Name: preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography
Uploaded: 2021-08-05T13:30:00
Duration: 7 min
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这项研究全部或部分由威康信托基金会资助（212916/Z/18/Z）。出于开放获取的目的，作者已对本提交的任何作者接受的手稿版本申请了CC BY公共版权许可。
开发该方法的这个项目由医学研究委员会授予Helen R. Saibil，Roland A. Fleck和Michael J. Blackman的MR / P010288 / 1赠款资助。 恶性疟原虫 的培养物在弗朗西斯·克里克研究所（The Francis Crick Institute）培育，得到了迈克尔·J·布莱克曼（Michael J. Blackman）小组成员的支持。作者要感谢Ser Ying （Michele） Tan博士在薄血涂片中提供了化合物2和E64处理的裂殖子的图像。大多数薄片是在eBIC工作人员的支持下生产的，我们非常感谢在研究提案NT21004上获得Scios双光束cryoFIB-SEM。作者还感谢皇家学会行业奖学金计划 （INF\R2\202061） 在 CUI 内继续开发 FIB 铣削技术方面的支持。作者还要感谢Helen R. Saibil对本方法论文和监督该项目的有益讨论。

人类血液是通过英国国家血液和移植服务从匿名献血者那里获得的，并在收到后 2 周内使用。其使用不需要道德批准。
1. 恶性疟原虫感染红细胞的制备和冷冻
<ol><li>通过在70%（v / v）等渗密度梯度培养基上离心（1,580 x g）分离成熟的裂殖子（有关如何在人红细胞中培养3D7 恶性疟原 虫无性血液阶段的标准程序见Blackman M.J.，199537）。</li>
	<li>用 100% 甲醇将风干的血膜固定在载玻片上，以检查裂子的形态均匀性，然后在 6.7 mM 磷酸盐缓冲液中用 10% Giemsa 染色，pH 7.1。 注意：为了丰富在特定出口点停滞的裂殖子的制备，裂殖子可以与化合物2和E64抑制剂进一步同步（参见 代表性结果 和 图1 ，了解这些抑制剂的作用）。 注意： 恶性疟原 虫是一种人类病原体，只能在符合当地健康和安全准则的合适收容设施中处理。</li>
	<li>轻轻离心裂殖剂（240 x g）以沉淀它们并重悬于RPMI培养基的2倍体积的细胞沉淀中，产生50%的血细胞比容悬浮液。</li>
	<li>在手动冷冻装置上，将 2.5 μL 裂殖物涂在辉光放电的碳侧（使用 60 秒、空气中 30 mA 的辉光放电单元设置，仅处理网格的碳侧） 200 目铜网格，带有 2/4 孔碳膜，并使用边缘撕裂的 1 级滤纸从网格背面印迹 ~20 秒。投入液氮冷却的液态乙烷中，并将网格转移到存储中（本研究中使用的设备参见材料表）。 注意：实验可以在此处暂停，网格可以无限期地存储在液氮下。 注意：液氮是一种窒息剂，会导致冻伤;在合适的环境中小心处理氧气监测。 注意：液态乙烷会导致严重灼伤并且易燃;在远离火源的通风橱中使用。 注意：切入冷冻裂子不再可行。这是通过将人类血液与几个空气解冻的冷冻裂子的金网格孵育并确定的，与未冷冻的对照相比，几天后观察到没有寄生虫生长。因此，使用正常的安全和去污程序（手套、用 >70% 乙醇对表面/工具进行灭菌和用 >70% 乙醇）处理栅块）可以在安全壳设施外处理冷冻格栅。</li>
	<li>使用光学显微镜的冷冻载物台筛选网格，特别注意网格上冰的梯度。在较薄的冰区，检查单个网格方块的细胞覆盖率。 注意：最好的正方形应该是网格正方形中心的一个单元格厚（图2）。这确保了薄片可以在正方形的中心铣削，而不会撞到网格杆边缘处较厚的冰。实验可以在这里暂停，网格可以无限期地储存在液氮下。如果细胞带有荧光标记物，也可以通过cryoLEEM筛选网格以定位感兴趣的X / Y位置，这可以与cryoFIB-SEM中的网格位置相关联以直接研磨。</li>
</ol>2. 切入冷冻细胞的并网FIB铣削
<ol><li>用黑色不可磨灭的记号笔标记 cryoFIB 专用自动网格轮辋的正面，以指示剖面部分的中心和轮辋的另一侧（图 3）。设置夹紧站并将网格夹入碳面朝下的标记环中。</li>
	<li>将网格加载到cryoFIB-SEM穿梭车（通常为2个网格，取决于穿梭车）碳面朝上，并在氩气气氛（5 x 10-2 mbar）（5 mA，持续60秒 - 厚度可变）或碳/铂电子束旋转涂层（~4 nm厚度）中涂覆铂溅射涂层到电池表面。 注意：两种类型的涂层都有助于在SEM成像过程中电荷分散。电子束旋转镀膜机的优点是可以指定涂层的确切厚度。</li>
	<li>将穿梭车加载到cryoFIB-SEM中，并通过SEM在5 kV（13 pA或25 pA）下评估每个网格上的细胞分布。以低放大倍率概览（~100倍）查看整个网格的冰梯度。然后，拍摄更高放大倍率（~5,000x）的图像以查看单个网格正方形，并确定网格中具有可见细胞特征和低表面污染的区域。</li>
	<li>使用气体注入系统（GIS）在每个网格的表面上涂上>2μm有机铂涂层。为此，将GIS针插入网格上方的腔室中，并将有机铂源加热至设定温度设定时间（例如，~27°C，持续3-10秒）以产生蒸汽流。 注意：应优化通过GIS针的有机铂涂层的涂覆角度，温度和时间，以最大限度地提高涂层的均匀性。这将取决于所使用的特定冷冻FIB-SEM（有关进一步说明，请参阅 代表性结果 ）。</li>
	<li>倾斜样品，使网格的平面与离子束的入射角成~10°，并移动合适的网格正方形的中心，以便在SEM和FIB图像中看到。</li>
	<li>使用离子束在低电流（标称值为1.5 pA，30 kV）下测量网格，并以足够高的放大倍率（~7,000x）可视化网格正方形中心的细胞。在第一个铣削电流（300 pA）下聚焦样品并校正散光。调整亮度和对比度，然后标记出两个要铣削的矩形图案，一个在 3 μm 厚的保护区域的上方，一个在下方，其中心是最终薄片的所需位置。 注意：图案的选择宽度将取决于周围细胞层的地形和细胞大小。7-20 μm 是适合裂殖子的宽度，但较宽的薄片需要更长的时间来铣削。第一个铣削步骤选择的图案高度取决于样品厚度，从大约 6 μm 开始;这可能需要在铣削过程中进行调整。铣削从图案的外侧顶部和底部边缘定向地朝向薄片表面进行。这可以并行完成，其中两个图案同时或顺序铣削，首先从薄片上方去除材料，然后从下方去除材料。</li>
	<li>在第一个电流下开始铣削;在离子束视图中监测实时进度，并通过 SEM（5 kV、13 或 25 pA）间歇性地监控。检查离子束是否穿透了受保护区域上方和下方的样品。如果没有，请增加矩形图案的高度以去除更多材料。当薄片上方和下方的表面在离子束视图中完全光滑时停止。 注意：当矩形图案的内部在焦平面中不包含任何特征时，离子束已经突破了受保护区域上方和下方的样品。某些功能（如网格条）在背景中可能会失焦。</li>
	<li>更改为下一个铣削电流 （100 pA）;对焦并调整亮度/对比度。将两个矩形图案之间的空间减小到 1.5 μm，并降低图案高度以仅覆盖未铣削的材料。以新的电流开始铣削，直到薄片上方和下方的表面完全光滑。</li>
	<li>逐步重复此过程，直到厚度达到0.3μm，每次根据 表1中的铣削方案减少离子束电流。</li>
	<li>在一个或两个网格上将几个薄片（量取决于样品的厚度和可用时间）研磨至0.3μm的厚度，记录每个薄片的X / Y / Z位置，并在会议结束时保留~1-2小时以将薄片抛光至其最终厚度（60-200nm）。</li>
	<li>对整个网格进行低放大倍率SEM概览，并规划从网格前部的薄片（靠近离子束源）到网格背面的薄片（离离子束源最远）的抛光路线（图5）。 注意： 这减少了烧蚀材料重新沉积回抛光薄片表面的情况。</li>
	<li>将两个矩形图案之间的空间减小到100-200nm，并在30pA的离子束电流下开始最后的抛光步骤。在 2-3 kV（13 pA，停留 = 300 n，3072 x 2048，全帧~2 s）下通过 SEM 监测 SEM 的进度，并在 SEM 在薄片中失去对比度或薄片本身的有机铂涂层开始失去完整性时停止抛光。</li>
	<li>在移除网格之前，获取整个网格的低放大倍率SEM图像并保存每个薄片的图像。稍后在 TEM 中使用它们交叉检查网格。在此处暂停实验并将带有薄片的网格存放在液氮下 - 小心处理。 注意：从cryoFIB-SEM中取出时，可以对网格进行轻微溅射涂覆，这有助于限制高倍率下TEM中的漂移和充电，但应谨慎进行，因为过多的溅射涂层会掩盖薄片内的生物内容物。在这个阶段可以筛选薄片的荧光;然而，获得足够的信号将取决于薄片厚度内标记蛋白质的丰度。必须非常小心地处理网格，以限制对薄片的损坏并防止表面污染。</li>
</ol>3. 倾斜串联采集和数据处理概述
<ol><li>将网格加载到TEM中，使铣削方向垂直于平台的倾斜轴对齐。 注意： 网格的对齐是使用自动网格边缘上的标记通过肉眼完成的。~10°的误差幅度是可以接受的，否则当网格倾斜时，薄片两侧的沟槽壁可能会遮挡薄片。</li>
	<li>获取整个网格的低放大倍率图（~150x）并定位薄片;然后，获取每个薄片的中等放大倍率图（~1,500x，取决于薄片大小）并定位感兴趣的区域。</li>
	<li>将网格预倾斜 ±10°，使薄片（不是网格）的平面垂直于光轴 注意：预倾斜的方向可以通过低倍率和中倍率图中薄片前缘的位置（寻找残留的有机铂涂层）来确定。对于此处使用的 TEM，如果薄片的前边缘在地图中指向上方，则网格需要 +10° 预倾斜，如果它们指向下方，则需要 -10° 预倾斜。每个网格可能由于拾取和插入自动加载器的方式而有所不同。</li>
	<li>以允许感兴趣区域所需的视场和分辨率的像素大小获取剂量对称倾斜系列38 （例如，-54° 至 +54°，增量为 3-5°）。使用介于 -2 和 -5 μm 之间的散焦值范围。以每个增量收集3-10帧的电影，为此，根据像素大小调整这些参数，以累积~150 e-/Å2 的总剂量（对于300 kV TEM）。 注意：应避免薄片上的裂缝，因为这些区域可能会漂移。还应避免表面污染，因为它可能会在高倾斜时遮挡感兴趣的区域或焦点区域。</li>
	<li>使用诸如MotionCor239之类的程序对影片进行运动校正。对校正后的图像（累积的e-/图像）40 施加剂量加权滤波器，并使用诸如CTFFIND441的程序估计每个图像的散焦。</li>
	<li>在 etomo （IMOD）42 等程序中使用无基准对齐（补丁跟踪）来计算倾斜系列中图像的对齐和角度关系。</li>
	<li>将对齐和旋转信息以及散焦值输入到可以应用三维CTF校正的程序（例如NovaCTF43）中。计算校正后的断层影像，以获得具有与下游分析相关的分箱因子的输出断层影像。</li>
	<li>分析重建并为任何下游处理做好准备，例如过滤、分割或子断层图平均。</li>
</ol>

作者没有什么可透露的。

虽然冷冻FIB研磨变得越来越常规，但制备用于研磨的最佳样品却没有;因此，该协议中的大多数关键步骤都发生在样品到达cryoFIB-SEM之前。在尝试研磨之前，需要通过多轮细胞制备、冷冻以及光学和电子显微镜筛选来优化样品，以生产出最佳样品。拥有最好的样品不仅可以增加成功的机会，还可以优化设备的使用。出于这个原因，大多数国家设施要求证明在给予机器时间之前已经进行了充分的优化。一旦进入冷冻FIB-SEM，最大限度地提高有机铂涂层的有效性对于产生均匀薄的薄片至关重要。最后，耐心和良好的样品处理是用户的必备技能，用户需要坐上多天，生产然后转移含有细腻薄片的网格。随着自动铣削策略47,48 的引入，这种情况可能会改变，但到目前为止，大多数工厂的整个铣削过程仍然主要是手动的。
虽然这项工作仅集中在 恶性疟原虫 裂殖质上，但这里介绍的方法可以很容易地修改，以优化其他细胞类型的网格制备和研磨。需要考虑的重要因素是应用于网格的细胞密度、网格类型（铜对某些细胞有毒）、碳膜中孔的大小和间距、印迹时间和印迹方法（单/双面、手动或自动）。此外，如果细胞在网格上生长（通常是带有孔状碳膜的金网格），则可以在印迹和冷冻之前通过光学显微镜检查汇合度。铣削策略取决于单元在网格上的沉积方式。对于疟疾感染的红细胞，网格基本上被一层完整的细胞覆盖，在某些区域更厚，在其他区域更薄。沿着这个梯度在一个区域的多个点进行铣削，其中冰厚度产生适合断层扫描尺寸的薄片。这种方法适用于较小的细胞，因为您可以通过多个细胞产生包含切片的薄片。对于较大的细胞或细胞团块，一个细胞或细胞团块可能产生一个薄片。
网格处理和样品转移仍然是该工作流程的主要挑战之一。由于破损或裂缝、遮挡生物学的帘子伪影、过度的表面污染以及 TEM 内的网格方向问题，薄片可能会丢失，需要额外的处理步骤来重新定位网格。损耗程度因日复一日、因电网而异，但随着时间的推移，通过实践和处理经验可以得到改善。在这项研究中，发现网格可以在自动加载器中多次小心地重新定向，而不会破坏薄片，这有时具有洗掉表面冰的好处。此工作流程的另一个主要限制是生成薄片所需的时间。由于生产缓慢，因此拥有适当优化的样品至关重要，以使铣削尽可能高效。
最近引入了许多对玻璃体生物样品的FIB研磨的适应。改变游戏规则的是，在cryoFIB-SEM腔室内实施低温冷却的提出工具，可以从高压冷冻样品中研磨更大的材料块。这些块可以连接到金属棒上，也可以在夹持器中拾取并移动到第二个样品位置，其中包含经过特殊修改的EM网格。然后可以用有机铂涂覆块并研磨以生成薄片。从高压冷冻材料中研磨薄片的能力意味着可以处理更大的细胞和组织，特别是通过相关荧光显微镜12靶向区域。最近对FIB铣削方法的其他调整包括通过楔形预铣削样品16，微流体冷冻固定49 和电子显微镜网格的光微图案化来减少窗帘伪影，以改善细胞分布50。此外，已经证明，铣削薄片两侧的微膨胀间隙可以减轻周围样品在达到最终厚度时的压缩51。这在铣削连续细胞层时可能特别有用，例如本研究中的样品，在最后的抛光步骤中有时会看到薄片弯曲。
电子显微镜的未来很可能是通过亚断层图平均法确定 原位 分子结构，而FIB铣削是一种重要的工具，有助于为这些类型的工作流程生产玻璃体生物样品。虽然FIB研磨在生物应用中仍处于起步阶段，但由于学术界和国家设施研究人员的辛勤工作，以及对开发cryoFIB-SEM技术以支持研究的商业投资，方法开发正在快速进行。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated from:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University
to:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
M. Alejandra Carbajal1 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

只有 <500 nm 厚的生物样品的细胞内容物才能在低温下通过透射电子显微镜 （TEM） 进行有效成像，从而将标本的范围限制在病毒、原核生物、简单的单细胞生物和较大真核细胞的较薄区域1.网格聚焦离子束 （FIB） 铣削可在低温 （< -150 °C） 下将较厚的切入冷冻生物样品变薄为电子透明薄片。然后将产生的薄片转移到TEM进行可视化和断层扫描数据收集，从而能够对细胞内的细胞和分子特征进行高分辨率3D重建（有关评论，请参阅Rigort等人，2012 2，Oikonomou等人，20163和Wagner等人，20204）。
FIB铣削源于材料科学领域，在该领域，样品通常会变薄，为下游分析做准备5。它在扫描电子显微镜（SEM）中进行，扫描电子显微镜具有两个光学柱：常规扫描电子显微镜光学元件和第二列包含能够产生和精细控制聚焦离子束（FIB）的光学元件 - 称为FIB-SEM。这允许样品的特定区域被镓源产生的离子烧蚀，去除多余的材料并留下薄片6。研磨过程由样品形貌的SEM成像引导，用于定位感兴趣区域并监控研磨进度。对于生物应用，基本设置大致相同，但研磨是在低温下进行的。这要求标准FIB-SEM适应具有低温冷却阶段，以保持恒定的温度和低表面污染率，以及气闸以促进样品转移而不会失透或污染。样品穿梭也经过修改，允许在cryoFIB-SEM内安装一系列不同的载体，包括TEM网格、平板和毛细管。几个关键的研究人员小组一直是这些方法的发展和该领域持续技术进步的核心7,8,9,10,11,12。商业解决方案现在更广泛地用于低温下的生物FIB铣削，并且考虑到优化的样品，薄片的网格铣削正变得越来越常规。
一系列室温和冷冻电镜技术可用于可视化所有生命尺度的细胞信息，从中等分辨率的整个多细胞生物到更详细地了解细胞水平复杂过程的背景，再到确定 in situ 分子结构13,14,15,16,17,18,19.经典的室温技术包括通过超薄切片法切片固定和染色的树脂嵌入细胞和组织，以通过TEM分析细胞形态（回顾见Studer等人，200820).已经开发了利用SEM二次电子散射对保存细胞块的表面进行成像的替代技术，然后用刀（连续块面成像）或聚焦离子束逐渐去除材料21,22,23.该技术也已在低温下成功实施（称为冷冻体积成像），在玻璃体、未染色的细胞或组织块上使用 cryoFIB-SEM24.或者，可以通过STEM成像铣削和研究较厚的薄片（~15μm厚）25.使用这些技术，可以对包含许多细胞的整个块进行成像以收集群体信息，或者可以在3D中对整个器官/生物体进行成像和重建。然而，为了从细胞中获取高分辨率分子信息，样品需要以接近天然的冷冻水合状态保存，因此需要在低温条件下制备。玻璃体切片的冷冻电子显微镜（CEMOVIS）是一种在低温条件下用超薄切片机对生物材料的高压冷冻块进行切片的技术。这会产生冷冻切片带（40-100 nm 厚）26，它们连接到 EM 网格并在 TEM 中成像。然而，刀与玻璃体样品的物理相互作用会导致裂缝和压迫伪影，从而严重扭曲细胞结构27,28,29,30.较厚的切片更容易出现这些伪影，因此使用厚度超过~70 nm的部分是不切实际的26.这种限制极大地限制了断层图中生物结构的3D视图。低温下的FIB铣削不会遇到这些问题，但由于试样各部分的铣削速率不同而产生自己的伪影，导致薄片内的厚度变化 - 称为窗帘。通过气体注入系统（GIS）应用有机铂涂层可以缓解此问题，该系统在铣削过程中保护薄片的前边缘31.网格FIB铣削的样品厚度上限由在保持样品玻璃体的同时切入冻结试样的能力来定义32，尽管随着冷冻提取技术和适用于生物标本的样品载体的引入，FIB 研磨也可用于处理高压冷冻样品31,33,34,35.此外，切入冷冻样品不能太薄，因为必须有足够的生物材料来生成合理大小的薄片，该薄片将提供足够的表面积以所需的放大倍数收集倾斜系列。这个问题可以通过铣削较小细胞团块（如细菌或酵母）来缓解。最终薄片厚度（~100-300 nm）通常由样品完整性和铣削策略决定。较薄的薄片更适合高分辨率的结构工作，例如亚断层扫描平均，但较厚的薄片包含比CEMOVIS可以实现的更大的细胞体积，从而在接近天然保存的样品中提供更多的细胞环境。FIB研磨也可用于稀释冷冻蛋白质晶体以进行电子衍射研究36.
如果科学问题需要 原位近天然标本的高分辨率分子细节，则玻璃体细胞的FIB铣削值得花时间和精力进行。随着更多用于常规生产薄片的设施，限速步骤通常是在研磨之前优化样品，此时必须花时间确保样品是玻璃体的，并且厚度合适，以产生坚固且均匀薄的薄片。这里描述的是感染恶 性疟原 虫（疟疾病原体）的FIB研磨切入冷冻人红细胞的样品优化，但这种方法可以适用于任何给定的样品。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>c-clips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Direct quote from Thermo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>Sub-angstrom</td>
			<td>CSA-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound 2</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-FIB specific autogrid rims</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1205101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E64</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emitech K100X glow discharge unit</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12633012</td>
			<td>Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>350864X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11562203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Sub-angstrom</td>
			<td>PB</td>
			<td>For clipped grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>For clipped grids - direct quote from Thermo Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Home-made manual plunge freezing rig</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human blood</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>UK National Blood and Transplant service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>n/a</td>
			<td>FIB-SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td>sputter coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE900</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td>e-beam rotary coater. In a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linkam cryo-stage for light microscope</td>
			<td>Linkam</td>
			<td>Model No. CMS196</td>
			<td>Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse E200 light microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C17nCuH2-01</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C17nCu20-01</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum PP3010 prep-chamber</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>n/a</td>
			<td>sputter coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage.</td>
			<td>FEI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>FIB-SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen</td>
			<td>Viking Direct</td>
			<td>ND538522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFS Titan Krios 300 kV TEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>TEM equipped with a K2 or K3 camera.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatmann grade 1 filter paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA1001150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Scope A1 light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td>with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography

这里介绍的是从 恶性疟原虫感染的人红细胞的冷冻网格中制备冷冻薄片的方案，可以很容易地适用于其他生物样品。制备样品、研磨和观察薄片的基本原理对于所有仪器都是通用的，该协议可以作为用于冷冻电子显微镜 （cryoEM） 和冷冻电子断层扫描 （cryoET） 的并网冷冻薄片制备的一般指南。使用手动或自动冷冻机将支撑细胞的电子显微镜网格冷冻到液氮冷却的液态乙烷中，然后在配备冷冻台的光学显微镜上进行筛选。冷冻网格被转移到配备聚焦离子束（cryoFIB-SEM）的冷冻扫描电子显微镜中。网格在铣削前通常进行溅射镀膜，这有助于在铣削过程中分散电荷积聚。或者，可以使用电子束旋转镀膜机在网格上涂上一层碳铂，可以更精确地控制其确切厚度。一旦进入冷冻FIB-SEM，通过气体注入系统（GIS）将有机铂化合物的附加涂层涂覆到网格表面。该层在铣削时保护薄片的前边缘，其完整性对于实现均匀薄的薄片至关重要。通过SEM识别感兴趣的区域，并以逐步的方式进行铣削，当薄片达到电子透明度时减少离子束的电流，以避免产生过多的热量。然后将具有多个薄片的网格在低温条件下转移到透射电子显微镜（TEM）中进行倾斜串联采集。用于薄片制备的稳定且无污染的工作流程是下游技术的重要步骤，包括细胞冷冻电镜、冷冻电子管和亚断层图平均。开发这些技术，特别是用于高压冷冻样品的提出和研磨，是该领域的重中之重。

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Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

使用聚焦离子束铣削从冷冻生物样品中产生玻璃体网格片，用于冷冻电子断层扫描。

使用双光束扫描电子显微镜从玻璃体生物样品制备薄片进行冷冻电子断层扫描

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

该协议概述了用于冷冻电子断层扫描的恶性疟原虫感染红细胞玻璃体薄片的制备。这样就可以直接观察有关寄生虫如何引起疟疾的详细结构信息。冷冻电子断层扫描记录有关细胞内部的高分辨率信息。它足够强大，可以原位观察单个蛋白质复合物，可以通过计算提取和平均来揭示蛋白质的三维结构信息。该协议可以很容易地适应不同的细胞类型，并且可以作为刚开始生产玻璃体薄片用于冷冻电子断层扫描的人的起点。这是亚历杭德拉·卡巴哈尔，他今天将执行协议。首先，使用光学显微镜的冷冻载物台筛选冷冻铜网格，特别注意网格上冰的梯度。检查单个网格方块在较薄的冰区中的细胞覆盖率。使用黑色不可磨灭的标记标记冷冻FIB-SEM专用自动网格轮辋的正面和另一侧。将夹住的网格装入 Cryo-FIB-SEM 穿梭车中，碳面朝上，并在细胞表面涂上四纳米厚的碳或铂电子束旋转涂层。将穿梭车加载到冷冻FIB-SEM中，并通过SEM在5千伏下评估每个网格上的细胞分布。以 100 次方的低放大倍率概览查看整个网格的冰梯度。然后以5， 000次方拍摄更高放大倍率的图像，以查看单个网格正方形。通过将气体注入系统针插入网格上方的腔室并将有机铂源加热到设定温度设定的时间内以产生蒸汽流，在每个网格的表面上涂上两微米的有机铂涂层。要观察样品，请倾斜样品，使网格的平面与离子束的入射角成大约10度，并移动合适的网格正方形的中心，以便在SEM和FIB图像中看到。使用低电流下的离子束，以高放大倍率测量网格以可视化网格正方形中心的细胞。标记出两个要铣削的矩形图案，一个在三微米厚的保护区域上方，一个在下方。然后选择光束设置并通过调整亮度和对比度来校正散光。设置完成后，以 300 皮安的电流开始铣削，同时在离子束视图中监控实时进度，并通过 SEM 间歇性地监控。在SEM视图中检查样品，并在第一次铣削后，如果离子束没有穿过受保护区域上方和下方的样品，则通过增加矩形图案的高度来去除更多材料。当薄片上方和下方的表面在离子束视图中完全光滑时停止铣削。逐步重复研磨过程，每次减少离子束电流，直到达到300纳米的厚度。记录每个薄片的 X Y Z 位置。要在实验结束时抛光薄片，请使用低倍率SEM概览选择要抛光的一组薄片并标记抛光根部。标记抛光根部后，将两个矩形图案之间的空间减小到 100 到 200 纳米，并以 30 皮安的离子束电流开始抛光。通过 SEM 在两到三千伏电压下监控进度。当薄片中的对比度被SEM丢失或有机铂涂层或薄片本身开始失去完整性时，停止抛光。获取并保存每个薄片的低放大倍率 SEM 图像。实验完成后，从显微镜上取下梭子。取出带有薄片的网格并将其储存在液氮下。小心处理网格。为了研究形态学，使用E-64抑制剂中的化合物2将裂殖子停滞在出口的不同阶段。在化合物二存在下，寄生虫膜与宿主红细胞中周围血红蛋白之间的边界是明确的。完整的寄生液泡或PVs在单个血红素晶体簇中填充了裂殖子。当化合物两个同步裂殖子被洗涤到E-64中时，PV膜破裂，裂殖子在红细胞内扩散。铜网格上良好细胞分布的典型例子显示具有明确外围和完整液泡膜的大红细胞。在部分塌陷的宿主红细胞内，单个裂殖子被可视化为小细胞簇。每个裂殖子的中心都有一个黑点，指示血红素晶体的位置。铣削后，将网格加载到TEM中，以确定薄片的位置，并通过断层扫描找到合适的目标区域。在样品显微照片中，可以看到最近被裂殖子侵入的红细胞。在红细胞边界内可以看到被宿主细胞衍生膜包围的裂殖子。在裂殖子的顶端，围绕细胞的两层膜和堆叠在与电子致密蘑菇形特征相关的裂殖子顶端的四层膜清晰可见。在裂殖子的细胞质内，鉴定出裂殖子质膜和多层囊泡之间的融合事件。在对 230 纳米厚的薄片进行的额外 TEM 分析中，观察到用 E-64 处理的成熟裂殖子的典型形态。在红细胞膜内，可以看到裂殖子质膜与细胞器一起出现，如内膜复合物、极环、微克涅糖、罗氏体和核包膜。该技术最重要的部分是优化网格，以实现可重复和高效的薄片生产。该技术的进一步发展将使研究人员能够可视化疟疾寄生虫中的单蛋白分子，并确定它们在疟疾出口中的作用。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

电子顺磁共振在生物样品环境温度和 77 k 的应用

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

科研

生物化学

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

快速网格准备时间解决低温电子显微镜

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

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冷冻电子断层扫描 的糖核 酸的准备和冷冻-FIB微加工

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

单颗粒冷冻电子显微镜：从样品到结构

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

微图案透射电子显微镜网格，用于在全细胞冷冻电子断层扫描工作流程中指导细胞定位

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

强大的单颗粒冷冻电子显微镜 （cryo-EM） 处理工作流程，具有冷冻 SPARC、RELION 和 Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

制备与DNA修复因子络合的核小体核心颗粒用于冷冻电镜结构测定

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

从哺乳动物细胞中提取修饰的微管以通过冷冻电子显微镜研究微管 - 蛋白质复合物

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

单层石墨烯在冷冻电子显微镜网格中的应用，用于高分辨率结构测定

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...