Name: preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography
Uploaded: 2021-08-05T13:30:00
Duration: 7 min
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Diese Forschung wurde ganz oder teilweise vom Wellcome Trust finanziert (212916/Z/18/Z). Zum Zwecke des Open Access hat der Autor eine CC BY-Lizenz für das öffentliche Urheberrecht auf jede vom Autor akzeptierte Manuskriptversion angewendet, die sich aus dieser Einreichung ergibt.
Dieses Projekt, für das diese Methode entwickelt wurde, wurde durch ein Stipendium des Medical Research Council MR/P010288/1 finanziert, das an Helen R. Saibil, Roland A. Fleck und Michael J. Blackman vergeben wurde. Die Kulturen von P. falciparum wurden am Francis Crick Institute mit Unterstützung von Mitgliedern der Gruppe von Michael J. Blackman gezüchtet. Die Autoren danken Dr. Ser Ying (Michele) Tan für die Bereitstellung der Bilder von mit Compound 2 und E64 behandelten Schizonten in dünnen Blutausstrichen. Die meisten Lamellen wurden mit Unterstützung von Mitarbeitern des eBIC hergestellt und wir sind dankbar für den Zugang zum Scios-Zweistrahl-KryoFIB-REM auf Forschungsantrag NT21004. Die Autoren würdigen auch die Unterstützung des Royal Society Industry Fellowship Scheme (INF\R2\202061) bei der Weiterentwicklung der FIB-Frästechnik innerhalb des CUI. Die Autoren bedanken sich auch bei Helen R. Saibil für die nützlichen Diskussionen in Bezug auf dieses Methodenpapier und die Betreuung des Projekts.

Menschliches Blut wurde von anonymisierten Spendern über den britischen National Blood and Transplant Service gewonnen und wird innerhalb von 2 Wochen nach Erhalt verwendet. Für die Verwendung ist keine ethische Genehmigung erforderlich.
1. Präparation und Einfrieren von mit Plasmodium falciparum infizierten roten Blutkörperchen
<ol><li>Isolierung reifer Schizonten durch Zentrifugation (1.580 x g) über ein isotonisches Dichtegradientenmedium mit 70 % (v/v) (für Standardverfahren zur Kultivierung asexueller Blutstadien von 3D7 Plasmodium falciparum in menschlichen Erythrozyten siehe Blackman, M.J., 1995,37).</li>
	<li>Fixieren Sie die luftgetrockneten dünnen Blutfilme auf einem Objektträger mit 100 % Methanol, um die morphologische Homogenität der Schizonten zu überprüfen, bevor Sie sie mit 10 % Giemsa-Färbung in 6,7 mM Phosphatpuffer, pH 7,1, färben. ANMERKUNG: Um die Vorbereitung für Schizonten, die an bestimmten Austrittspunkten blockiert sind, zu bereichern, können Schizonten weiter mit Compound-2- und E64-Inhibitoren synchronisiert werden (siehe Repräsentative Ergebnisse und Abbildung 1 für eine Erklärung der Wirkung dieser Inhibitoren). ACHTUNG: Plasmodium falciparum ist ein humanpathogener Krankheitserreger und darf nur in einer geeigneten Sicherheitseinrichtung gemäß den örtlichen Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien gehandhabt werden.</li>
	<li>Schizonten (240 x g) vorsichtig zentrifugieren, um sie zu pelletieren, und resuspendieren 2x Volumen des Zellpellets des RPMI-Mediums, was zu einer 50%igen Hämatokrit-Suspension führt.</li>
	<li>Tragen Sie auf einer manuellen Tauchgefrieranlage 2,5 μl Schizonten auf die Kohlenstoffseite eines glühentladenen (Verwenden Sie die Einstellungen der Glimmentladungseinheit von 60 s, 30 mA in Luft, behandeln Sie nur die Kohlenstoffseite des Gitters) 200-Mesh-Kupfergitter mit einem 2/4 löchrigen Kohlenstofffilm auf und tupfen Sie ~ 20 s lang von der Rückseite des Gitters mit Filterpapier der Güteklasse 1 mit einer zerrissenen Kante ab. Tauchen Sie in flüssiges, stickstoffgekühltes flüssiges Ethan ein und überführen Sie die Gitter in den Speicher (siehe Materialtabelle für die in dieser Studie verwendeten Geräte). HINWEIS: Das Experiment kann hier pausiert werden, und Gitter können auf unbestimmte Zeit unter flüssigem Stickstoff gespeichert werden. VORSICHT: Flüssiger Stickstoff ist ein Erstickungsmittel und verursacht Erfrierungen; Vorsichtig in einer geeigneten Umgebung mit Sauerstoffüberwachung behandeln. ACHTUNG: Flüssiges Ethan verursacht schwere Verbrennungen und ist brennbar; Verwendung in einem Abzug fern von Zündquellen. HINWEIS: Eingetauchte gefrorene Schizonten sind nicht mehr lebensfähig. Dies wurde durch Inkubation von menschlichem Blut mit mehreren Goldgittern von luftaufgetauten, tiefgefrorenen Schizonten ermittelt und nach mehreren Tagen im Vergleich zu nicht gefrorenen Kontrollen kein Parasitenwachstum beobachtet. Gefrorene Schizontengitter können daher außerhalb von Sicherheitseinrichtungen unter Verwendung der üblichen Sicherheits- und Dekontaminationsverfahren (Handschuhe, Oberflächen-/Werkzeugsterilisation mit >70 % Ethanol und Entsorgung von Gittern mit >70 % Ethanol) sicher gehandhabt werden.</li>
	<li>Siebgitter mit einem Kryotisch für ein Lichtmikroskop unter besonderer Berücksichtigung des Eisgradienten über das Gitter. Überprüfen Sie in den dünneren Bereichen des Eises die einzelnen Gitterquadrate auf Zellbedeckung. HINWEIS: Die besten Quadrate sollten in der Mitte des Rasterquadrats eine Zelle dick sein (Abbildung 2). Dadurch wird sichergestellt, dass eine Lamelle quer über die Mitte des Quadrats gefräst werden kann, ohne das dickere Eis an den Rändern gegen die Gitterstäbe zu schlagen. Hier kann das Experiment pausiert werden, und Gitter können auf unbestimmte Zeit unter flüssigem Stickstoff gelagert werden. Wenn Zellen einen Fluoreszenzmarker tragen, können Gitter auch mit cryoCLEM gescreent werden, um relevante X/Y-Positionen zu lokalisieren, die mit Gitterpositionen im KryoFIB-REM korreliert werden können, um das Fräsen zu steuern.</li>
</ol>2. On-Grid-FIB-Fräsen von tiefgefrorenen Tauchzellen
<ol><li>Markieren Sie die Vorderseite der CryoFIB-spezifischen Autogrid-Felgen mit einem schwarzen, unauslöschlichen Markierungsstift, um die Mitte des Ausschnitts und die gegenüberliegende Seite der Felge anzuzeigen (Abbildung 3). Richten Sie die Clipstation ein und clippen Sie die Gitter mit der Carbonseite nach unten in die markierten Ringe.</li>
	<li>Laden Sie die Gitter mit der Kohlenstoffseite nach oben in das CryoFIB-REM-Shuttle (typischerweise 2 Gitter, je nach Shuttle) und tragen Sie eine Platin-Sputterschicht in einer Argonatmosphäre (5 x 10-2 mbar) (5 mA für 60 s - Dicke ist variabel) oder eine Kohlenstoff/Platin-E-Beam-Rotationsschicht (~4 nm Dicke) auf die Oberfläche der Zellen auf. HINWEIS: Beide Arten von Beschichtungen unterstützen die Ladungsverteilung während der REM-Bildgebung. Der Vorteil des e-beam Rotationsbeschichters besteht darin, dass die exakte Dicke der Beschichtung vorgegeben werden kann.</li>
	<li>Laden Sie das Shuttle in das kryoFIB-REM und beurteilen Sie die Zellverteilung auf jedem Gitter mittels REM bei 5 kV (13 pA oder 25 pA). Machen Sie eine Übersicht mit geringer Vergrößerung (~100x), um die Eisgradienten im Gitter zu betrachten. Nehmen Sie dann Bilder mit höherer Vergrößerung (~5.000-fach) auf, um einzelne Rasterquadrate zu betrachten und die Bereiche des Gitters mit sichtbaren zellulären Merkmalen und geringer Oberflächenkontamination zu identifizieren, die gefräst werden sollen.</li>
	<li>Mit dem Gasinjektionssystem (GIS) wird eine >2 μm Organoplatinschicht auf die Oberfläche jedes Gitters aufgetragen. Führen Sie dazu die GIS-Nadel in die Kammer über dem Gitter ein und erwärmen Sie die Organoplatinquelle für eine bestimmte Zeit auf eine eingestellte Temperatur (z. B. ~27 °C für 3-10 s), um einen Dampfstrom zu erzeugen. HINWEIS: Der Anwendungswinkel, die Temperatur und das Timing der Organoplatinbeschichtung über die GIS-Nadel sollten optimiert werden, um eine gleichmäßige Beschichtung zu maximieren. Dies hängt vom verwendeten KryoFIB-REM ab (weitere Erläuterungen finden Sie unter Repräsentative Ergebnisse ).</li>
	<li>Kippen Sie die Probe so, dass die Ebene des Gitters ~10° vom Einfallswinkel des Ionenstrahls entfernt ist, und verschieben Sie die Mitte eines geeigneten Gitterquadrats, das sowohl in den REM- als auch in den FIB-Bildern zu sehen ist.</li>
	<li>Untersuchen Sie das Gitter mit dem Ionenstrahl bei niedrigem Strom (nominell 1,5 pA, 30 kV) und gehen Sie zu einer ausreichend hohen Vergrößerung (~7.000x), um die Zellen in der Mitte eines Gitterquadrats sichtbar zu machen. Bringen Sie die Probe beim ersten Frässtrom (300 pA) in den Fokus und korrigieren Sie sie auf Astigmatismus. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast an und markieren Sie dann zwei rechteckige Muster, die gefräst werden sollen, eines über und eines unter einem 3 μm dicken geschützten Bereich, dessen Mitte die gewünschte Position der endgültigen Lamelle ist. HINWEIS: Die gewählte Breite der Muster hängt von der Topografie der umgebenden Zellschicht und der Zellgröße ab. 7-20 μm ist eine geeignete Breite für Schizonten, aber breitere Lamellen brauchen länger zum Fräsen. Die gewählte Höhe der Muster für den ersten Frässchritt hängt von der Probendicke ab und beginnt bei etwa 6 μm; Dies muss ggf. während des Fräsens angepasst werden. Das Fräsen erfolgt gerichtet von der äußeren Ober- und Unterkante der Muster in Richtung der Lamellenfläche. Dies kann parallel erfolgen, wobei beide Muster gleichzeitig oder nacheinander gefräst werden, wobei zuerst Material von oben und dann von unten entfernt wird.</li>
	<li>Beginnen Sie mit dem Fräsen beim ersten Strom; Überwachen Sie den Live-Fortschritt in der Ionenstrahlansicht und intermittierend per REM (5 kV, 13 oder 25 pA). Prüfen Sie, ob der Ionenstrahl die Probe ober- und unterhalb des geschützten Bereichs durchbrochen hat. Wenn nicht, erhöhen Sie die Höhe der rechteckigen Muster, um mehr Material zu entfernen. Stoppen Sie, wenn die Oberfläche ober- und unterhalb der Lamelle in der Ionenstrahlansicht vollständig glatt ist. ANMERKUNG: Der Ionenstrahl hat die Probe ober- und unterhalb des geschützten Bereichs durchbrochen, wenn das Innere der rechteckigen Muster keine Merkmale in der Brennebene enthält. Einige Funktionen, wie z. B. Rasterleisten, sind möglicherweise unscharf im Hintergrund sichtbar.</li>
	<li>Wechsel auf den nächsten Frässtrom (100 pA); Fokussieren Sie und passen Sie die Helligkeit/den Kontrast an. Verringern Sie den Abstand zwischen den beiden rechteckigen Mustern auf 1,5 μm und verringern Sie die Musterhöhe, um nur das ungefräste Material abzudecken. Beginnen Sie mit dem Fräsen mit dem neuen Strom, bis die Oberfläche ober- und unterhalb der Lamelle vollständig glatt ist.</li>
	<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang schrittweise, bis eine Dicke von 0,3 μm erreicht ist, wobei der Ionenstrahlstrom jedes Mal gemäß dem Frässchema in Tabelle 1 reduziert wird.</li>
	<li>Fräsen Sie mehrere Lamellen (die Menge ist abhängig von der Dicke der Probe und der zur Verfügung stehenden Zeit) auf einem oder beiden Gittern auf eine Dicke von 0,3 μm, notieren Sie die X/Y/Z-Position jeder Lamelle und reservieren Sie am Ende der Sitzung ~1-2 h, um die Lamellen auf ihre endgültige Dicke (60-200 nm) zu polieren.</li>
	<li>Verschaffen Sie sich einen REM-Überblick über das gesamte Gitter bei geringer Vergrößerung und planen Sie eine Polierroute, die von den Lamellen an der Vorderseite des Gitters (näher an der Ionenstrahlquelle) bis zu den Lamellen am hinteren Teil des Gitters (am weitesten von der Ionenstrahlquelle entfernt) beginnt (Abbildung 5). Anmerkungen: Dadurch wird die erneute Ablagerung von abgetragenem Material auf der Oberfläche von polierten Lamellen reduziert.</li>
	<li>Reduzieren Sie den Abstand zwischen den beiden rechteckigen Mustern auf 100-200 nm und beginnen Sie den letzten Polierschritt mit einem Ionenstrahlstrom von 30 pA. Überwachen Sie den Fortschritt durch REM bei 2-3 kV (13 pA, Verweilzeit = 300 n, 3072 x 2048, ~2 s für ein Vollformat) und stoppen Sie das Polieren, wenn der Kontrast in der Lamelle durch das REM verloren geht oder wenn die Organoplatinschicht der Lamelle selbst an Integrität verliert.</li>
	<li>Bevor Sie die Gitter entfernen, nehmen Sie ein REM-Bild des gesamten Gitters mit geringer Vergrößerung auf und speichern Sie Bilder von jeder Lamelle. Verwenden Sie sie, um das Raster später im TEM zu überprüfen. Unterbrechen Sie hier das Experiment und lagern Sie die Gitter mit Lamellen unter flüssigem Stickstoff - vorsichtig behandeln. Anmerkungen: Die Gitter können bei der Entnahme aus dem CryoFIB-REM leicht gesputtert werden, was dazu beitragen kann, die Drift und Aufladung im TEM bei hoher Vergrößerung zu begrenzen, aber dies sollte mit Vorsicht erfolgen, da zu viel Sputterbeschichtung den biologischen Inhalt in den Lamellen verdecken kann. In diesem Stadium ist es möglich, Lamellen auf Fluoreszenz zu untersuchen. Um ein ausreichendes Signal zu erhalten, hängt es jedoch von der Häufigkeit des markierten Proteins innerhalb der Dicke der Lamelle ab. Bei der Handhabung der Gitter ist große Vorsicht geboten, um Schäden an den Lamellen zu begrenzen und Oberflächenverunreinigungen zu vermeiden.</li>
</ol>3. Tilt-Serienerfassung und allgemeiner Überblick über die Datenverarbeitung
<ol><li>Laden Sie die Gitter in den TEM und richten Sie die Fräsrichtung senkrecht zur Neigungsachse des Tisches aus. Anmerkungen: Die Ausrichtung der Gitter erfolgt mit dem Auge anhand der Markierungen auf dem Autogrid-Rand. Eine Fehlerspanne von ~10° ist akzeptabel, da sonst die Wände des Grabens auf beiden Seiten der Lamelle die Lamelle verdecken können, wenn das Gitter geneigt wird.</li>
	<li>Erfassen Sie eine Karte mit geringer Vergrößerung (~150x) des gesamten Gitters und lokalisieren Sie die Lamellen. Erfassen Sie dann eine Karte mit mittlerer Vergrößerung (~1.500x, abhängig von der Lamellengröße) jeder Lamelle und lokalisieren Sie die interessierenden Bereiche.</li>
	<li>Kippen Sie das Gitter um ±10°, um die Ebene der Lamelle (nicht das Gitter) senkrecht zur optischen Achse zu machen HINWEIS: Die Richtung der Vorneigung kann durch die Position der Vorderkante der Lamellen (auf der Suche nach der übrig gebliebenen Organoplatinschicht) in den Karten mit niedriger und mittlerer Vergrößerung bestimmt werden. Für das hier verwendete TEM benötigen Gitter eine Vorneigung von +10°, wenn die Vorderkanten der Lamellen in den Karten nach oben zeigen, und eine Vorneigung von -10°, wenn sie nach unten zeigen. Jedes Raster kann unterschiedlich sein, je nachdem, wie es aufgenommen und in den Autoloader eingefügt wurde.</li>
	<li>Erfassen Sie die dosissymmetrische Neigungsreihe38 (z. B. -54° bis +54° mit einem Inkrement von 3-5°) mit einer Pixelgröße, die sowohl das Sichtfeld als auch die Auflösung ermöglicht, die für den interessierenden Bereich erforderlich ist. Verwenden Sie einen Bereich von Unschärfewerten zwischen -2 und -5 μm. Sammeln Sie Filme mit 3-10 Bildern in jedem Schritt und passen Sie dazu diese Parameter je nach Pixelgröße an, um eine Gesamtdosis von ~150 e-/Å2 (für ein 300 kV TEM) zu akkumulieren. Anmerkungen: Risse in der Lamelle sollten vermieden werden, da diese Bereiche abdriften können. Oberflächenverunreinigungen sollten ebenfalls vermieden werden, da sie den interessierenden Bereich oder den Fokusbereich bei hoher Neigung verdecken können.</li>
	<li>Korrigieren Sie die Filme mit einem Programm wie MotionCor239. Wenden Sie einen Dosisgewichtungsfilter auf die korrigierten Bilder (akkumuliertes e-/Bild)40 an und schätzen Sie die Unschärfe jedes Bildes mit einem Programm wie CTFFIND441.</li>
	<li>Verwenden Sie Fiducial-less Alignment (Patch Tracking) in einem Programm wie z.B. bei etomo (IMOD)42 , um die Ausrichtung und Winkelbeziehung der Bilder in Tilt-Serien zu berechnen.</li>
	<li>Geben Sie die Ausrichtungs- und Rotationsinformationen zusammen mit den Unschärfewerten in ein Programm ein, das eine dreidimensionale CTF-Korrektur anwenden kann, z. B. NovaCTF43. Berechnen Sie ein korrigiertes Tomogramm, um Ausgabetomogramme mit Binning-Faktoren zu erhalten, die für die nachgelagerte Analyse relevant sind.</li>
	<li>Analysieren Sie die Rekonstruktionen und bereiten Sie sich auf eine nachgelagerte Verarbeitung vor, z. B. Filterung, Segmentierung oder Sub-Tomogramm-Mittelung.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Während das KryoFIB-Mahlen immer mehr zur Routine wird, ist dies bei der Vorbereitung optimaler Proben für das Mahlen nicht der Fall. Daher finden die meisten kritischen Schritte in diesem Protokoll statt, bevor die Probe das KryoFIB-REM erreicht. Eine Probenoptimierung durch mehrere Runden der Zellpräparation, Tauchgefrieren und Screening durch Licht- und Elektronenmikroskopie ist erforderlich, um die bestmögliche Probe zu erzeugen, bevor das Mahlen versucht wird. Die bestmögliche Probe erhöht nicht nur die Erfolgschancen, sondern optimiert auch den Einsatz der Geräte. Aus diesem Grund verlangen die meisten nationalen Einrichtungen den Nachweis, dass eine ausreichende Optimierung durchgeführt wurde, bevor sie Zeit für ihre Maschinen gewähren. Im Inneren des CryoFIB-REM ist die Maximierung der Wirksamkeit der Organoplatinbeschichtung von entscheidender Bedeutung, um gleichmäßig dünne Lamellen zu erzeugen. Schließlich sind Geduld und eine gute Probenhandhabung eine Grundvoraussetzung für den Benutzer, der mehrere Tage lang sitzen muss, um Gitter mit empfindlichen Lamellen herzustellen und dann zu übertragen. Dies kann sich mit der Einführung automatisierter Frässtrategien ändern47,48, aber noch ist der gesamte Fräsprozess in den meisten Anlagen weitgehend manuell.
Während sich die Arbeit ausschließlich auf P. falciparum schizonts konzentrierte, konnte die hier vorgestellte Methode leicht modifiziert werden, um die Gitterpräparation und das Mahlen für andere Zelltypen zu optimieren. Wichtige Faktoren, die zu berücksichtigen sind, sind die Dichte der Zellen, die auf das Gitter aufgetragen werden, der Gittertyp (Kupfer ist für einige Zellen giftig), die Größe und der Abstand der Löcher im Kohlenstofffilm, die Löschzeit und die Methode des Löschens (ein-/doppelseitig, manuell oder automatisiert). Wenn die Zellen auf den Gittern (in der Regel Goldgitter mit einem löchrigen Kohlenstofffilm) gezüchtet werden, kann die Konfluenz vor dem Abtupfen und Einfrieren durch Lichtmikroskopie überprüft werden. Die Frässtrategie hängt davon ab, wie die Zellen auf dem Gitter abgelegt werden. Bei mit Malaria infizierten roten Blutkörperchen ist das Gitter im Wesentlichen von einer ununterbrochenen Zellschicht überzogen, die in einigen Bereichen dicker und in anderen Bereichen dünner ist. Das Fräsen wird an mehreren Stellen in einem Bereich entlang dieses Gradienten durchgeführt, wo die Eisdicke Lamellen erzeugt, die eine für die Tomographie geeignete Größe haben. Dieser Ansatz eignet sich gut für kleinere Zellen, da Sie Lamellen erzeugen können, die eine Scheibe durch mehrere Zellen enthalten. Bei größeren Zellen oder Zellklumpen kann es sein, dass eine Zelle oder ein Zellklumpen eine Lamelle bildet.
Die Handhabung des Rasters und der Probentransfer sind nach wie vor eine der größten Herausforderungen dieses Arbeitsablaufs. Lamellen können aufgrund von Brüchen oder Rissen, Vorhangartefakten, die die Biologie verdecken, übermäßiger Oberflächenkontamination sowie Problemen mit der Gitterausrichtung innerhalb des TEM verloren gehen, was einen zusätzlichen Handhabungsschritt erfordert, um das Gitter neu zu positionieren. Das Ausmaß der Verluste variiert von Tag zu Tag und von Netz zu Netz, wird aber durch Übung und Erfahrung im Umgang mit der Zeit verbessert. In dieser Studie wurde festgestellt, dass die Gitter im Autoloader mehrmals vorsichtig neu ausgerichtet werden können, ohne die Lamellen zu zerstören, was manchmal den Vorteil hat, dass Oberflächeneis abgewaschen wird. Eine weitere große Einschränkung dieses Arbeitsablaufs ist die Zeit, die für die Herstellung von Lamellen benötigt wird. Da die Produktion langsam ist, ist es wichtig, eine richtig optimierte Probe zu haben, um das Fräsen so effizient wie möglich zu gestalten.
In jüngster Zeit wurden eine Reihe von Anpassungen für das FIB-Mahlen von glasartigen biologischen Proben eingeführt. Ein Game-Changer ist die Implementierung von kryogenisch gekühlten Lift-Out-Werkzeugen innerhalb der CryoFIB-REM-Kammer, die es ermöglichen, größere Materialblöcke aus unter hohem Druck gefrorenen Proben zu fräsen. Die Blöcke können an einem Metallstab befestigt oder in einem Greifer aufgenommen und zu einer zweiten Probenposition bewegt werden, die ein speziell modifiziertes EM-Gitter enthält. Anschließend können die Blöcke mit Organoplatin beschichtet und zu Lamellen gefräst werden. Die Möglichkeit, Lamellen aus unter hohem Druck gefrorenem Material zu fräsen, bedeutet, dass viel größere Zellen und Gewebe verarbeitet werden können, die durch korrelative Fluoreszenzmikroskopie gezielt auf Bereiche abzielen12. Zu den weiteren neueren Anpassungen der FIB-Fräsmethode gehören die Reduzierung von Vorhangartefakten durch Keilvorfräsen der Probe16, die mikrofluidische Kryofixierung49 und die Photomikrostrukturierung von Elektronenmikroskopiegittern zur Verbesserung der Zellverteilung50. Es wurde auch gezeigt, dass das Fräsen von Mikrodehnungsfugen auf beiden Seiten einer Lamelle die Kompression durch die umgebende Probe verringern kann, wenn sie ihre endgültige Dünneerreicht 51. Dies kann besonders nützlich sein, wenn kontinuierliche Zellschichten gefräst werden, wie z. B. bei der Probe in dieser Studie, bei der während des letzten Polierschritts manchmal eine Biegung der Lamellen zu sehen ist.
Die Zukunft der Elektronenmikroskopie wird wahrscheinlich die Bestimmung von in situ molekularen Strukturen durch Sub-Tomogramm-Mittelung sein, und das FIB-Fräsen ist ein wichtiges Werkzeug, das die Herstellung von glasartigen biologischen Proben für diese Art von Arbeitsabläufen erleichtern wird. Während das FIB-Fräsen für biologische Anwendungen noch in den Kinderschuhen steckt, schreitet die Methodenentwicklung dank der harten Arbeit von Forschern, sowohl akademischer als auch nationaler Einrichtungen, sowie kommerzieller Investitionen in die Entwicklung der KryoFIB-REM-Technologie zur Unterstützung der Forschung in rasantem Tempo voran.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated from:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University
to:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
M. Alejandra Carbajal1 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Nur der zelluläre Inhalt biologischer Proben <500 nm Dicke) kann durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bei kryogenen Temperaturen effektiv abgebildet werden, wodurch der Probenbereich auf Viren, Prokaryoten, einfache einzellige Organismen und dünnere Regionen größerer eukaryotischer Zellen beschränktwird 1. Das rasterfokussierte Ionenstrahl-Mahlen (FIB) ermöglicht die Verdünnung dickerer, tiefgefrorener biologischer Proben zu elektronentransparenten Lamellen bei kryogenen Temperaturen (< -150 °C). Die resultierenden Lamellen werden dann zur Visualisierung und tomographischen Datenerfassung in ein TEM übertragen, was hochauflösende 3D-Rekonstruktionen der zellulären und molekularen Merkmale im Inneren von Zellen ermöglicht (für Übersichtsarbeiten siehe Rigort et al., 20122, Oikonomou et al., 20163, und Wagner et al., 20204).
Das FIB-Fräsen ist aus dem Bereich der Materialwissenschaften hervorgegangen, wo Proben routinemäßig verdünnt werden, um sie für die nachgelagerte Analyse vorzubereiten5. Sie wird in einem Rasterelektronenmikroskop (REM) durchgeführt, das über zwei optische Säulen verfügt: eine herkömmliche Rasterelektronenmikroskopoptik und eine zweite Säule mit Optiken, die in der Lage sind, einen fokussierten Ionenstrahl (FIB) zu erzeugen und fein zu steuern - ein sogenanntes FIB-REM. Auf diese Weise kann ein bestimmter Bereich der Probe durch Ionen abgetragen werden, die von einer Galliumquelle erzeugt werden, wodurch überschüssiges Material entfernt wird und eine Lamelle6 zurückbleibt. Der Fräsprozess wird durch REM-Aufnahmen der Topografie der Probe gesteuert, die zur Lokalisierung von interessanten Bereichen und zur Überwachung des Fräsfortschritts verwendet werden. Für biologische Anwendungen ist der Grundaufbau weitgehend derselbe, aber die Vermahlung erfolgt bei kryogenen Temperaturen. Dies erforderte, dass Standard-FIB-REMs so angepasst wurden, dass sie über kryogekühlte Tische verfügen, die konstante Temperaturen und niedrige Oberflächenkontaminationsraten aufrechterhalten, sowie über Luftschleusen, um den Probentransfer ohne Entglasung oder Kontamination zu erleichtern. Die Probenshuttles wurden ebenfalls modifiziert, um die Montage einer Reihe verschiedener Träger im Inneren des KryoFIB-REM zu ermöglichen, darunter TEM-Gitter, Planchetten und Kapillaren. Mehrere Schlüsselgruppen von Forschern waren von zentraler Bedeutung für die Entwicklung dieser Methoden und den kontinuierlichen technologischen Fortschritt in diesem Bereich 7,8,9,10,11,12. Kommerzielle Lösungen für das biologische FIB-Mahlen bei kryogenen Temperaturen sind jetzt in größerem Umfang verfügbar, und das Fräsen von Lamellen am Netz wird bei einer optimierten Probe immer routinemäßiger.
Eine Reihe von Raumtemperatur- und Kryo-EM-Techniken können verwendet werden, um zelluläre Informationen auf allen Ebenen des Lebens zu visualisieren, von ganzen mehrzelligen Organismen mit bescheidener Auflösung über das Verständnis des Kontexts komplexer Prozesse auf zellulärer Ebene und noch detaillierter bis hin zur Bestimmung von in situ Molekulare Strukturen13,14,15,16,17,18,19. Zu den klassischen Raumtemperaturtechniken gehören das Schneiden von fixierten und gefärbten, in Harz eingebetteten Zellen und Geweben durch Ultramikrotomie zur Analyse der zellulären Morphologie mittels TEM (für eine Übersicht siehe Studer et al., 200820). Es wurden alternative Techniken entwickelt, die die Sekundärelektronenstreuung durch REM nutzen, um die Oberfläche von Blöcken konservierter Zellen abzubilden, bevor das Material entweder mit einem Messer (serielle Blockflächenbildgebung) oder einem fokussierten Ionenstrahl schrittweise entfernt wird21,22,23. Diese Technik wurde auch erfolgreich bei kryogenen Temperaturen (als Kryo-Volumen-Bildgebung bezeichnet) mit einem KryoFIB-REM an glasartigen, ungefärbten Zell- oder Gewebeblöcken eingesetzt24. Alternativ können dickere Lamellen (~15 μm dick) gefräst und mittels STEM-Bildgebung untersucht werden25. Mit diesen Techniken können ganze Blöcke mit vielen Zellen abgebildet werden, um Populationsinformationen zu sammeln, oder ein ganzes Organ/Organismus kann abgebildet und in 3D rekonstruiert werden. Um jedoch auf hochauflösende molekulare Informationen aus Zellen zugreifen zu können, müssen die Proben in einem nahezu nativen, gefrorenen hydratisierten Zustand konserviert und daher unter kryogenen Bedingungen präpariert werden. Die Kryo-Elektronenmikroskopie von Glaskörperschnitten (CEMOVIS) ist eine Technik, bei der unter hohem Druck gefrorene Blöcke aus biologischem Material unter kryogenen Bedingungen mit einem Ultramikrotom geschnitten werden. Dabei entstehen Bänder aus Kryoschnitten (40-100 nm dick)26, die an einem EM-Gitter befestigt und im TEM abgebildet werden. Die physikalische Wechselwirkung des Messers mit der Glaskörperprobe verursacht jedoch Spalten- und Kompressionsartefakte, die die Zellstruktur stark verzerren können27,28,29,30. Dickere Abschnitte sind anfälliger für diese Artefakte, was es unpraktisch macht, Abschnitte zu verwenden, die dicker als ~70 nm sind26. Diese Einschränkung schränkt die 3D-Ansicht der biologischen Struktur im Tomogramm stark ein. Beim FIB-Fräsen bei kryogenen Temperaturen treten diese Probleme nicht auf, sondern es gibt eigene Artefakte, die durch unterschiedliche Mahlraten in Teilen der Probe verursacht werden, was zu unterschiedlichen Dicken innerhalb einer Lamelle führt - dem sogenannten Curtaining. Dieses Problem wird durch das Auftragen einer Organoplatinbeschichtung entschärft, die über ein Gasinjektionssystem (GIS) aufgetragen wird und die Vorderkante der Lamelle während des Fräsens schützt31. Die Obergrenze der Probendicke für das On-Grid-FIB-Fräsen wird durch die Fähigkeit definiert, die Probe einzutauchen und gleichzeitig glasig zu halten32, obwohl mit der Einführung von Kryo-Lift-out-Techniken und angepassten Probenträgern für biologische Proben das FIB-Mahlen auch zur Verarbeitung von unter hohem Druck gefrorenen Proben eingesetzt werden kann31,33,34,35. Darüber hinaus dürfen gefrorene Proben nicht zu dünn sein, da genügend biologisches Material vorhanden sein muss, um eine Lamelle von angemessener Größe zu erzeugen, die genügend Oberfläche bietet, um Kippreihen bei der erforderlichen Vergrößerung zu sammeln. Dieses Problem kann durch das Mahlen von Klumpen kleinerer Zellen wie Bakterien oder Hefen gelindert werden. Die endgültige Lamellendicke (~100-300 nm) wird in der Regel durch die Probenintegrität und die Frässtrategie bestimmt. Dünnere Lamellen eignen sich besser für hochauflösende strukturelle Arbeiten, wie z. B. die Sub-Tomogramm-Mittelung, aber dickere Lamellen enthalten viel größere Zellvolumina, als mit CEMOVIS erreicht werden können, und bieten mehr zellulären Kontext in einer nahezu nativ erhaltenen Probe. Das FIB-Mahlen kann auch verwendet werden, um tiefgefrorene Proteinkristalle für Elektronenbeugungsstudien zu verdünnen36.
Das FIB-Fräsen von Glaskörperzellen ist die Zeit und Mühe wert, wenn die wissenschaftliche Fragestellung hochauflösende molekulare Details von nahezu nativen Proben in situ erfordert. Mit dem Zugang zu mehr Einrichtungen für die routinemäßige Herstellung von Lamellen ist der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt oft die Optimierung der Probe vor dem Fräsen, bei der Zeit genommen werden muss, um sicherzustellen, dass die Probe glasig ist und eine angemessene Dicke aufweist, um robuste und gleichmäßig dünne Lamellen zu erzeugen. Hier wird die Probenoptimierung für das FIB-Fräsen von eingefrorenen menschlichen roten Blutkörperchen beschrieben, die mit Plasmodium falciparum-Parasiten , dem Erreger von Malaria, infiziert sind, aber dieser Ansatz könnte für jede beliebige Probe angepasst werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>c-clips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Direct quote from Thermo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>Sub-angstrom</td>
			<td>CSA-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound 2</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-FIB specific autogrid rims</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1205101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E64</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emitech K100X glow discharge unit</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12633012</td>
			<td>Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>350864X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11562203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Sub-angstrom</td>
			<td>PB</td>
			<td>For clipped grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>For clipped grids - direct quote from Thermo Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Home-made manual plunge freezing rig</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human blood</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>UK National Blood and Transplant service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>n/a</td>
			<td>FIB-SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td>sputter coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE900</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td>e-beam rotary coater. In a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linkam cryo-stage for light microscope</td>
			<td>Linkam</td>
			<td>Model No. CMS196</td>
			<td>Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse E200 light microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C17nCuH2-01</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C17nCu20-01</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum PP3010 prep-chamber</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>n/a</td>
			<td>sputter coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage.</td>
			<td>FEI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>FIB-SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen</td>
			<td>Viking Direct</td>
			<td>ND538522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFS Titan Krios 300 kV TEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>TEM equipped with a K2 or K3 camera.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatmann grade 1 filter paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA1001150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Scope A1 light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td>with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography

Hier wird ein Protokoll zur Herstellung von Kryolamellen aus tiefgefrorenen Gittern von Plasmodium falciparum-infizierten humanen Erythrozyten vorgestellt, das leicht für andere biologische Proben adaptiert werden könnte. Die Grundprinzipien für die Probenvorbereitung, das Fräsen und die Betrachtung von Lamellen sind allen Instrumenten gemeinsam, und das Protokoll kann als allgemeiner Leitfaden für die netzgekoppelte Kryo-Lamellenpräparation für die Kryo-Elektronenmikroskopie (KryoEM) und Kryo-Elektronentomographie (KryoET) befolgt werden. Elektronenmikroskopische Gitter, die die Zellen stützen, werden mit einem manuellen oder automatischen Gefrierschrank in flüssiges, stickstoffgekühltes flüssiges Ethan eingefroren und dann auf einem Lichtmikroskop mit Kryotisch gescreent. Gefrorene Gitter werden in ein Kryo-Rasterelektronenmikroskop überführt, das mit einem fokussierten Ionenstrahl (cryoFIB-REM) ausgestattet ist. Die Gitter werden vor dem Fräsen routinemäßig gesputtert, was die Verteilung des Ladungsaufbaus während des Fräsens unterstützt. Alternativ kann mit einem E-Beam-Rotationsbeschichter eine Schicht aus Kohlenstoff-Platin auf die Gitter aufgetragen werden, deren exakte Dicke genauer gesteuert werden kann. Im Inneren des CryoFIB-REM wird eine zusätzliche Beschichtung einer Organoplatinverbindung über ein Gasinjektionssystem (GIS) auf die Oberfläche des Gitters aufgebracht. Diese Schicht schützt die Vorderkante der Lamelle beim Fräsen, deren Unversehrtheit entscheidend für gleichmäßig dünne Lamellen ist. Die interessierenden Bereiche werden mittels REM identifiziert und das Fräsen erfolgt schrittweise, wobei der Strom des Ionenstrahls reduziert wird, wenn die Lamelle Elektronentransparenz erreicht, um eine übermäßige Wärmeentwicklung zu vermeiden. Ein Gitter mit mehreren Lamellen wird dann unter kryogenen Bedingungen in ein Transmissionselektronenmikroskop (TEM) überführt, um eine Tilt-Serienaufnahme zu ermöglichen. Ein robuster und kontaminationsfreier Arbeitsablauf für die Lamellenpräparation ist ein wesentlicher Schritt für nachgelagerte Techniken, einschließlich zellulärer KryoEM, KryoET und Subtomogramm-Mittelung. Die Entwicklung dieser Techniken, insbesondere für das Herausheben und Mahlen von unter hohem Druck gefrorenen Proben, hat in diesem Bereich hohe Priorität.

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Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Fokussiertes Ionenstrahlfräsen zur Herstellung von glasartigen On-Grid-Lamellen aus tiefgefrorenen biologischen Proben für die Kryo-Elektronentomographie.

Präparation von Lamellen aus glasartigen biologischen Proben mit einem Zweistrahl-Rasterelektronenmikroskop für die Kryo-Elektronentomographie

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Dieses Protokoll beschreibt die Präparation von Glaskörperlamellen von Plasmodium-falciparum-infizierten roten Blutkörperchen für die Kryo-Elektronentomographie. Dies ermöglicht die direkte Beobachtung detaillierter struktureller Informationen darüber, wie der Parasit Malaria verursacht. Die Kryo-Elektronentomographie zeichnet hochauflösende Informationen über das Innere von Zellen auf.Es ist leistungsfähig genug, um einzelne Proteinkomplexe in situ zu beobachten, die computergestützt extrahiert und gemittelt werden können, um dreidimensionale Strukturinformationen über Proteine zu erhalten. Dieses Protokoll kann leicht an verschiedene Zelltypen angepasst werden und kann ein Ausgangspunkt für jemanden sein, der neu in der Herstellung von Glaskörperlamellen für die Kryo-Elektronentomographie ist. Das ist Alejandra Carbajal, die heute das Protokoll ausführen wird.Untersuchen Sie zunächst die gefrorenen Kupfergitter mit einem CryoStage für ein Lichtmikroskop unter besonderer Berücksichtigung des Eisgradienten über das Gitter. Überprüfen Sie die einzelnen Gitterquadrate auf die Zellbedeckung in den dünneren Eisbereichen. Verwenden Sie einen schwarzen, unauslöschlichen Marker, um die Vorderseite und die gegenüberliegende Seite der Cryo-FIB-SEM-spezifischen Autogrid-Felgen zu markieren.Laden Sie das geclippte Gitter mit der Carbonseite nach oben in das Cryo-FIB-REM-Shuttle und tragen Sie eine vier Nanometer dicke Carbon- oder Platin-E-Beam-Rotationsschicht auf die Oberfläche der Zellen auf. Laden Sie das Shuttle in das Cryo-FIB-REM und beurteilen Sie die Zellverteilung auf jedem Gitter per REM bei fünf Kilovolt. Verschaffen Sie sich einen Überblick bei niedriger Vergrößerung bei einer Leistung von 100, um Eisgradienten im gesamten Gitter zu betrachten.Nehmen Sie dann Bilder mit höherer Vergrößerung und einer Leistung von 5.000 auf, um einzelne Gitterquadrate zu betrachten. Tragen Sie eine zwei Mikrometer große Organoplatinschicht auf die Oberfläche jedes Gitters auf, indem Sie die Nadel des Gasinjektionssystems in die Kammer über dem Gitter einführen und die Organoplatinquelle für eine bestimmte Zeit auf eine eingestellte Temperatur erwärmen, um einen Dampfstrom zu erzeugen. Um die Probe zu beobachten, neigen Sie die Probe so, dass die Ebene des Gitters etwa 10 Grad vom Einfallswinkel des Ionenstrahls entfernt ist, und verschieben Sie die Mitte eines geeigneten Gitterquadrats, das sowohl auf den REM- als auch auf den FIB-Bildern zu sehen ist.Untersuchen Sie das Gitter mit hoher Vergrößerung, um die Zellen in der Mitte eines Gitterquadrats zu visualisieren. Markieren Sie zwei rechteckige Muster zum Fräsen, eines über und eines unter einem drei Mikrometer dicken geschützten Bereich. Wählen Sie dann die Strahleinstellungen und korrigieren Sie die Hornhautverkrümmung, indem Sie Helligkeit und Kontrast anpassen.Nachdem die Einrichtung abgeschlossen ist, beginnen Sie mit dem Fräsen bei einem Strom von 300 Pikoampere, während Sie den Live-Fortschritt in der Ionenstrahlansicht und intermittierend per REM überwachen. Die Probe wird in der REM-Ansicht und nach dem ersten Fräsen überprüft. Wenn der Ionenstrahl die Probe oberhalb und unterhalb des geschützten Bereichs nicht durchbrochen hat, entfernen Sie mehr Material, indem Sie die Höhe der rechteckigen Muster erhöhen. Beenden Sie das Fräsen, wenn die Oberfläche ober- und unterhalb der Lamelle in der Ionenstrahlansicht vollständig glatt ist.Wiederholen Sie den Fräsvorgang schrittweise und reduzieren Sie dabei jedes Mal den Ionenstrahlstrom, bis eine Dicke von 300 Nanometern erreicht ist. Notieren Sie die X-Y-Z-Position jeder Lamelle. Um die Lamellen am Ende des Experiments zu polieren, verwenden Sie eine REM-Übersicht mit geringer Vergrößerung, um eine Gruppe von Lamellen auszuwählen, die poliert werden sollen, und markieren Sie die Polierwurzel.Sobald die Polierwurzel markiert ist, reduzieren Sie den Abstand zwischen den beiden rechteckigen Mustern auf 100 bis 200 Nanometer und beginnen Sie mit dem Polieren bei einem Ionenstrahlstrom von 30 Pikoampere. Überwachen Sie den Fortschritt per REM bei zwei bis drei Kilovolt. Beenden Sie das Polieren, wenn der Kontrast in der Lamelle durch REM verloren geht oder wenn die Organoplatinbeschichtung oder die Lamelle selbst an Integrität verliert.Erfassen und speichern Sie REM-Bilder mit geringer Vergrößerung von jeder Lamelle. Nehmen Sie nach Abschluss des Experiments das Shuttle aus dem Mikroskop. Entfernen Sie die Gitter mit Lamellen und lagern Sie sie unter flüssigem Stickstoff.Gehen Sie vorsichtig mit den Gittern um. Um die Morphologie zu untersuchen, wurden die Schizonten in verschiedenen Stadien des Ausstiegs mit Verbindung zwei in E-64-Inhibitoren blockiert. In Gegenwart von Verbindung zwei war die Grenze zwischen den parasitophoren Membranen und dem umgebenden Hämoglobin in den roten Blutkörperchen des Wirts gut definiert.Die intakten parasitophoren Vakuolen (PVs) waren mit Merozoiten in einem einzigen Cluster von Hämozoinkristallen verpackt. Als zwei synchronisierte Schizonten in E-64 gespült wurden, riss die PV-Membran und die Merozoiten breiteten sich innerhalb des Erythrozyts aus. Ein typisches Beispiel für eine gute Zellverteilung auf einem Kupfergitter zeigt große rote Blutkörperchen mit einer gut definierten Peripherie und einer intakten Vakuolenmembran.Innerhalb eines teilweise kollabierten roten Blutkörperchens des Wirts wurden die einzelnen Merozoiten als kleine Zellhaufen visualisiert. Jeder Schizont hatte einen schwarzen Fleck in seiner Mitte, der die Position der Hämozoinkristalle anzeigte. Nach dem Fräsen wurden die Gitter in das TEM geladen, um die Positionen der Lamellen zu identifizieren und geeignete Bereiche für die Tomographie zu finden.Auf dem Probenmikroskop ist eine Erythrozyte zu sehen, die kurz zuvor von einem Merozoiten befallen worden war. Der Merozoite, der von der Membran der Wirtszelle umgeben ist, konnte innerhalb der Grenzen des Erythrozyts gesehen werden. Am apikalen Ende des Merozoiten waren die beiden Membranen, die die Zelle umgeben, und die vier Membranen, die in der Spitze des Merozoiten gestapelt sind, deutlich sichtbar, die mit einem elektronendichten pilzförmigen Merkmal verbunden sind.Im Zytoplasma des Merozoiten wurde ein Fusionsereignis zwischen der Merozoiten-Plasmamembran und einem mehrschichtigen Vesikel identifiziert. In einer zusätzlichen TEM-Analyse einer 230 Nanometer dicken Lamelle wurde die typische Morphologie eines mit E-64 behandelten reifen Merozoiten beobachtet. Innerhalb der Membran der roten Blutkörperchen ist die Merozoiten-Plasmamembran mit Organellen wie dem inneren Membrankomplex, polaren Ringen, Mikronemen, Rhoptrien und der Kernhülle zu sehen.Der wichtigste Teil dieser Technik ist die Optimierung der Gitter, um eine reproduzierbare und effiziente Herstellung von dünnen Lamellen zu ermöglichen. Die Weiterentwicklung dieser Technik wird es den Forschern ermöglichen, einzelne Proteinmoleküle in Malariaparasiten sichtbar zu machen und ihre Rolle beim Austritt von Malaria zu bestimmen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Verwendung der Elektron-paramagnetische Resonanz in biologischen Proben bei Umgebungstemperatur und 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Forschung

Biochemie

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Schnelle Gittervorbereitung für zeitaufgelöste Kryo-Elektronenmikroskopie

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Herstellung und Kryo-FIB-Mikrobearbeitung von Saccharomyces cerevisiae für die Kryo-Elektronentomographie

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie: Von der Probe zur Struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Mikrostrukturierung von Transmissionselektronenmikroskopie-Gittern zur direkten Zellpositionierung innerhalb von Ganzzell-Kryo-Elektronentomographie-Workflows

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Ein robuster Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie-Verarbeitungs-Workflow (Kryo-EM) mit cryoSPARC, RELION und Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Herstellung von Nukleosomenkernpartikeln, die mit DNA-Reparaturfaktoren für die Strukturbestimmung der Kryo-Elektronenmikroskopie komplexiert sind

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Extraktion modifizierter Mikrotubuli aus Säugetierzellen zur Untersuchung von Mikrotubuli-Protein-Komplexen mittels Kryo-Elektronenmikroskopie

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Anwendung von Monolayer-Graphen auf Kryo-Elektronenmikroskopie-Gitter zur hochauflösenden Strukturbestimmung

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...