Name: preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography
Uploaded: 2021-08-05T13:30:00
Duration: 7 min
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Cette recherche a été financée en tout ou en partie par le Wellcome Trust (212916/Z/18/Z). Aux fins du libre accès, l’auteur a appliqué une licence de droit d’auteur public CC BY à toute version manuscrite acceptée par l’auteur découlant de cette soumission.
Ce projet pour lequel cette méthode a été développée a été financé par une subvention MR/P010288/1 du Conseil de recherches médicales accordée à Helen R. Saibil, Roland A. Fleck et Michael J. Blackman. Les cultures de P. falciparum ont été cultivées à l’Institut Francis Crick, avec le soutien des membres du groupe de Michael J. Blackman. Les auteurs aimeraient remercier le Dr Ser Ying (Michele) Tan d’avoir fourni les images des schizontes traités par composé 2 et E64 dans des frottis sanguins minces. La plupart des lamelles ont été produites avec le soutien du personnel d’eBIC et nous sommes reconnaissants d’avoir accès au cryoFIB-SEM à double faisceau Scios sur proposition de recherche NT21004. Les auteurs reconnaissent également le soutien du programme de bourses de l’industrie de la Royal Society (INF\R2\202061) dans la poursuite du développement de la technique de fraisage FIB au sein de la CUI. Les auteurs aimeraient également remercier Helen R. Saibil pour les discussions utiles concernant ce document sur les méthodes et la supervision du projet.

Le sang humain a été obtenu à partir de donneurs anonymes par l’intermédiaire du service national de sang et de transplantation du Royaume-Uni et est utilisé dans les 2 semaines suivant la réception. Aucune approbation éthique n’est requise pour son utilisation.
1. Préparation et congélation des globules rouges infectés par Plasmodium falciparum
<ol><li>Isoler les schizontes matures par centrifugation (1 580 x g) sur un milieu gradient de densité isotonique de 70 % (v/v) (pour les procédures standard sur la façon de cultiver des stades sanguins asexués de 3D7 Plasmodium falciparum dans des érythrocytes humains, voir Blackman M.J., 199537).</li>
	<li>Fixez les fines pellicules de sang séchées à l’air sur une lame de verre avec 100% de méthanol pour vérifier l’homogénéité morphologique des schizontes avant de les colorer avec 10% de Giemsa dans un tampon phosphate de 6,7 mM, pH 7,1. REMARQUE : Pour enrichir la préparation des schizontes bloqués à des points spécifiques de sortie, les schizontes peuvent être synchronisés davantage avec les inhibiteurs des composés 2 et E64 (voir Résultats représentatifs et Figure 1 pour une explication de l’effet de ces inhibiteurs). MISE EN GARDE : Plasmodium falciparum est un agent pathogène humain et ne doit être manipulé que dans une installation de confinement appropriée, conformément aux directives locales en matière de santé et de sécurité.</li>
	<li>Centrifuger doucement les schizontes (240 x g) pour les granuler et les remettre en suspension dans 2x le volume de la pastille cellulaire de média RPMI, ce qui donne une suspension d’hématocrite à 50%.</li>
	<li>Sur une plate-forme de congélation manuelle, appliquer 2,5 μL de schizonts sur le côté carbone d’une grille en cuivre à 200 mailles à décharge luminescente (utilisez des réglages d’unité de décharge luminescente de 60 s, 30 mA dans l’air, en traitant uniquement le côté carbone de la grille) avec un film de carbone à 2/4 de trou et un transfert pendant ~20 s à partir de l’arrière de la grille en utilisant du papier filtre de grade 1 avec un bord déchiré. Plongez dans de l’éthane liquide refroidi à l’azote liquide et transférez les grilles pour les stocker (voir le tableau des matériaux pour l’équipement utilisé dans cette étude). REMARQUE: L’expérience peut être interrompue ici et les grilles peuvent être stockées indéfiniment sous azote liquide. ATTENTION : L’azote liquide est un asphyxiant et provoque des engelures; Manipuler avec précaution dans un environnement approprié avec surveillance de l’oxygène. ATTENTION : L’éthane liquide provoque de graves brûlures et est inflammable; Utiliser dans une hotte loin des sources d’inflammation. REMARQUE: Les schizontes congelés ne sont plus viables. Cela a été déterminé en incubant du sang humain avec plusieurs grilles d’or de schizontes surgelés à l’air et en n’observant aucune croissance parasitaire après plusieurs jours, par rapport aux témoins non congelés. Les grilles congelées de schizonts peuvent donc être manipulées en toute sécurité à l’extérieur des installations de confinement en utilisant les procédures normales de sécurité et de décontamination (gants, stérilisation des surfaces et des outils avec de l’éthanol >70 % et élimination des grilles dans de l’éthanol >70 %).</li>
	<li>Grilles d’écran utilisant un cryo-étage pour un microscope optique, en accordant une attention particulière au gradient de glace à travers la grille. Dans les zones les plus minces de la glace, vérifiez les carrés de la grille individuelle pour la couverture cellulaire. REMARQUE : Les meilleurs carrés doivent avoir une épaisseur de cellule au centre du carré de la grille (Figure 2). Cela garantit qu’une lamelle peut être broyée au centre du carré sans heurter la glace plus épaisse sur les bords contre les barres de la grille. L’expérience peut être interrompue ici, et les grilles peuvent être stockées sous azote liquide indéfiniment. Si les cellules portent un marqueur fluorescent, les grilles peuvent également être criblées par cryoCLEM pour localiser les positions X/Y d’intérêt, qui peuvent être corrélées avec les emplacements de grille dans le cryoFIB-SEM pour un broyage direct.</li>
</ol>2. Fraisage FIB sur grille de cellules surgelées
<ol><li>Marquez l’avant des jantes de grille automatique spécifiques à cryoFIB avec un marqueur noir indélébile pour indiquer le centre de la section coupée et le côté opposé de la jante (Figure 3). Installez la station d’écrêtage et les grilles de clip dans les anneaux marqués côté carbone vers le bas.</li>
	<li>Chargez les grilles dans la navette cryoFIB-SEM (généralement 2 grilles, selon la navette) côté carbone vers le haut et appliquez une couche de pulvérisation de platine dans une atmosphère d’argon (5 x 10-2 mbar) (5 mA pendant 60 s - l’épaisseur est variable) ou une couche rotative à faisceau e carbone / platine (~ 4 nm d’épaisseur) à la surface des cellules. REMARQUE: Les deux types de revêtements facilitent la dispersion de la charge pendant l’imagerie SEM. L’avantage de l’enduit rotatif à faisceau électrique est que l’épaisseur exacte du revêtement peut être spécifiée.</li>
	<li>Chargez la navette dans le cryoFIB-SEM et évaluez la distribution des cellules sur chaque grille par SEM à 5 kV (13 pA ou 25 pA). Prenez une vue d’ensemble à faible grossissement (~100x) pour examiner les gradients de glace sur la grille. Ensuite, prenez des images à fort grossissement (~ 5 000x) pour examiner les carrés individuels de la grille et identifier les zones de la grille présentant des caractéristiques cellulaires visibles et une faible contamination de surface à usiner.</li>
	<li>Appliquez une couche organoplatine de >2 μm sur la surface de chaque grille à l’aide du système d’injection de gaz (SIG). Pour ce faire, insérez l’aiguille SIG dans la chambre au-dessus de la grille et réchauffez la source organoplatine à une température définie pendant un temps défini (par exemple, ~27 °C pendant 3-10 s) pour produire un flux de vapeur. REMARQUE: L’angle d’application, la température et le moment de la couche organoplatine via l’aiguille SIG doivent être optimisés pour maximiser un revêtement uniforme. Cela dépendra du cryoFIB-SEM spécifique utilisé (voir Résultats représentatifs pour plus d’explications).</li>
	<li>Inclinez l’échantillon de sorte que le plan de la grille soit ~10° par rapport à l’angle d’incidence du faisceau d’ions et déplacez le centre d’un carré de grille approprié pour être vu dans les images SEM et FIB.</li>
	<li>Surveillez la grille à l’aide du faisceau d’ions à faible courant (nominalement 1,5 pA, 30 kV) et passez à un grossissement suffisamment élevé (~ 7 000x) pour visualiser les cellules au centre d’un carré de grille. Mettre l’échantillon au point au premier courant de broyage (300 pA) et corriger l’astigmatisme. Ajustez la luminosité et le contraste, puis tracez deux motifs rectangulaires à fraiser, l’un au-dessus et l’autre au-dessous d’une région protégée de 3 μm d’épaisseur, dont le centre est l’emplacement souhaité de la lamelle finale. Remarque : La largeur choisie des motifs dépendra de la topographie de la couche cellulaire environnante et de la taille de la cellule. 7-20 μm est une largeur appropriée pour les schizontes, mais les lamelles plus larges prennent plus de temps à moudre. La hauteur choisie des motifs pour la première étape de fraisage dépend de l’épaisseur de l’échantillon, à partir d’environ 6 μm; Cela peut avoir besoin d’être ajusté pendant le fraisage. Le fraisage est effectué de manière directionnelle à partir des bords extérieur supérieur et inférieur des motifs vers la face de la lamelle. Cela peut être fait en parallèle, où les deux motifs sont broyés simultanément ou séquentiellement, en enlevant d’abord le matériau au-dessus de la lamelle, puis en dessous.</li>
	<li>Commencer le fraisage au premier courant; surveiller la progression en direct dans la vue du faisceau d’ions et par intermittence par MEB (5 kV, 13 ou 25 pA). Vérifiez que le faisceau d’ions a traversé l’échantillon au-dessus et au-dessous de la région protégée. Sinon, augmentez la hauteur des motifs rectangulaires pour enlever plus de matière. Arrêtez-vous lorsque la surface au-dessus et au-dessous de la lamelle est complètement lisse dans la vue du faisceau d’ions. REMARQUE: Le faisceau d’ions a percé l’échantillon au-dessus et au-dessous de la région protégée lorsque l’intérieur des motifs rectangulaires ne contient aucune caractéristique dans le plan focal. Certaines entités, telles que les barres de grille, peuvent être visibles flou en arrière-plan.</li>
	<li>Passage au courant de fraisage suivant (100 pA); Effectuez la mise au point et ajustez la luminosité / contraste. Réduisez l’espace entre les deux motifs rectangulaires à 1,5 μm et diminuez la hauteur du motif pour ne couvrir que le matériau non fraisé. Commencez à moudre au nouveau courant jusqu’à ce que la surface au-dessus et au-dessous de la lamelle soit complètement lisse.</li>
	<li>Répétez ce processus étape jusqu’à ce qu’une épaisseur de 0,3 μm soit atteinte, en réduisant le courant du faisceau d’ions à chaque fois selon le schéma de fraisage du tableau 1.</li>
	<li>Fraiser plusieurs lamelles (la quantité dépend de l’épaisseur de l’échantillon et du temps disponible) sur une ou les deux grilles à une épaisseur de 0,3 μm, noter la position X/Y/Z de chaque lamelle et réserver ~1-2 h à la fin de la séance pour polir les lamelles à leur épaisseur finale (60-200 nm).</li>
	<li>Prenez une vue d’ensemble SEM à faible grossissement de l’ensemble de la grille et planifiez un itinéraire de polissage partant des lamelles à l’avant de la grille (plus près de la source du faisceau d’ions) aux lamelles à l’arrière de la grille (les plus éloignées de la source du faisceau d’ions) (Figure 5). NOTE: Cela réduit le redépôt du matériau ablé sur la surface des lamelles polies.</li>
	<li>Réduisez l’espace entre les deux motifs rectangulaires à 100-200 nm et commencez l’étape finale de polissage à un courant de faisceau d’ions de 30 pA. Surveillez la progression par MEB à 2-3 kV (13 pA, palier = 300 n, 3072 x 2048, ~2 s pour un plein cadre) et arrêtez le polissage lorsque le contraste est perdu dans la lamelle par MEB ou lorsque la couche organoplatine de la lamelle elle-même commence à perdre son intégrité.</li>
	<li>Avant de retirer les grilles, obtenez une image MEB à faible grossissement de l’ensemble de la grille et enregistrez des images de chaque lamelle. Utilisez-les pour recouper la grille plus tard dans le TEM. Mettez l’expérience en pause ici et stockez les grilles avec des lamelles sous azote liquide - manipuler avec soin. REMARQUE: Les grilles peuvent être légèrement enduites de pulvérisation lors de leur retrait du cryoFIB-SEM, ce qui peut aider à limiter la dérive et la charge dans le TEM à fort grossissement, mais cela doit être fait avec prudence car trop de revêtement de pulvérisation peut obscurcir le contenu biologique à l’intérieur des lamelles. Il est possible de dépister la fluorescence des lamelles à ce stade; Cependant, l’obtention d’un signal suffisant dépendra de l’abondance de la protéine marquée dans l’épaisseur de la lamelle. Un grand soin doit être apporté à la manipulation des grilles pour limiter les dommages aux lamelles et éviter la contamination de surface.</li>
</ol>3. Acquisition en série Tilt et aperçu général du traitement des données
<ol><li>Chargez les grilles dans le TEM, en alignant la direction de fraisage perpendiculairement à l’axe d’inclinaison de la scène. REMARQUE: L’alignement des grilles se fait à l’œil nu à l’aide des marques sur le bord de la grille automatique. Une marge d’erreur de ~10° est acceptable, sinon les parois de la tranchée de chaque côté de la lamelle peuvent obscurcir la lamelle lorsque la grille est inclinée.</li>
	<li>Acquérir une carte à faible grossissement (~150x) de l’ensemble de la grille et localiser les lamelles; Ensuite, procurez-vous une carte de grossissement moyen (~1 500x, selon la taille des lamelles) de chaque lamelle et localisez les zones d’intérêt.</li>
	<li>Pré-incliner la grille de ±10° pour rendre le plan de la lamelle (pas la grille) perpendiculaire à l’axe optique NOTE: La direction de la pré-inclinaison peut être déterminée par la position du bord avant des lamelles (à la recherche de la couche organoplatine restante) dans les cartes de grossissement faible et moyen. Pour le TEM utilisé ici, les grilles nécessitent une pré-inclinaison de +10° si les bords antérieurs des lamelles pointent vers le haut sur les cartes et nécessitent une pré-inclinaison de -10° si elles pointent vers le bas. Chaque grille peut être différente en raison de la façon dont elles ont été ramassées et insérées dans le chargeur automatique.</li>
	<li>Acquérir la série d’inclinaison symétrique de dose38 (par exemple, -54° à +54° avec un incrément de 3-5°) à une taille de pixel qui permet à la fois le champ de vision et la résolution requis pour la région d’intérêt. Utilisez une plage de valeurs de flou comprise entre -2 et -5 μm. Collectez des films avec 3-10 images à chaque incrément et pour cela, ajustez ces paramètres en fonction de la taille des pixels pour accumuler une dose totale de ~150 e-/Å2 (pour un TEM 300 kV). REMARQUE: Les fissures dans la lamelle doivent être évitées car ces régions peuvent dériver. La contamination de surface doit également être évitée, car elle peut masquer la région d’intérêt ou la zone de mise au point à forte inclinaison.</li>
	<li>Motion corrige les films à l’aide d’un programme tel que MotionCor239. Appliquer un filtre de pondération de dose aux images corrigées (e-/image accumulée)40 et estimer la défocalisation de chaque image à l’aide d’un programme tel que CTFFIND441.</li>
	<li>Utilisez l’alignement sans fiducielle (suivi des patchs) dans un programme tel que etomo (IMOD)42 pour calculer l’alignement et la relation angulaire des images en série tilt.</li>
	<li>Entrez les informations d’alignement et de rotation, ainsi que les valeurs de défocalisation dans un programme qui peut appliquer une correction CTF tridimensionnelle, par exemple, NovaCTF43. Calculer un tomogramme corrigé pour obtenir des tomogrammes de sortie avec des facteurs de regroupement pertinents pour l’analyse en aval.</li>
	<li>Analysez les reconstructions et préparez-vous à tout traitement en aval, par exemple, le filtrage, la segmentation ou la moyenne des sous-tomogrammes.</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Alors que le cryoFIB-broyage devient de plus en plus courant, la préparation d’échantillons optimaux pour le broyage ne l’a pas fait; par conséquent, la plupart des étapes critiques de ce protocole se produisent avant que l’échantillon n’atteigne le cryoFIB-SEM. L’optimisation de l’échantillon par plusieurs cycles de préparation cellulaire, la congélation et le criblage par microscopie optique et électronique sont nécessaires pour produire le meilleur échantillon possible avant de tenter le broyage. Avoir le meilleur échantillon possible augmente non seulement les chances de succès, mais optimise également l’utilisation de l’équipement. Pour cette raison, la plupart des installations nationales exigent la preuve qu’une optimisation suffisante a été effectuée avant d’accorder du temps sur leurs machines. Une fois à l’intérieur du cryoFIB-SEM, il est essentiel de maximiser l’efficacité de la couche organoplatine afin de produire des lamelles uniformément minces. Enfin, la patience et une bonne manipulation des échantillons sont des compétences préalables de l’utilisateur, qui devra rester assis pendant plusieurs jours pour produire puis transférer des grilles contenant des lamelles délicates. Cela pourrait changer avec l’introduction de stratégies de fraisage automatisées47,48, mais jusqu’à présent, l’ensemble du processus de fraisage est encore largement manuel dans la plupart des installations.
Bien que les travaux se soient concentrés uniquement sur les schizontes de P. falciparum , la méthode présentée ici pourrait être facilement modifiée pour optimiser la préparation et le broyage de la grille pour d’autres types de cellules. Les facteurs importants à considérer sont la densité des cellules appliquées à la grille, le type de grille (le cuivre est toxique pour certaines cellules), la taille et l’espacement des trous dans le film de carbone, le temps de buvard et la méthode de buvard (simple / double face, manuel ou automatisé). De plus, si les cellules sont cultivées sur les grilles (généralement des grilles d’or avec un film de carbone troué), la confluence peut être vérifiée par microscopie optique avant le buvard et la congélation. La stratégie de broyage dépend de la façon dont les cellules sont déposées sur la grille. Pour les globules rouges infectés par le paludisme, la grille est essentiellement recouverte d’une couche ininterrompue de cellules, plus épaisse dans certaines zones et plus mince dans d’autres. Le broyage est effectué en plusieurs points dans une région le long de ce gradient où l’épaisseur de la glace génère des lamelles de taille appropriée pour la tomographie. Cette approche fonctionne bien pour les cellules plus petites car vous pouvez produire des lamelles contenant une tranche à travers plusieurs cellules. Pour les cellules plus grandes ou les amas de cellules, il se peut qu’une cellule ou un amas cellulaire produise une lamelle.
La gestion de la grille et le transfert d’échantillons restent l’un des principaux défis de ce flux de travail. Les lamelles peuvent être perdues en raison de bris ou de fissures, d’artefacts de rideaux obscurcissant la biologie, d’une contamination excessive de la surface, ainsi que de problèmes d’orientation de la grille dans le TEM, nécessitant une étape de manipulation supplémentaire pour repositionner la grille. Le degré de pertes varie d’un jour à l’autre et d’un réseau à l’autre, mais il est amélioré par la pratique et l’expérience de manipulation au fil du temps. Dans cette étude, il a été constaté que les grilles peuvent être soigneusement réorientées dans le chargeur automatique plusieurs fois sans détruire les lamelles, ce qui a parfois l’avantage de laver la glace de surface. Une autre limitation majeure de ce flux de travail est le temps nécessaire pour produire des lamelles. Comme la production est lente, il est essentiel de disposer d’un échantillon correctement optimisé, ce qui rend le fraisage aussi efficace que possible.
Un certain nombre d’adaptations au broyage FIB d’échantillons biologiques vitreux ont récemment été introduites. La mise en œuvre d’outils de levage refroidis cryogéniquement dans la chambre cryoFIB-SEM qui permettent de fraiser de plus gros blocs de matériau à partir d’échantillons congelés à haute pression change la donne. Les blocs peuvent être attachés à une tige métallique ou ramassés dans une pince et déplacés vers une deuxième position d’échantillonnage, contenant une grille EM spécialement modifiée. Les blocs peuvent ensuite être recouverts d’organoplatine et broyés pour générer des lamelles. La capacité de broyer des lamelles à partir de matériaux congelés à haute pression signifie que des cellules et des tissus beaucoup plus grands peuvent être traités, ciblant spécifiquement des zones par microscopie à fluorescence corrélative12. D’autres adaptations récentes de la méthode de fraisage FIB comprennent la réduction des artefacts de rideau par pré-broyage en coin de l’échantillon16, la cryofixation microfluidique49 et la photo-microstructuration des grilles de microscopie électronique pour améliorer la distribution cellulaire50. En outre, il a été démontré que le broyage des espaces de micro-expansion de chaque côté d’une lamelle peut atténuer la compression de l’échantillon environnant lorsqu’il atteint sa minceur finale51. Cela peut être particulièrement utile lors du broyage de couches cellulaires continues, comme l’échantillon de cette étude, où la flexion des lamelles est parfois observée lors de l’étape finale de polissage.
L’avenir de la microscopie électronique sera probablement la détermination des structures moléculaires in situ par moyenne sous-tomogramme et le broyage FIB est un outil important qui facilitera la production d’échantillons biologiques vitreux pour ces types de flux de travail. Alors que le broyage FIB en est encore à ses balbutiements pour les applications biologiques, le développement de méthodes se fait à un rythme rapide grâce au travail acharné des chercheurs, tant universitaires que nationaux, ainsi qu’à des investissements commerciaux dans le développement de la technologie cryoFIB-SEM pour soutenir la recherche.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated from:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University
to:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
M. Alejandra Carbajal1 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Seul le contenu cellulaire d’échantillons biologiques de <500 nm d’épaisseur peut être imagé efficacement par microscopie électronique à transmission (MET) à des températures cryogéniques, limitant ainsi la gamme de spécimens aux virus, aux procaryotes, aux organismes unicellulaires simples et aux régions plus minces des cellules eucaryotesplus grandes 1. Le broyage par faisceau d’ions focalisés sur grille (FIB) permet d’amincir des échantillons biologiques surgelés plus épais en lamelles transparentes aux électrons à des températures cryogéniques (< -150 °C). Les lamelles résultantes sont ensuite transférées dans un TEM pour la visualisation et la collecte de données tomographiques, ce qui permet des reconstructions 3D à haute résolution des caractéristiques cellulaires et moléculaires à l’intérieur des cellules (pour des revues, voir Rigort et al., 20122, Oikonomou et al., 20163, et Wagner et al., 20204).
Le fraisage FIB a émergé du domaine des sciences des matériaux, où les échantillons sont systématiquement éclaircis pour les préparer à l’analyse en aval5. Il est réalisé dans un microscope électronique à balayage (MEB), qui comporte deux colonnes optiques : l’optique classique au microscope électronique à balayage et une seconde colonne contenant des optiques capables de générer et de contrôler finement un faisceau d’ions focalisés (FIB) - appelé FIB-SEM. Cela permet d’ablation d’une région spécifique de l’échantillon par des ions générés par une source de gallium, en éliminant l’excès de matière et en laissant derrière elle une lamelle6. Le processus de broyage est guidé par l’imagerie MEB de la topographie de l’échantillon, qui est utilisée pour localiser les régions d’intérêt et surveiller la progression du broyage. Pour les applications biologiques, la configuration de base est en grande partie la même, mais le broyage est effectué à des températures cryogéniques. Cela a nécessité l’adaptation des FIB-SEM standard pour avoir des étages cryo-refroidis qui maintiennent des températures constantes et de faibles taux de contamination de surface, ainsi que des sas pour faciliter le transfert d’échantillons sans dévitrification ni contamination. Les navettes d’échantillons ont également été modifiées pour permettre le montage d’une gamme de supports différents à l’intérieur du cryoFIB-SEM, y compris des grilles TEM, des planchettes et des capillaires. Plusieurs groupes clés de chercheurs ont joué un rôle central dans le développement de ces méthodes et dans les progrès technologiques continus dans ce domaine 7,8,9,10,11,12. Les solutions commerciales sont maintenant plus largement disponibles pour le broyage biologique FIB à température cryogénique et le broyage sur grille des lamelles devient plus courant, compte tenu d’un échantillon optimisé.
Une gamme de techniques de température ambiante et de cryoEM peut être utilisée pour visualiser l’information cellulaire à toutes les échelles de la vie, des organismes multicellulaires entiers à résolution modeste à la compréhension du contexte de processus complexes au niveau cellulaire et, plus en détail encore, à la détermination de in situ Structures moléculaires13,14,15,16,17,18,19. Les techniques classiques à température ambiante comprennent la sectionnement des cellules et des tissus fixes et colorés incorporés dans la résine par ultramicrotomie pour l’analyse de la morphologie cellulaire par TEM (pour un examen, voir Studer et coll., 200820). Des techniques alternatives ont été développées exploitant la diffusion électronique secondaire par MEB pour imager la surface de blocs de cellules préservées, avant d’enlever progressivement le matériau soit avec un couteau (imagerie de face de bloc en série) ou un faisceau d’ions focalisés.21,22,23. Cette technique a également été mise en œuvre avec succès à des températures cryogéniques (appelée imagerie cryo-volume) avec un cryoFIB-SEM sur des blocs vitreux non colorés de cellules ou de tissus24. Alternativement, des lamelles plus épaisses (~15 μm d’épaisseur) peuvent être broyées et étudiées par imagerie STEM25. En utilisant ces techniques, des blocs entiers contenant de nombreuses cellules peuvent être imagés pour recueillir des informations sur la population ou un organe / organisme entier peut être imagé et reconstruit en 3D. Cependant, pour accéder à l’information moléculaire à haute résolution des cellules, les échantillons doivent être conservés dans un état quasi natif, congelé-hydraté et, par conséquent, doivent être préparés dans des conditions cryogéniques. La cryo-microscopie électronique des coupes vitreuses (CEMOVIS) est une technique par laquelle des blocs de matériel biologique congelés à haute pression sont sectionnés dans des conditions cryogéniques avec un ultramicrotome. Cela produit des rubans de cryo-sections (40-100 nm d’épaisseur)26, qui sont attachés à une grille EM et imagés dans le GDT. Cependant, l’interaction physique du couteau avec l’échantillon vitré provoque des cavsanges et des artefacts de compression qui peuvent gravement déformer la structure cellulaire.27,28,29,30. Les sections plus épaisses sont plus sujettes à ces artefacts, ce qui rend impossible l’utilisation de sections plus épaisses que ~70 nm26. Cette limitation restreint considérablement la vue 3D de la structure biologique dans le tomogramme. Le fraisage FIB à des températures cryogéniques ne connaît pas ces problèmes, mais a ses propres artefacts causés par des vitesses de broyage différentielles sur certaines parties de l’échantillon, conduisant à des épaisseurs variables dans une lamelle - appelée rideau. Ce problème est atténué par l’application d’une couche organoplatine appliquée via un système d’injection de gaz (SIG), qui protège le bord avant de la lamelle pendant le broyage.31. La limite supérieure de l’épaisseur de l’échantillon pour le broyage FIB sur grille est définie par la capacité de congeler l’échantillon tout en le maintenant vitreux32, bien que, avec l’introduction de techniques de cryolevage et de supports d’échantillons adaptés aux échantillons biologiques, le broyage FIB peut également être utilisé pour traiter des échantillons congelés à haute pression31,33,34,35. De plus, les échantillons congelés ne peuvent pas être trop minces, car il doit y avoir suffisamment de matériel biologique pour générer une lamelle de taille raisonnable qui fournira une surface suffisante pour recueillir des séries d’inclinaison au grossissement requis. Ce problème peut être atténué en broyant des amas de cellules plus petites, telles que des bactéries ou des levures. L’épaisseur finale des lamelles (~100-300 nm) est généralement dictée par l’intégrité de l’échantillon et la stratégie de broyage. Les lamelles plus minces sont préférables pour les travaux structurels à haute résolution, tels que la moyenne des sous-tomogrammes, mais les lamelles plus épaisses contiennent des volumes cellulaires beaucoup plus importants que ceux qui peuvent être atteints par CEMOVIS, fournissant plus de contexte cellulaire dans un échantillon presque préservé nativement. Le broyage FIB peut également être utilisé pour amincir les cristaux de protéines surgelés pour les études de diffraction électronique36.
Le broyage FIB des cellules vitreuses vaut le temps et les efforts à réaliser si la question scientifique nécessite des détails moléculaires à haute résolution de spécimens quasi natifs in situ. Avec l’accès à plus d’installations pour la production de routine de lamelles, l’étape limitant la vitesse est souvent l’optimisation de l’échantillon avant le broyage, où le temps doit être pris pour s’assurer que l’échantillon est vitreux et d’une épaisseur appropriée pour produire des lamelles robustes et uniformément minces. L’optimisation de l’échantillon pour les globules rouges humains surgelés par bac FIB infectés par des parasites Plasmodium falciparum , l’agent causal du paludisme, est décrite ici, mais cette approche pourrait être adaptée à n’importe quel échantillon donné.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>c-clips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Direct quote from Thermo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>Sub-angstrom</td>
			<td>CSA-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound 2</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-FIB specific autogrid rims</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1205101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E64</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emitech K100X glow discharge unit</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12633012</td>
			<td>Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>350864X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11562203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Sub-angstrom</td>
			<td>PB</td>
			<td>For clipped grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>For clipped grids - direct quote from Thermo Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Home-made manual plunge freezing rig</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human blood</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>UK National Blood and Transplant service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>n/a</td>
			<td>FIB-SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td>sputter coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE900</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td>e-beam rotary coater. In a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linkam cryo-stage for light microscope</td>
			<td>Linkam</td>
			<td>Model No. CMS196</td>
			<td>Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse E200 light microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C17nCuH2-01</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C17nCu20-01</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum PP3010 prep-chamber</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>n/a</td>
			<td>sputter coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage.</td>
			<td>FEI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>FIB-SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen</td>
			<td>Viking Direct</td>
			<td>ND538522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFS Titan Krios 300 kV TEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>TEM equipped with a K2 or K3 camera.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatmann grade 1 filter paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA1001150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Scope A1 light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td>with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography

Un protocole de préparation de cryolamelles à partir de grilles surgelées d’érythrocytes humains infectés par Plasmodium falciparum est présenté ici, qui pourrait facilement être adapté à d’autres échantillons biologiques. Les principes de base pour la préparation des échantillons, le broyage et l’observation des lamelles sont communs à tous les instruments et le protocole peut être suivi comme guide général pour la préparation cryo-lamelle sur grille pour la cryo-microscopie électronique (cryoEM) et la cryo-tomographie électronique (cryoET). Les grilles de microscopie électronique soutenant les cellules sont surgelées dans de l’éthane liquide refroidi à l’azote liquide à l’aide d’un congélateur manuel ou automatisé, puis criblées sur un microscope optique équipé d’un cryo-étage. Les grilles congelées sont transférées dans un microscope électronique cryo-balayage équipé d’un faisceau d’ions focalisés (cryoFIB-SEM). Les grilles sont régulièrement revêtues de pulvérisation avant le broyage, ce qui facilite la dispersion de l’accumulation de charge pendant le fraisage. Alternativement, un revêtement rotatif à faisceau électrique peut être utilisé pour appliquer une couche de carbone-platine sur les grilles, dont l’épaisseur exacte peut être contrôlée plus précisément. Une fois à l’intérieur du cryoFIB-SEM, un revêtement supplémentaire d’un composé organoplatine est appliqué à la surface de la grille via un système d’injection de gaz (SIG). Cette couche protège le bord antérieur de la lamelle lors de son broyage, dont l’intégrité est essentielle pour obtenir des lamelles uniformément minces. Les régions d’intérêt sont identifiées par MEB et le broyage est effectué par étapes, réduisant le courant du faisceau d’ions lorsque la lamelle atteint la transparence des électrons, afin d’éviter une génération excessive de chaleur. Une grille avec plusieurs lamelles est ensuite transférée dans un microscope électronique à transmission (MET) dans des conditions cryogéniques pour une acquisition en série d’inclinaison. Un flux de travail robuste et sans contamination pour la préparation des lamelles est une étape essentielle pour les techniques en aval, y compris la cryoEM cellulaire, la cryoET et la moyenne des sous-tomogrammes. Le développement de ces techniques, en particulier pour le levage et le broyage d’échantillons congelés à haute pression, est hautement prioritaire sur le terrain.

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Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Utilisation du broyage par faisceau d’ions focalisés pour produire des lamelles vitreuses sur grille à partir d’échantillons biologiques congelés pour la cryotomographie électronique.

Préparation de lamelles à partir d’échantillons biologiques vitreux à l’aide d’un microscope électronique à balayage à double faisceau pour la cryotomographie électronique

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Ce protocole décrit la préparation de lamelles vitrées de globules rouges infectés par Plasmodium-falciparum pour la cryotomographie électronique. Cela permet d’observer directement des informations structurelles détaillées sur la façon dont le parasite cause le paludisme. La cryotomographie électronique enregistre des informations à haute résolution sur l’intérieur des cellules.Il est assez puissant pour observer des complexes protéiques uniques in situ, qui peuvent être extraits et moyennés par calcul pour révéler des informations structurelles tridimensionnelles sur les protéines. Ce protocole peut être facilement adapté à différents types de cellules et peut être un point de départ pour quelqu’un de nouveau dans la production de lamelles vitreuses pour la cryo-tomographie électronique. Il s’agit d’Alejandra Carbajal, qui appliquera le protocole aujourd’hui.Pour commencer, filtrez les grilles de cuivre gelées à l’aide d’un CryoStage pour un microscope optique avec une attention particulière au gradient de glace à travers la grille. Vérifiez les carrés de la grille individuelle pour la couverture cellulaire dans les zones les plus minces de la glace. Utilisez un marqueur noir indélébile pour marquer l’avant et le côté opposé des jantes Autogrid spécifiques à Cryo-FIB-SEM.Chargez la grille clipsée dans la navette Cryo-FIB-SEM avec le côté carbone vers le haut et appliquez une couche rotative de carbone ou de platine à faisceau électronique de quatre nanomètres d’épaisseur à la surface des cellules. Chargez la navette dans le Cryo-FIB-SEM et évaluez la distribution des cellules sur chaque grille par MEB à cinq kilovolts. Prenez une vue d’ensemble à faible grossissement à 100 puissance pour examiner les gradients de glace sur la grille.Ensuite, prenez des images à fort grossissement à 5 000 pour regarder les carrés individuels de la grille. Appliquez une couche organoplatine de deux micromètres à la surface de chaque grille en insérant l’aiguille du système d’injection de gaz dans la chambre au-dessus de la grille et en réchauffant la source organoplatine à une température définie pendant un temps défini pour produire un flux de vapeur. Pour observer l’échantillon, inclinez l’échantillon de sorte que le plan de la grille soit à environ 10 degrés de l’angle d’incidence du faisceau d’ions et déplacez le centre d’un carré de grille approprié pour être vu dans les images SEM et FIB.en utilisant le faisceau d’ions à faible courant, Examinez la grille à fort grossissement pour visualiser les cellules au centre d’un carré de grille. Marquez deux motifs rectangulaires à fraiser, l’un au-dessus et l’autre au-dessous d’une région protégée de trois micromètres d’épaisseur. Choisissez ensuite les réglages du faisceau et corrigez l’astigmatisme en ajustant la luminosité et le contraste.une fois la configuration terminée, commencez à fraiser à un courant de 300 picoampères tout en surveillant la progression en direct dans la vue du faisceau d’ions et par intermittence par MEB. L’échantillon est vérifié dans la vue MEB et après le premier fraisage, Si le faisceau d’ions n’a pas traversé l’échantillon au-dessus et au-dessous de la région protégée, enlever plus de matière en augmentant la hauteur des motifs rectangulaires. Arrêtez le fraisage lorsque la surface au-dessus et au-dessous de la lamelle est complètement lisse dans la vue du faisceau d’ions.Répétez le processus de fraisage par étapes, en réduisant le courant du faisceau d’ions à chaque fois jusqu’à ce qu’une épaisseur de 300 nanomètres soit atteinte. Notez la position X Y Z de chaque lamelle. Pour polir les lamelles à la fin de l’expérience, utilisez une vue d’ensemble SEM à faible grossissement pour sélectionner un groupe de lamelles à polir et marquer la racine de polissage.Une fois la racine de polissage marquée, réduisez l’espace entre les deux motifs rectangulaires à 100 à 200 nanomètres et commencez le polissage à un courant de faisceau d’ions de 30 picoampères. Surveiller la progression par SEM à deux ou trois kilovolts. Arrêtez le polissage lorsque le contraste dans la lamelle est perdu par SEM ou lorsque la couche organoplatine ou la lamelle elle-même commence à perdre son intégrité.Acquérir et enregistrer des images SEM à faible grossissement de chaque lamelle. Une fois l’expérience terminée, retirez la navette du microscope. Retirez les grilles avec des lamelles et conservez-les sous azote liquide.Manipulez les grilles avec soin. Pour étudier la morphologie, les schizontes ont été bloqués à différents stades de sortie en utilisant le composé deux dans les inhibiteurs E-64. En présence du composé deux, la limite entre les membranes parasites et l’hémoglobine environnante dans le globule rouge hôte était bien définie.Les vacuoles parasitophores intactes, ou PV, étaient emballées avec des mérozoïtes dans un seul groupe de cristaux d’hémozoïne. Lorsque les deux schizontes synchronisés composés ont été lavés dans E-64, la membrane PV a été rompue et les mérozoïtes se sont répandus dans le globule rouge. Un exemple typique de bonne distribution cellulaire sur une grille de cuivre montre de gros globules rouges avec une périphérie bien définie et une membrane vacuole intacte.Dans un globule rouge hôte partiellement effondré, les mérozoïtes individuels ont été visualisés comme de petits groupes de cellules. Chaque schizonte avait une tache noire en son centre indiquant la position des cristaux d’hémozoïne. Après le broyage, les grilles ont été chargées dans le TEM pour identifier les positions des lamelles et trouver des zones appropriées à cibler par tomographie.Dans l’échantillon micrographique, on peut voir un globule rouge récemment envahi par un mérozoïte. Le mérozoïte entouré par la membrane dérivée de la cellule hôte pouvait être vu à l’intérieur des limites du globule rouge. À l’extrémité apicale du mérozoïte, les deux membranes entourant la cellule et les quatre membranes empilées au sommet du mérozoïte associées à une caractéristique en forme de champignon dense en électrons étaient clairement visibles.Dans le cytoplasme du mérozoïte, un événement de fusion entre la membrane plasmique du mérozoïte et une vésicule multicouche a été identifié. Dans une analyse TEM supplémentaire d’une lamelle de 230 nanomètres d’épaisseur, la morphologie typique d’un mérozoïte mature traité avec E-64 a été observée. Dans la membrane des globules rouges, la membrane plasmique mérozoïte peut être vue avec des organites comme le complexe de membrane interne, les anneaux polaires, les micronèmes, les rhoptries et l’enveloppe nucléaire.La partie la plus importante de cette technique est l’optimisation des grilles pour permettre une production reproductible et efficace de lamelles minces. Le développement ultérieur de cette technique permettra aux chercheurs de visualiser les molécules monoprotéiques dans les parasites du paludisme et de déterminer leur rôle dans l’évacuation du paludisme.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Utilisation de résonance paramagnétique électronique dans des échantillons biologiques à température ambiante et à 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Recherche

Biochimie

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Préparation rapide de la grille pour la cryo-microscopie électronique à résolution temporelle

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Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

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Préparation et micro-usinage Cryo-FIB de Saccharomyces cerevisiae pour la cryo-tomographie électronique

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Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Cryo-microscopie électronique à particule unique : de l’échantillon à la structure

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Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micromodélisation de microscopie électronique à transmission pour diriger le positionnement des cellules dans les flux de travail de cryo-tomographie électronique à cellules entières

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Un flux de travail robuste de traitement par cryo-microscopie électronique (cryo-EM) à particule unique avec cryoSPARC, RELION et Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Préparation de particules de noyau de nucléosomes complexées avec des facteurs de réparation de l’ADN pour la détermination structurelle de la cryo-microscopie électronique

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Extraction de microtubules modifiés de cellules de mammifères pour étudier les complexes microtubule-protéine par cryomicroscopie électronique

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Application du graphène monocouche aux grilles de cryo-microscopie électronique pour la détermination de la structure à haute résolution

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...