوق والآخر أسفل منطقة محمية بسمك ثلاثة ميكرومترات. ثم اختر إعدادات الشعاع وقم بتصحيح الاستجماتيزم عن طريق ضبط السطوع والتباين.بعد اكتمال الإعداد ، ابدأ الطحن بتيار 300 بيكوأمبير أثناء مراقبة التقدم المباشر في عرض الحزمة الأيونية وبشكل متقطع بواسطة SEM. يتم فحص العينة في عرض SEM ، وبعد الطحن الأول ، إذا لم يخترق شعاع الأيونات العينة أعلى وأسفل المنطقة المحمية ، فقم بإزالة المزيد من المواد عن طريق زيادة ارتفاع الأنماط المستطيلة. توقف عن الطحن عندما يكون السطح أعلى وأسفل الصفيحة أملسا تماما في عرض الحزمة الأيونية.كرر عملية الطحن خطوة بخطوة ، مع تقليل تيار الحزمة الأيونية في كل مرة حتى يتم الوصول إلى سمك 300 نانومتر. سجل موضع X Y Z لكل صفيحة. لتلميع الصفائح في نهاية التجربة ، استخدم نظرة عامة على SEM منخفضة التكبير لتحديد مجموعة من الصفيحة المراد صقلها ووضع علامة على جذر التلميع.بمجرد وضع علامة على جذر التلميع ، قلل المسافة بين النمطين المستطيلين إلى 100 إلى 200 نانومتر وابدأ التلميع عند تيار شعاع أيوني يبلغ 30 بيكوأمبير. مراقبة التقدم من قبل SEM في اثنين إلى ثلاثة كيلوفولت. توقف عن التلميع عندما يفقد التباين في الصفيحة بواسطة SEM أو عندما يبدأ معطف البلاتين العضوي أو الصفيحة نفسها في فقدان النزاهة.احصل على صور SEM منخفضة التكبير لكل صفيحة واحفظها. بعد الانتهاء من التجربة ، قم بإزالة المكوك من المجهر. إزالة الشبكات مع الصفائح وتخزينها تحت النيتروجين السائل.تعامل مع الشبكات بعناية. لدراسة التشكل ، تم إيقاف الفصام في مراحل مختلفة من الخروج باستخدام المركب الثاني في مثبطات E-64. في وجود المركب الثاني ، كانت الحدود بين الأغشية الطفيلية والهيموجلوبين المحيط في خلية الدم الحمراء المضيفة محددة جيدا.كانت الفجوة الطفيلية السليمة ، أو PVs ، معبأة بالميروزويتات في مجموعة واحدة من بلورات الهيموزوين. عندما تم غسل مركبين متزامنين في E-64 ، تمزق الغشاء الكهروضوئي وانتشرت الميروزويتات داخل كرات الدم الحمراء. يوضح مثال نموذجي للتوزيع الجيد للخلايا على شبكة نحاسية خلايا دم حمراء كبيرة ذات محيط محدد جيدا وغشاء فجوة عصاري سليم.داخل خلية دم حمراء مضيفة منهارة جزئيا ، تم تصور الميروزويتات الفردية على أنها مجموعات خلايا صغيرة. كان لكل شيزونت بقعة سوداء في مركزها تشير إلى موضع بلورات الهيموزوين. بعد الطحن ، تم تحميل الشبكات في TEM لتحديد مواقع الصفائح وإيجاد مناطق مناسبة لاستهدافها بالتصوير المقطعي.في الصورة المجهرية للعينة ، يمكن رؤية كرات الدم الحمراء التي غزاها الميروزويت مؤخرا. يمكن رؤية الميروزويت المحاط بالغشاء المشتق من الخلية المضيفة داخل حدود كرات الدم الحمراء. في النهاية القمية للميروزويت، كان الأغشية المحيطان بالخلية والأغشية الأربعة المكدسة في قمة الميروزويت المرتبطة بميزة كثيفة الإلكترون على شكل فطر مرئية بوضوح.داخل سيتوبلازم الميروزويت ، تم تحديد حدث اندماج بين غشاء بلازما الميروزويت وحويصلة متعددة الطبقات. في تحليل TEM إضافي لصحيلة بسمك 230 نانومتر ، لوحظ التشكل النموذجي للميروزويت الناضج المعالج ب E-64. داخل غشاء خلايا الدم الحمراء ، يمكن رؤية غشاء بلازما الميروزويت مع عضيات مثل مركب الغشاء الداخلي ، والحلقات القطبية ، والميكرونيمات ، والجذور ، والغلاف النووي.الجزء الأكثر أهمية في هذه التقنية هو تحسين الشبكات لتمكين الإنتاج القابل للتكرار والفعال للصفائح الرقيقة. وسيمكن المزيد من التطوير لهذه التقنية الباحثين من تصور جزيئات البروتين الواحد داخل طفيليات الملاريا وتحديد دورها في خروج الملاريا.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

استخدام الإلكترون الرنين باراماجنيتيك في العينات البيولوجية في درجة الحرارة المحيطة و 77 ك

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

إعداد الشبكة السريعة للمجهر Cryo-Electron الذي تم حله زمنيا

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

إعداد و Cryo-FIB micromachining من Saccharomyces cerevisiae للتصوير المقطعي كريو إلكترون

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

المجهر أحادي الجسيمات كريو إلكترون: من عينة إلى هيكل

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

شبكات المجهر الإلكتروني للإرسال بالنمط المجهري لتحديد مواقع الخلايا مباشرة ضمن سير عمل التصوير المقطعي بالتبريد والإلكترون للخلية الكاملة

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

سير عمل قوي لمعالجة المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryo-EM) باستخدام cryoSPARC و RELION و Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

تحضير جسيمات النواة النيوكليوسوم المعقدة مع عوامل إصلاح الحمض النووي للتحديد الهيكلي للمجهر الإلكتروني بالتبريد

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

استخراج الأنابيب الدقيقة المعدلة من خلايا الثدييات لدراسة معقدات بروتين الأنابيب الدقيقة بواسطة المجهر الإلكتروني بالتبريد

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

تطبيق الجرافين أحادي الطبقة على شبكات المجهر الإلكتروني المبرد لتحديد الهيكل عالي الدقة

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...