Name: preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography
Uploaded: 2021-08-05T13:30:00
Duration: 7 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Denne forskning blev finansieret helt eller delvist af Wellcome Trust (212916/Z/18/Z). Med henblik på fri adgang har forfatteren anvendt en CC BY offentlig ophavsretslicens på enhver forfatteraccepteret manuskriptversion, der opstår som følge af denne indsendelse.
Dette projekt, som denne metode blev udviklet til, blev finansieret af et Medical Research Council-tilskud MR / P010288 / 1 tildelt Helen R. Saibil, Roland A. Fleck og Michael J. Blackman. Kulturer af P. falciparum blev dyrket på The Francis Crick Institute med støtte fra medlemmer af Michael J. Blackmans gruppe. Forfatterne vil gerne takke Dr. Ser Ying (Michele) Tan for at give billederne af forbindelse 2 og E64-behandlede skizonts i tynde blodudstrygninger. De fleste lameller blev produceret med støtte fra personale på eBIC, og vi er taknemmelige for adgang til Scios dual-beam cryoFIB-SEM på forskningsforslag NT21004. Forfatterne anerkender også støtten fra Royal Society Industry Fellowship-ordningen (INF\R2\202061) til at fortsætte udviklingen af FIB-fræseteknikken inden for CUI. Forfatterne vil også gerne takke Helen R. Saibil for nyttige diskussioner i forhold til dette metodepapir og tilsyn med projektet.

Humant blod blev opnået fra anonymiserede donorer gennem UK National Blood and Transplant service og bruges inden for 2 uger efter modtagelsen. Der kræves ingen etisk godkendelse til brugen.
1. Forberedelse og nedfrysning af Plasmodium falciparum-inficerede røde blodlegemer
<ol><li>Modne skizonter isoleres ved centrifugering (1.580 x g) over et 70% (v/v) isotonisk densitetsgradientmedium (for standardprocedurer for, hvordan man dyrker aseksuelle blodstadier af 3D7 Plasmodium falciparum i humane erytrocytter, se Blackman, M.J., 1995:37).</li>
	<li>Fastgør de lufttørrede tynde blodfilm på et glasglas med 100% methanol for at kontrollere skizonternes morfologiske homogenitet, før de farves med 10% Giemsa-plet i 6,7 mM fosfatbuffer, pH 7,1. BEMÆRK: For at berige præparatet til skizonter, der er gået i stå ved bestemte udgangspunkter, kan skizonter synkroniseres yderligere med forbindelse 2- og E64-hæmmere (se repræsentative resultater og figur 1 for en forklaring af virkningen af disse hæmmere). FORSIGTIG: Plasmodium falciparum er et humant patogen og må kun håndteres i et egnet indeslutningsanlæg i henhold til lokale sundheds- og sikkerhedsretningslinjer.</li>
	<li>Skithajoner centrifugeres forsigtigt (240 x g) for at pelletere dem og resuspenderes i 2x volumen af cellepelleten i RPMI-medier, hvilket resulterer i en 50% hæmatokrit suspension.</li>
	<li>På en manuel dykfrysningsrig påføres 2,5 μL skizonts på kulstofsiden af en glødudladet (Brug glødudladningsenhedsindstillinger på 60 s, 30 mA i luft, kun behandling af kulstofsiden af gitteret) 200 mesh kobbergitter med en 2/4 hullet kulstoffilm og blots for ~ 20 s fra bagsiden af gitteret ved hjælp af klasse 1 filterpapir med en revet kant. Dyk ned i flydende nitrogenkølet flydende ethan og overfør gitterene til opbevaring (se materialetabel for udstyr, der anvendes i denne undersøgelse). BEMÆRK: Eksperimentet kan sættes på pause her, og gitre kan opbevares under flydende nitrogen på ubestemt tid. FORSIGTIG: Flydende nitrogen er et kvælende middel og forårsager forfrysninger; Håndter forsigtigt i et egnet miljø med iltovervågning. FORSIGTIG: Flydende ethan forårsager alvorlige forbrændinger og er brandfarlig; Brug i en damphætte væk fra antændelseskilder. BEMÆRK: Dyk frosne schizonts er ikke længere levedygtige. Dette blev bestemt ved at inkubere humant blod med flere guldgitter af luftoptøede dykfrosne skizonter og observere ingen parasitvækst efter flere dage sammenlignet med ikke-frosne kontroller. Frosne riste af skizonter er derfor sikre at håndtere uden for indeslutningsfaciliteter ved hjælp af normale sikkerheds- og dekontamineringsprocedurer (handsker, overflade-/værktøjssterilisering med >70% ethanol og bortskaffelse af riste i >70% ethanol).</li>
	<li>Screene gitre ved hjælp af et kryo-trin til et lysmikroskop, idet der lægges særlig vægt på isgradienten over gitteret. I de tyndere isområder skal du kontrollere individuelle gitterfirkanter for celledækning. BEMÆRK: De bedste firkanter skal være en celle tyk i midten af gitterkvadratet (figur 2). Dette sikrer, at en lamel kan fræses hen over midten af firkanten uden at ramme den tykkere is i kanterne mod gitterstængerne. Forsøget kan sættes på pause her, og gitre kan opbevares under flydende nitrogen på ubestemt tid. Hvis celler bærer en fluorescerende markør, kan gitre også screenes af cryoCLEM for at lokalisere X/Y-positioner af interesse, som kan korreleres med gitterplaceringer i cryoFIB-SEM til direkte fræsning.</li>
</ol>2. On-grid FIB-fræsning af dykfrosne celler
<ol><li>Marker fronten af cryoFIB-specifikke autogridfælge med en sort uudslettelig markeringspen for at angive midten af cutaway-sektionen og den modsatte side af fælgen (figur 3). Opsæt fritlægningsstationen og klipgitre i de markerede ringe med kulstofsiden nedad.</li>
	<li>Læg gitre i cryoFIB-SEM-shuttlen (typisk 2 gitre, afhængigt af rumfærgen) kulstofsiden opad og påfør en platinsputterbelægning i argonatmosfære (5 x 10-2 mbar) (5 mA i 60 s - tykkelsen er variabel) eller en kulstof/platin e-stråle roterende belægning (~4 nm tykkelse) på overfladen af cellerne. BEMÆRK: Begge typer belægninger hjælper ladningsspredning under SEM-billeddannelse. Fordelen ved e-beam roterende coater er, at den nøjagtige tykkelse af belægningen kan specificeres.</li>
	<li>Læg rumfærgen i cryoFIB-SEM, og vurder cellefordelingen på hvert net ved hjælp af SEM ved 5 kV (13 pA eller 25 pA). Tag en oversigt over lav forstørrelse (~100x) for at se på isgradienter på tværs af gitteret. Tag derefter billeder med højere forstørrelse (~5.000x) for at se på individuelle gitterkvadrater og identificere de områder af gitteret, der har synlige cellulære egenskaber og lav overfladeforurening til fræsning.</li>
	<li>Påfør en >2 μm organoplatinbelægning på overfladen af hvert gitter ved hjælp af gasindsprøjtningssystemet (GIS). For at gøre dette skal du indsætte GIS-nålen i kammeret over gitteret og opvarme organoplatinkilden til en indstillet temperatur i et bestemt tidsrum (for eksempel ~ 27 ° C i 3-10 s) for at producere en dampstrøm. BEMÆRK: Påføringsvinklen, temperaturen og timingen af organoplatinbelægningen via GIS-nålen skal optimeres for at maksimere en jævn belægning. Dette afhænger af den specifikke anvendte cryoFIB-SEM (se Repræsentative resultater for yderligere forklaring).</li>
	<li>Vip prøven, så gitterplanet er ~10° fra ionstrålens indfaldsvinkel, og flyt midten af et passende gitterkvadrat, der kan ses på både SEM- og FIB-billederne.</li>
	<li>Undersøg gitteret ved hjælp af ionstrålen ved lav strøm (nominelt 1,5 pA, 30 kV) og gå til høj nok forstørrelse (~ 7.000x) til at visualisere cellerne i midten af et gitterkvadrat. Bring prøven i fokus ved den første fræsestrøm (300 pA) og korriger for bygningsfejl. Juster lysstyrken og kontrasten, og markér derefter to rektangulære mønstre til fræsning, et over og et under et 3 μm tykt beskyttet område, hvis centrum er den ønskede placering af den endelige lamell. BEMÆRK: Den valgte bredde af mønstrene afhænger af topografien af det omgivende cellelag og cellestørrelsen. 7-20 μm er en passende bredde til schizonts, men bredere lameller tager længere tid at fræse. Den valgte højde af mønstrene til det første fræsetrin afhænger af prøvetykkelsen, der starter omkring 6 μm; Dette skal muligvis justeres under fræsning. Fræsning udføres retningsbestemt fra ydersiden, top- og bundkanterne af mønstrene mod lamellens overflade. Dette kan gøres parallelt, hvor begge mønstre fræses samtidigt eller sekventielt, først fjernes materiale ovenfra lamellen og derefter nedefra.</li>
	<li>Start fræsning ved første strøm; overvåge live-fremskridtene i ionstrålevisningen og periodisk med SEM (5 kV, 13 eller 25 pA). Kontroller, at ionstrålen er brudt igennem prøven over og under det beskyttede område. Hvis ikke, skal du øge højden på de rektangulære mønstre for at fjerne mere materiale. Stop, når overfladen over og under lamellen er helt glat i ionstrålevisningen. BEMÆRK: Ionstrålen er brudt igennem prøven over og under det beskyttede område, når indersiden af de rektangulære mønstre ikke indeholder nogen funktioner i brændplanet. Nogle funktioner, f.eks. gitterbjælker, kan være synlige ude af fokus i baggrunden.</li>
	<li>Skift til den næste fræsestrøm (100 pA); Fokuser og juster lysstyrken/kontrasten. Formindsk afstanden mellem de to rektangulære mønstre til 1,5 μm, og reducer mønsterhøjden til kun at dække det ikke-fræsede materiale. Begynd fræsning ved den nye strøm, indtil overfladen over og under lamellen er helt glat.</li>
	<li>Gentag denne proces trinvis, indtil en tykkelse på 0,3 μm er nået, hvilket reducerer ionstrålestrømmen hver gang i henhold til fræseskemaet i tabel 1.</li>
	<li>Fræs flere lameller (mængden afhænger af prøvens tykkelse og den tid, der er til rådighed) på et eller begge gitter til en tykkelse på 0,3 μm, registrer X/Y/Z-positionen for hver lamel og reserver ~1-2 timer ved sessionens afslutning for at polere lamellerne til deres endelige tykkelse (60-200 nm).</li>
	<li>Tag en SEM-oversigt med lav forstørrelse over hele gitteret, og planlæg en poleringsrute, der starter fra lameller foran på gitteret (tættere på ionstrålekilden) til lameller bag på gitteret (længst væk fra ionstrålekilden) (figur 5). BEMÆRK: Dette reducerer gendeponering af ableret materiale tilbage på overfladen af polerede lameller.</li>
	<li>Reducer mellemrummet mellem de to rektangulære mønstre til 100-200 nm, og start det endelige poleringstrin ved en ionstrålestrøm på 30 pA. Overvåg fremskridtene med SEM ved 2-3 kV (13 pA, dvæle = 300 n, 3072 x 2048, ~ 2 s for en fuld ramme) og stop poleringen, når kontrasten går tabt i lamellen ved SEM, eller når selve lamellens organoplatinbelægning begynder at miste integriteten.</li>
	<li>Før du fjerner gitterene, skal du erhverve et SEM-billede med lav forstørrelse af hele gitteret og gemme billeder af hver lamel. Brug dem til at krydstjekke gitteret senere i TEM. Sæt eksperimentet på pause her og opbevar gitterene med lameller under flydende nitrogen - håndter forsigtigt. BEMÆRK: Gitre kan være let sputtercoatede ved fjernelse fra cryoFIB-SEM, hvilket kan hjælpe med at begrænse afdrift og opladning i TEM ved høj forstørrelse, men dette bør gøres forsigtigt, da for meget sputterbelægning kan skjule det biologiske indhold inde i lamellerne. Det er muligt at screene lameller for fluorescens på dette stadium; Imidlertid vil opnåelse af nok signal afhænge af overflod af det mærkede protein inden for lamellens tykkelse. Der skal udvises stor omhu ved håndtering af gitterene for at begrænse skader på lamellerne og forhindre overfladeforurening.</li>
</ol>3. Tilt-serie erhvervelse og generelt overblik over databehandling
<ol><li>Indlæs ristene i TEM, og juster fræseretningen vinkelret på trinnets hældningsakse. BEMÆRK: Justering af gitterene udføres med øjet ved hjælp af mærkerne på autogrid-fælgen. En ~ 10 ° fejlmargin er acceptabel, ellers kan grøftens vægge på hver side af lamellen skjule lamellen, når gitteret vippes.</li>
	<li>Få et kort med lav forstørrelse (~ 150x) over hele gitteret, og find lamellerne; Derefter skal du få et mellemstort kort (~ 1.500x, afhængigt af lamelstørrelse) af hver lamel og finde interesseområderne.</li>
	<li>Gitteret vippes med ±10° for at gøre lamellens plan (ikke gitteret) vinkelret på den optiske akse BEMÆRK: Forhældningsretningen kan bestemmes af placeringen af lamellernes forkant (idet der ses efter den resterende organiske platinpels) på kortene med lav og medium forstørrelse. For TEM, der anvendes her, kræver gitre en +10° forhældning, hvis lamellernes forkanter peger opad på kortene, og kræver en -10° forhældning, hvis de peger nedad. Hvert gitter kan være forskelligt på grund af, hvordan de blev hentet og indsat i autoloaderen.</li>
	<li>Få dosissymmetrisk hældningsserie38 (f.eks. -54° til +54° med en stigning på 3-5°) ved en pixelstørrelse, der tillader både synsfelt og opløsning, der kræves for det relevante område. Brug et interval af defokuseringsværdier mellem -2 og -5 μm. Saml film med 3-10 billeder ved hvert trin, og juster disse parametre afhængigt af pixelstørrelsen for at akkumulere en samlet dosis på ~ 150 e / Å2 (for en 300 kV TEM). BEMÆRK: Revner i lamellen bør undgås, da disse områder kan drive. Overfladekontaminering bør også undgås, da det kan skjule interesseområdet eller fokusområdet ved høj hældning.</li>
	<li>Bevægelseskorriger filmene ved hjælp af et program som MotionCor239. Anvend et dosisvægtningsfilter på de korrigerede billeder (akkumuleret e-/billede)40 , og estimer defokuseringen af hvert billede ved hjælp af et program som CTFFIND441.</li>
	<li>Brug fiducial-less alignment (patch tracking) i et program som på etomo (IMOD)42 til at beregne justeringen og vinkelforholdet mellem billederne i tilt-serien.</li>
	<li>Indtast justerings- og rotationsoplysningerne sammen med defokuseringsværdierne i et program, der kan anvende tredimensionel CTF-korrektion, for eksempel NovaCTF43. Beregn et korrigeret tomogram for at få outputtomogrammer med binningfaktorer, der er relevante for downstream-analyse.</li>
	<li>Analyser rekonstruktionerne, og forbered dig på eventuel downstream-behandling, f.eks. filtrering, segmentering eller subtomogramgennemsnit.</li>
</ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Mens kryoFIB-fræsning bliver mere rutinemæssig, har forberedelse af optimale prøver til fræsning ikke; derfor forekommer de fleste af de kritiske trin i denne protokol, før prøven når cryoFIB-SEM. Prøveoptimering ved flere runder af celleforberedelse, dykfrysning og screening ved lys- og elektronmikroskopi er påkrævet for at producere den bedst mulige prøve, før fræsning forsøges. At have den bedst mulige prøve øger ikke kun chancerne for succes, men optimerer også brugen af udstyret. Af denne grund kræver de fleste nationale faciliteter bevis for, at der er udført tilstrækkelig optimering, før de giver tid på deres maskiner. Når du er inde i cryoFIB-SEM, er det afgørende at maksimere effektiviteten af organoplatinbelægningen for at producere ensartet tynde lameller. Endelig er tålmodighed og god prøvehåndtering en forudsætning for brugeren, som skal sidde i flere dage og producere og derefter overføre gitre indeholdende sarte lameller. Dette kan ændre sig med introduktionen af automatiserede fræsestrategier47,48, men endnu er hele fræseprocessen stadig stort set manuel på de fleste faciliteter.
Mens arbejdet udelukkende fokuserede på P. falciparum schizonts, kunne metoden, der præsenteres her, let ændres for at optimere gitterforberedelse og fræsning til andre celletyper. Vigtige faktorer, der skal overvejes, er tætheden af de celler, der påføres gitteret, gittertypen (kobber er giftigt for nogle celler), størrelsen og afstanden mellem huller i kulstoffilmen, blottingtiden og metoden til blotting (enkelt / dobbeltsidet, manuel eller automatiseret). Derudover, hvis cellerne dyrkes på gitterene (normalt guldgitter med en hullet kulstoffilm), kan sammenløbet kontrolleres ved lysmikroskopi, før de blottes og fryses. Fræsestrategien afhænger af, hvordan cellerne deponeres på nettet. For malariainficerede røde blodlegemer er gitteret i det væsentlige belagt med et ubrudt lag af celler, tykkere i nogle områder og tyndere i andre områder. Fræsning udføres på flere punkter i et område langs denne gradient, hvor istykkelsen genererer lameller, der er en passende størrelse til tomografi. Denne fremgangsmåde fungerer godt for mindre celler, da du kan producere lameller, der indeholder en skive gennem flere celler. For større celler eller klumper af celler kan det være tilfældet, at en celle eller celleklump kan producere en lameller.
Nethåndtering og prøveoverførsel er fortsat en af de største udfordringer i denne arbejdsgang. Lameller kan gå tabt på grund af brud eller revner, gardinartefakter, der skjuler biologien, overdreven overfladeforurening samt netorienteringsproblemer inden for TEM, hvilket kræver et ekstra håndteringstrin for at omplacere gitteret. Graden af tab varierer fra dag til dag og grid-to-grid, men det forbedres gennem praksis og håndteringserfaring over tid. I denne undersøgelse blev det konstateret, at gitterene omhyggeligt kan omorienteres i autoloaderen flere gange uden at ødelægge lameller, og dette har undertiden fordelen ved at vaske overfladeis af. En anden hovedbegrænsning ved denne arbejdsgang er den tid, det tager at producere lameller. Da produktionen er langsom, er det afgørende at have en korrekt optimeret prøve, hvilket gør fræsningen så effektiv som muligt.
Der er for nylig indført en række tilpasninger til FIB-formaling af glasagtige biologiske prøver. En game-changer er implementeringen af kryogenkølede løfteværktøjer i cryoFIB-SEM-kammeret, der gør det muligt at fræse større blokke af materiale fra højtryksfrosne prøver. Blokkene kan fastgøres til en metalstang eller samles op i en griber og flyttes til en anden prøveposition, der indeholder et specielt modificeret EM-gitter. Blokkene kan derefter overtrækkes med organoplatinum og fræses for at generere lameller. Evnen til at fræse lameller fra højtryksfrosset materiale betyder, at meget større celler og væv kan behandles, specifikt målrettet områder ved korrelativ fluorescensmikroskopi12. Andre nylige tilpasninger af FIB-fræsningsmetoden omfatter reduktion af gardinartefakter ved kileforfræsning af prøven16, mikrofluidisk kryofiksering49 og fotomikromønster af elektronmikroskopigitter for at forbedre cellefordeling50. Det er også blevet påvist, at fræsning af mikroekspansionshuller på hver side af en lamel kan lindre kompression af den omgivende prøve, når den når sin endelige tyndhed51. Dette kan især være nyttigt ved fræsning af kontinuerlige cellelag, såsom prøven i denne undersøgelse, hvor bøjning af lameller undertiden ses under det sidste poleringstrin.
Fremtiden for elektronmikroskopi vil sandsynligvis være bestemmelse af in situ molekylære strukturer ved sub-tomogram gennemsnit, og FIB-fræsning er et vigtigt værktøj, der vil lette produktionen af glasagtige biologiske prøver til denne type arbejdsgange. Mens FIB-fræsning stadig er i sin barndom for biologiske anvendelser, sker metodeudviklingen i et hurtigt tempo takket være hårdt arbejde fra forskere, både akademiske og nationale faciliteter, plus kommercielle investeringer i udvikling af kryoFIB-SEM-teknologi til støtte for forskning.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated from:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University
to:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
M. Alejandra Carbajal1 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Kun det cellulære indhold af biologiske prøver <500 nm tykke kan afbildes effektivt ved transmissionselektronmikroskopi (TEM) ved kryogene temperaturer, hvilket begrænser prøveområdet til vira, prokaryoter, simple encellede organismer og tyndere områder af større eukaryote celler1. On-grid fokuseret ionstråle (FIB)-fræsning gør det muligt at tynde tykkere dykfrosne biologiske prøver til elektrongennemsigtige lameller ved kryogene temperaturer (< -150 °C). De resulterende lameller overføres derefter til en TEM til visualisering og tomografisk dataindsamling, hvilket muliggør 3D-rekonstruktioner i høj opløsning af de cellulære og molekylære egenskaber inde i celler (for anmeldelser se Rigort et al., 20122, Oikonomou et al., 20163, og Wagner et al., 20204).
FIB-fræsning opstod inden for materialevidenskab, hvor prøver rutinemæssigt tyndes for at forberede dem til downstream-analyse5. Det udføres i et scanningelektronmikroskop (SEM), som har to optiske søjler: konventionel scanningelektronmikroskopoptik og en anden kolonne indeholdende optik, der er i stand til at generere og fint styre en fokuseret ionstråle (FIB) - kaldet en FIB-SEM. Dette gør det muligt at ablere et bestemt område af prøven af ioner genereret af en galliumkilde, fjerne overskydende materiale og efterlade en lamel6. Fræseprocessen styres af SEM-billeddannelse af prøvens topografi, som bruges til at lokalisere områder af interesse og overvåge fræsningsfremskridt. Til biologiske applikationer er den grundlæggende opsætning stort set den samme, men fræsning udføres ved kryogene temperaturer. Dette har krævet, at standard FIB-SEM'er er tilpasset til at have kryokølede trin, der opretholder konstante temperaturer og lave overfladekontamineringshastigheder, samt luftsluser for at lette prøveoverførsel uden forvitring eller kontaminering. Prøvetransporter er også blevet modificeret for at gøre det muligt at montere en række forskellige bærere inde i cryoFIB-SEM, herunder TEM-gitre, planchetter og kapillærer. Flere nøglegrupper af forskere har været centrale for udviklingen af disse metoder og de fortsatte teknologiske fremskridt på området 7,8,9,10,11,12. Kommercielle løsninger er nu mere bredt tilgængelige til biologisk FIB-fræsning ved kryogen temperatur, og on-grid fræsning af lameller bliver mere rutine, givet en optimeret prøve.
En række rumtemperatur- og kryoEM-teknikker kan bruges til at visualisere cellulær information på tværs af alle livets skalaer, fra hele flercellede organismer med beskeden opløsning til forståelse af sammenhængen mellem komplekse processer på celleniveau og endnu mere detaljeret til bestemmelse af in situ molekylære strukturer13,14,15,16,17,18,19. Klassiske rumtemperaturteknikker omfatter sektionering af faste og farvede, harpiksindlejrede celler og væv ved ultramikrotomi til analyse af cellulær morfologi ved TEM (for gennemgang se Studer et al., 200820). Der er udviklet alternative teknikker, der udnytter sekundær elektronspredning af SEM til at afbilde overfladen af blokke af bevarede celler, før materiale gradvist fjernes enten med en kniv (seriel blokfladebilleddannelse) eller en fokuseret ionstråle21,22,23. Denne teknik er også blevet implementeret med succes ved kryogene temperaturer (kaldet cryovolumenbilleddannelse) med en cryoFIB-SEM på glasagtige, ufarvede blokke af celler eller væv24. Alternativt kan tykkere lameller (~ 15 μm tykke) fræses og studeres ved STEM-billeddannelse25. Ved hjælp af disse teknikker kan hele blokke, der indeholder mange celler, afbildes for at indsamle befolkningsinformation, eller et helt organ / organisme kan afbildes og rekonstrueres i 3D. For at få adgang til molekylær information med høj opløsning fra celler skal prøver imidlertid bevares i en næsten hjemmehørende, frosset hydratiseret tilstand og skal derfor forberedes under kryogene forhold. Kryo-elektronmikroskopi af glaslegemesektioner (CEMOVIS) er en teknik, hvorved højtryksfrosne blokke af biologisk materiale skæres under kryogene betingelser med et ultramikrotom. Dette producerer bånd af kryo-sektioner (40-100 nm tykke)26, som er knyttet til et EM-gitter og afbildet i TEM. Imidlertid forårsager knivens fysiske interaktion med glaslegemeprøven sprække- og kompressionsartefakter, der alvorligt kan forvrænge cellulær struktur27,28,29,30. Tykkere sektioner er mere tilbøjelige til disse artefakter, hvilket gør det upraktisk at bruge sektioner, der er tykkere end ~ 70 nm26. Denne begrænsning begrænser i høj grad 3D-visningen af den biologiske struktur i tomogrammet. FIB-fræsning ved kryogene temperaturer oplever ikke disse problemer, men har sine egne artefakter forårsaget af differentierede fræsehastigheder på tværs af dele af prøven, hvilket fører til variable tykkelser inden for en lamel - kaldet gardiner. Dette problem afhjælpes ved anvendelse af en organoplatinbelægning, der påføres via et gasindsprøjtningssystem (GIS), som beskytter lamellens forkant under fræsning31. Den øvre grænse for prøvetykkelse for FIB-fræsning på nettet defineres af evnen til at dykke fryse prøven, mens den holdes glasagtig32, selv om FIB-fræsning med indførelsen af cryo-udtagningsteknikker og tilpassede prøvebærere til biologiske prøver også kan anvendes til behandling af højtryksfrosne prøver31,33,34,35. Derudover kan dykfrosne prøver ikke være for tynde, da der skal være nok biologisk materiale til at generere en lamel af rimelig størrelse, der giver nok overfladeareal til at samle vippeserier ved den krævede forstørrelse. Dette problem kan afhjælpes ved at fræse klumper af mindre celler, såsom bakterier eller gær. Endelig lameltykkelse (~ 100-300 nm) dikteres normalt af prøveintegriteten og fræsestrategien. Tyndere lameller er bedre til strukturelt arbejde med høj opløsning, såsom sub-tomogramgennemsnit, men tykkere lameller indeholder meget større cellulære volumener, end CEMOVIS kan opnå, hvilket giver mere cellulær kontekst i en næsten til naturligt bevaret prøve. FIB-fræsning kan også bruges til at tynde dykfrosne proteinkrystaller til elektrondiffraktionsundersøgelser36.
FIB-formaling af glasagtige celler er værd at bruge tid og kræfter på at udføre, hvis det videnskabelige spørgsmål kræver molekylære detaljer med høj opløsning af næsten native prøver in situ. Med adgang til flere faciliteter til rutinemæssig produktion af lameller er det hastighedsbegrænsende trin ofte optimering af prøven inden fræsning, hvor der skal tages tid til at sikre, at prøven er glasagtig og har en passende tykkelse til at producere robuste og ensartet tynde lameller. Beskrevet her er prøveoptimering for FIB-fræsning af dykfrosne humane røde blodlegemer inficeret med Plasmodium falciparum-parasitter , malariaens årsagsmiddel, men denne tilgang kan tilpasses til en given prøve.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>c-clips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Direct quote from Thermo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>Sub-angstrom</td>
			<td>CSA-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound 2</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-FIB specific autogrid rims</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1205101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E64</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emitech K100X glow discharge unit</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12633012</td>
			<td>Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>350864X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11562203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Sub-angstrom</td>
			<td>PB</td>
			<td>For clipped grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>For clipped grids - direct quote from Thermo Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Home-made manual plunge freezing rig</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human blood</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>UK National Blood and Transplant service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>n/a</td>
			<td>FIB-SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td>sputter coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE900</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td>e-beam rotary coater. In a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linkam cryo-stage for light microscope</td>
			<td>Linkam</td>
			<td>Model No. CMS196</td>
			<td>Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse E200 light microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C17nCuH2-01</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C17nCu20-01</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum PP3010 prep-chamber</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>n/a</td>
			<td>sputter coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage.</td>
			<td>FEI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>FIB-SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen</td>
			<td>Viking Direct</td>
			<td>ND538522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFS Titan Krios 300 kV TEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>TEM equipped with a K2 or K3 camera.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatmann grade 1 filter paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA1001150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Scope A1 light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td>with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography

Præsenteret her er en protokol til fremstilling af kryo-lameller fra dykfrosne gitter af Plasmodium falciparum-inficerede humane erythrocytter, som let kunne tilpasses til andre biologiske prøver. De grundlæggende principper for forberedelse af prøver, fræsning og visning af lameller er fælles for alle instrumenter, og protokollen kan følges som en generel vejledning til on-grid kryo-lamellpræparation til kryo-elektronmikroskopi (cryoEM) og kryo-elektrontomografi (cryoET). Elektronmikroskopigitter, der understøtter cellerne, kastes frosset ned i flydende nitrogenkølet flydende ethan ved hjælp af en manuel eller automatiseret springfryser og screenes derefter på et lysmikroskop udstyret med et kryo-trin. Frosne gitter overføres til et kryo-scanning elektronmikroskop udstyret med en fokuseret ionstråle (cryoFIB-SEM). Gitre er rutinemæssigt sputterbelagt inden fræsning, hvilket hjælper spredning af ladningsopbygning under fræsning. Alternativt kan en e-stråle roterende coater bruges til at påføre et lag kulstof-platin på gitterene, hvis nøjagtige tykkelse kan styres mere præcist. Når den er inde i cryoFIB-SEM, påføres en yderligere belægning af en organoplatinforbindelse på overfladen af gitteret via et gasindsprøjtningssystem (GIS). Dette lag beskytter lamellens forkant, når den fræses, hvis integritet er afgørende for at opnå ensartet tynde lameller. Interesseområder identificeres via SEM, og fræsning udføres trinvist, hvilket reducerer ionstrålens strøm, når lamellen når elektrongennemsigtighed, for at undgå overdreven varmegenerering. Et gitter med flere lameller overføres derefter til et transmissionselektronmikroskop (TEM) under kryogene betingelser for tilt-serie erhvervelse. En robust og kontamineringsfri arbejdsgang til lamelpræparation er et vigtigt skridt for downstream-teknikker, herunder cellulær cryoEM, cryoET og sub-tomogram-gennemsnit. Udvikling af disse teknikker, især til udtagning og fræsning af højtryksfrosne prøver, har høj prioritet i marken.

Watch this Scientific Journal Video about Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Brug af fokuseret ionstrålefræsning til fremstilling af glasagtige lameller på gitteret fra dybfrosne biologiske prøver til kryo-elektrontomografi.

Forberedelse af lameller fra glasagtige biologiske prøver ved hjælp af et dobbeltstrålescanningselektronmikroskop til kryo-elektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Denne protokol skitserer fremstillingen af glasagtige lameller af Plasmodium-falciparum-inficerede røde blodlegemer til kryo-elektrontomografi. Dette muliggør direkte observation af detaljerede strukturelle oplysninger om, hvordan parasitten forårsager malaria. Kryo-elektrontomografi registrerer information i høj opløsning om indersiden af celler.Det er kraftigt nok til at observere enkelte proteinkomplekser in situ, som beregningsmæssigt kan ekstraheres og beregnes i gennemsnit for at afsløre tredimensionel strukturel information om proteiner. Denne protokol kan let tilpasses til forskellige celletyper og kan være et udgangspunkt for en person, der er ny til at producere glasagtige lameller til kryo-elektrontomografi. Det er Alejandra Carbajal, som vil gennemføre protokollen i dag.Til at begynde med skal du screene de frosne kobbergitre ved hjælp af et CryoStage for et lysmikroskop med særlig opmærksomhed på isgradienten over gitteret. Kontroller individuelle gitterfirkanter for celledækning i de tyndere isområder. Brug en sort uudslettelig markør til at markere forsiden og den modsatte side af Cryo-FIB-SEM-specifikke Autogrid-fælge.Læg det klippede gitter i Cryo-FIB-SEM-shuttlen med kulstofsiden opad, og påfør en fire nanometer tyk kulstof- eller platin-e-stråle roterende belægning på overfladen af cellerne. Læg rumfærgen i Cryo-FIB-SEM, og vurder cellefordelingen på hvert net ved hjælp af SEM ved fem kilovolt. Tag en oversigt over lav forstørrelse ved 100 effekt for at se på isgradienter på tværs af nettet.Tag derefter billeder med højere forstørrelse ved 5.000 effekt for at se på individuelle gitterkvadrater. Påfør et to mikrometer organoplatinlag på overfladen af hvert gitter ved at indsætte gasindsprøjtningssystemets nål i kammeret over gitteret og opvarme organoplatinkilden til en indstillet temperatur i et bestemt tidsrum for at producere en dampstrøm. For at observere prøven skal du vippe prøven, så gitterets plan er ca. 10 grader fra ionstrålens indfaldsvinkel, og flytte midten af et passende gitterkvadrat, der skal ses på både SEM- og FIB-billederne.ved hjælp af ionstrålen ved lav strøm, Undersøg gitteret ved høj forstørrelse for at visualisere cellerne i midten af et gitterkvadrat. Markér to rektangulære mønstre, der skal fræses, et over og et under et tre mikrometer tykt beskyttet område. Vælg derefter stråleindstillingerne og korriger astigmatisme ved at justere lysstyrken og kontrasten.Når opsætningen er fuldført, skal du starte fræsningen med en strøm på 300 picoampere, mens du overvåger live-forløbet i ionstrålevisningen og periodisk med SEM. Prøven kontrolleres I SEM-visningen og efter den første fræsning, Hvis ionstrålen ikke er brudt gennem prøven over og under det beskyttede område, skal du fjerne mere materiale ved at øge højden af de rektangulære mønstre. Stop fræsning, når overfladen over og under lamellen er helt glat i ionstrålevisningen.Gentag fræseprocessen trinvist, og reducer ionstrålestrømmen hver gang, indtil en tykkelse på 300 nanometer er nået. Positionen X Y Z for hver lamel registreres. For at polere lamellerne i slutningen af eksperimentet skal du bruge en SEM-oversigt med lav forstørrelse til at vælge en gruppe lameller, der skal poleres, og markere polerroden.Når polerroden er markeret, skal du reducere mellemrummet mellem de to rektangulære mønstre til 100 til 200 nanometer og begynde poleringen ved en ionstrålestrøm på 30 picoampere. Overvåg SEM's fremskridt ved to til tre kilovolt. Stop polering, når kontrasten i lamellen går tabt af SEM, eller når organoplatinfrakken eller selve lamellen begynder at miste integriteten.Hent og gem SEM-billeder med lav forstørrelse af hver lameller. Efter afslutningen af eksperimentet skal du fjerne skyttelbussen fra mikroskopet. Fjern gitterene med lameller og opbevar dem under flydende nitrogen.Håndter ristene forsigtigt. For at studere morfologi blev skizonterne stoppet på forskellige stadier af udgang ved anvendelse af forbindelse to i E-64-hæmmere. I nærvær af forbindelse to var grænsen mellem de parasitoforiske membraner og det omgivende hæmoglobin i værtsrøde blodlegemer veldefineret.Den intakte parasitoforiske vakuol eller PV'er blev pakket med merozoitter i en enkelt klynge af hæmozoinkrystaller. Når forbindelse to synkroniserede skizonter blev vasket ind i E-64, blev PV-membranen brudt, og merozoitterne spredte sig inden for RBC. Et typisk eksempel på god cellefordeling på et kobbergitter viser store røde blodlegemer med en veldefineret periferi og en intakt vakuolmembran.Inden for en delvist kollapset vært røde blodlegemer blev de enkelte merozoitter visualiseret som små celleklynger. Hver schizont havde en sort plet i midten, der angiver placeringen af hæmozoinkrystallerne. Efter fræsning blev gitterene indlæst i TEM for at identificere lamellernes positioner og finde egnede områder at målrette mod tomografi.I prøvemikrografen kan en RBC, der for nylig var blevet invaderet af en merozoit, ses. Merozoitten omgivet af den værtscelleafledte membran kunne ses inden for RBC's grænse. I den apikale ende af merozoitten var de to membraner, der omgiver cellen, og fire membraner stablet i toppen af merozoitten forbundet med et elektrontæt svampeformet træk tydeligt synlige.Inden for cytoplasmaet af merozoitten blev en fusionsbegivenhed mellem merozoitplasmamembranen og en flerlags vesikel identificeret. I en yderligere TEM-analyse af en 230 nanometer tyk lamel blev den typiske morfologi for en moden merozoit behandlet med E-64 observeret. Inden for den røde blodcellemembran kan merozoitplasmamembranen ses med organeller som det indre membrankompleks, polære ringe, mikronemer, roptrier og den nukleare kuvert.Den vigtigste del af denne teknik er at optimere gitterene for at muliggøre reproducerbar og effektiv produktion af tynde lameller. Yderligere udvikling af denne teknik vil gøre det muligt for forskere at visualisere enkeltproteinmolekyler i malariale parasitter og bestemme deres rolle i malarial udgang.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Brug af elektron paramagnetisk resonans i biologiske prøver ved omgivende temperatur og 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Hurtig gitterforberedelse til tidstilslutt kryo-elektronmikroskopi

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Forberedelse og kryo-FIB mikromaskiner af Saccharomyces cerevisiae til Kryo-Elektron Tomografi

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Enkelt partikel kryo-elektronmikroskopi: Fra prøve til struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning Transmission ElektronMikroskopiGitre til direkte cellepositionering i hele celle kryo-elektrontomografi arbejdsprocesser

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

En robust arbejdsgang for behandling af kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) med cryoSPARC, RELION og Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Fremstilling af nukleosomkernepartikler kompleksbundet med DNA-reparationsfaktorer til kryo-elektronmikroskopi strukturbestemmelse

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Ekstraktion af modificerede mikrotubuli fra pattedyrceller til undersøgelse af mikrotubuli-proteinkomplekser ved kryo-elektronmikroskopi

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Anvendelse af monolagsgrafen på kryo-elektronmikroskopigitter til strukturbestemmelse med høj opløsning

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...