Name: preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography
Uploaded: 2021-08-05T13:30:00
Duration: 7 min
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この研究は、全体的または部分的にWellcome Trust(212916/Z/18/Z)から資金提供を受けました。オープンアクセスの目的で、著者は、この投稿から生じる著者が受け入れた原稿バージョンにCC BYパブリック著作権ライセンスを適用しました。
この方法が開発されたこのプロジェクトは、ヘレンR.サイビル、ローランドA.フレック、マイケルJ.ブラックマンに授与された医学研究評議会の助成金MR / P010288 / 1によって資金提供されました。 熱帯熱マラリア原虫 の培養は、マイケルJ.ブラックマンのグループのメンバーの支援を受けて、フランシスクリック研究所で栽培されました。著者らは、薄い血液塗抹標本中の化合物2およびE64処理シゾントの画像を提供してくれたSer Ying(Michele)Tan博士に感謝の意を表したい。ほとんどのラメラはeBICのスタッフのサポートを受けて製造されており、研究提案NT21004に関するSciosデュアルビームクライオFIB-SEMにアクセスできることに感謝しています。著者らはまた、CUI内でのFIBフライス盤技術の開発を継続する上での王立協会産業フェローシップスキーム(INF\R2\202061)の支援を認めています。著者らはまた、この方法の論文とプロジェクトの監督に関して有益な議論をしてくれたHelen R. Saibilに感謝したい。

ヒトの血液は、英国国立血液移植サービスを通じて匿名化されたドナーから入手され、受領後2週間以内に使用されます。その使用に倫理的な承認は必要ありません。
1. 熱帯熱マラリア原虫感染赤血球の準備と急落凍結
<ol><li>70%(v / v)等張密度勾配培地上で遠心分離(1,580 x g)によって成熟シゾントを単離します(ヒト赤血球で熱帯 熱マラリア原虫 の無性血液ステージを培養する方法の標準的な手順については、Blackman M.J.、1995、37を参照してください)。</li>
	<li>風乾した薄い血液フィルムを100%メタノールでスライドガラスに固定し、シゾントの形態学的均一性を確認してから、6.7 mMリン酸緩衝液、pH 7.1中の10%ギムザ染色で染色します。 注:特定の出口で失速したシゾントの調製を強化するために、シゾントを化合物2およびE64阻害剤とさらに同期させることができます(これらの阻害剤の効果の説明については、 代表的な結果 と 図1 を参照してください)。 注意: 熱帯熱マラリア原虫 はヒト病原体であり、地域の健康と安全のガイドラインに従って、適切な封じ込め施設でのみ取り扱う必要があります。</li>
	<li>シゾント(240 x g)を穏やかに遠心分離してペレット化し、RPMI培地の細胞ペレットの2倍の容量に再懸濁し、50%ヘマトクリット懸濁液を生成します。</li>
	<li>手動プランジ凍結リグで、グロー放電(グロー放電ユニット設定を使用、空気中30 mA、グリッドのカーボン側のみを処理する)2/4穴カーボンフィルムを備えた200メッシュ銅グリッドのカーボン側に2.5 μLのシゾントを塗布し、エッジが破れたグレード1のろ紙を使用してグリッドの背面から~20秒間吸い取ります。液体窒素冷却液体エタンに突入し、グリッドをストレージに移します(この研究で使用した機器の材料表を参照)。 注:実験はここで一時停止することができ、グリッドは液体窒素の下に無期限に保管することができます。 注意: 液体窒素は窒息剤であり、凍傷を引き起こします。酸素モニタリングを備えた適切な環境での取り扱いには注意してください。 注意: 液体エタンは重度の火傷を負い、可燃性です。発火源から離れたドラフトで使用します。 注:急落冷凍シゾントはもはや実行可能ではありません。これは、凍結されていない対照と比較して、空気解凍された急降下凍結シゾントのいくつかの金のグリッドでヒトの血液をインキュベートし、数日後に寄生虫の成長を観察しないことによって決定されました。したがって、シゾントの凍結グリッドは、通常の安全および除染手順(手袋、>70%エタノールによる表面/ツールの滅菌、および>70%エタノール中のグリッドの廃棄)を使用して、封じ込め施設の外で安全に取り扱うことができます。</li>
	<li>光学顕微鏡用のクライオステージを使用してグリッドをスクリーニングし、グリッド全体の氷の勾配に特に注意を払います。氷の薄い領域で、個々のグリッドの正方形のセルカバレッジを確認します。 注:最適な正方形は、グリッド正方形の中央にある1セルの厚さである必要があります(図2)。これにより、グリッドバーに対してエッジの厚い氷に当たることなく、正方形の中心を横切ってラメラを粉砕できます。実験はここで一時停止することができ、グリッドは液体窒素の下に無期限に保存することができます。細胞が蛍光マーカーを保有している場合、グリッドをクライオクレムでスクリーニングして、目的のX/Y位置を特定することもでき、クライオFIB-SEMのグリッド位置と相関させてダイレクトミリングすることができます。</li>
</ol>2.プランジ凍結細胞のオングリッドFIBミリング
<ol><li>クライオFIB固有のオートグリッドリムの前面に黒い消えないマーカーペンでマークを付けて、カットアウェイセクションの中心とリムの反対側を示します(図3)。クリッピングステーションをセットアップし、グリッドをマークされたリングのカーボン側を下にしてクリップします。</li>
	<li>クライオFIB-SEMシャトル(シャトルに応じて通常2グリッド)のカーボン側を上にしてグリッドをロードし、アルゴン雰囲気(5 x 10-2 mbar)(60秒間5 mA- 厚さは可変)またはカーボン/プラチナ電子ビーム回転コート(~4 nmの厚さ)でプラチナスパッタコートをセルの表面に塗布します。 注:どちらのタイプのコーティングも、SEMイメージング中の電荷分散を助けます。電子ビームロータリーコーターの利点は、コーティングの正確な厚さを指定できることです。</li>
	<li>シャトルをクライオFIB-SEMにロードし、5 kV(13 pAまたは25 pA)のSEMによって各グリッド上の細胞分布を評価します。低倍率の概要(~100倍)を取得して、グリッド全体の氷の勾配を確認します。次に、高倍率(~5,000倍)の画像を撮影して個々のグリッドの正方形を調べ、目に見える細胞の特徴とミルへの表面汚染が少ないグリッドの領域を特定します。</li>
	<li>ガスインジェクションシステム(GIS)を使用して、各グリッドの表面に>2 μmの有機白金コートを塗布します。これを行うには、GIS針をグリッドの上のチャンバーに挿入し、有機白金源を設定温度に設定時間(たとえば、~27°Cで3〜10秒)加熱して蒸気の流れを生成します。 注:GIS針を介した有機白金コートの塗布角度、温度、およびタイミングは、均一なコーティングを最大化するように最適化する必要があります。これは、使用する特定のクライオFIB-SEMによって異なります(詳細については、 代表的な結果 を参照してください)。</li>
	<li>グリッドの平面がイオンビームの入射角から~10°になるようにサンプルを傾け、SEM画像とFIB画像の両方で見られるように適切なグリッド正方形の中心を移動します。</li>
	<li>低電流(公称1.5 pA、30 kV)でイオンビームを使用してグリッドを調査し、グリッド正方形の中心にあるセルを視覚化するのに十分な高倍率(~7,000倍)に移動します。最初のフライス加工電流(300 pA)でサンプルに焦点を合わせ、非点収差を補正します。明るさとコントラストを調整し、厚さ3 μmの保護領域の上部と下部の2つの長方形パターンをフライス加工し、その中心が最終的なラメラの目的の位置になります。 注:パターンの選択した幅は、周囲のセル層のトポグラフィーとセルサイズによって異なります。7〜20μmはシゾントに適した幅ですが、ラメラが広いほどフライス加工に時間がかかります。最初のフライス加工ステップで選択したパターンの高さは、約6μmから始まるサンプルの厚さによって異なります。これはフライス加工中に調整する必要がある場合があります。フライス加工は、パターンの外側の上端と下端からラメラの面に向かって方向に行われます。これは並行して行うことができ、両方のパターンを同時にまたは順番にフライス加工し、最初にラメラの上から材料を除去し、次に下から材料を除去します。</li>
	<li>最初の電流でフライス加工を開始します。イオンビームビューでライブの進行状況を監視し、SEM(5 kV、13または25 pA)で断続的に監視します。イオンビームが保護領域の上下のサンプルを突き破ったことを確認します。そうでない場合は、長方形のパターンの高さを増やして、より多くの材料を削除します。ラメラの上下の表面がイオンビームビューで完全に滑らかになったら停止します。 注:長方形のパターンの内側に焦点面に特徴が含まれていない場合、イオンビームは保護領域の上下のサンプルを突き破っています。グリッド バーなどの一部のフィーチャは、背景で焦点が合っていない状態で表示される場合があります。</li>
	<li>次のフライス電流(100 pA)に変更します。明るさ/コントラストに焦点を合わせて調整します。2つの長方形パターン間のスペースを1.5 μmに減らし、パターンの高さを小さくして、フライス加工されていない材料のみをカバーします。ラメラの上下の表面が完全に滑らかになるまで、新しい電流でフライス加工を開始します。</li>
	<li>厚さ0.3μmに達するまでこのプロセスを段階的に繰り返し、 表1のミリングスキームに従って毎回イオンビーム電流を減らします。</li>
	<li>片方または両方のグリッド上で複数のラメラ(量はサンプルの厚さと利用可能な時間に依存します)を0.3 μmの厚さに粉砕し、各ラメラのX/Y/Z位置を記録し、セッションの最後に~1-2時間予約して、ラメラを最終的な厚さ(60-200 nm)に研磨します。</li>
	<li>グリッド全体の低倍率SEMの概要を取得し、グリッドの前面(イオンビーム源に近い)のラメラからグリッドの背面(イオンビーム源から最も遠い)のラメラまでの研磨ルートを計画します(図5)。 注:これにより、研磨されたラメラの表面へのアブレーションされた材料の再堆積が減少します。</li>
	<li>2つの長方形パターン間のスペースを100〜200nmに減らし、30pAのイオンビーム電流で最終研磨ステップを開始します。2-3 kV(13 pA、ドウェル= 300 n、3072 x 2048、フルフレームの場合は~2秒)でSEMで進行状況を監視し、SEMによってラメラのコントラストが失われたとき、またはラメラ自体の有機白金コートが完全性を失い始めたときに研磨を停止します。</li>
	<li>グリッドを削除する前に、グリッド全体の低倍率SEM画像を取得し、各ラメラの画像を保存します。それらを使用して、後でTEMでグリッドをクロスチェックします。ここで実験を一時停止し、液体窒素の下にラメラ付きのグリッドを保管します-取り扱いには注意してください。 注:グリッドは、クライオFIB-SEMから取り外すときに軽くスパッタコーティングすることができ、高倍率でのTEMでのドリフトと帯電を制限するのに役立ちますが、スパッタコーティングが多すぎるとラメラ内の生物学的内容物が不明瞭になる可能性があるため、これは慎重に行う必要があります。この段階でラメラの蛍光をスクリーニングすることが可能です。しかしながら、十分なシグナルを得ることは、ラメラの厚さ内の標識タンパク質の存在量に依存するであろう。ラメラへの損傷を制限し、表面の汚染を防ぐために、グリッドの取り扱いには細心の注意を払う必要があります。</li>
</ol>3. チルト級数集録とデータ処理の概要
<ol><li>グリッドをTEMにロードし、フライス加工方向をステージの傾斜軸に垂直に合わせます。 注: グリッドの位置合わせは、オートグリッド リムのマークを使用して目視で行われます。~10°の誤差は許容範囲であり、そうしないと、グリッドが傾くと、ラメラの両側のトレンチの壁がラメラを覆い隠す可能性があります。</li>
	<li>グリッド全体の低倍率マップ(~150倍)を取得し、ラメラを見つけます。次に、各ラメラの中倍率マップ(ラメラのサイズに応じて~1,500倍)を取得し、関心のある領域を特定します。</li>
	<li>グリッドを±10°傾けて、ラメラの平面(グリッドではない)を光軸に垂直にします 注:プレチルトの方向は、低倍率および中倍率マップでのラメラの前端の位置(残りの有機白金コートを探す)によって決定できます。ここで使用するTEMの場合、ラメラの前端がマップ内で上を向いている場合はグリッドに+10°のプレチルトが必要であり、下を向いている場合は-10°のプレチルトが必要です。各グリッドは、どのようにピックアップされてオートローダに挿入されたかによって異なる場合があります。</li>
	<li>線量対称チルトシリーズ38 (たとえば、-54°から+54°、3-5°刻み)を、関心領域に必要な視野と解像度の両方を可能にするピクセルサイズで取得します。-2〜-5μmの範囲の焦点ぼけ値を使用します。各増分で3〜10フレームのムービーを収集し、このために、ピクセルサイズに応じてこれらのパラメータを調整して、~150 e-/Å2 (300 kV TEMの場合)の総線量を蓄積します。 注意: ラメラの亀裂は、これらの領域がドリフトする可能性があるため、避ける必要があります。表面の汚染は、高傾斜で関心領域または焦点領域を覆い隠す可能性があるため、避ける必要があります。</li>
	<li>モーションは、MotionCor239などのプログラムを使用してムービーを修正します。補正された画像(累積e-/画像)40 に線量重み付けフィルタを適用し、CTFFIND441などのプログラムを用いて各画像の焦点ずれを推定する。</li>
	<li>at etomo(IMOD)42 などのプログラムでフィデューシャルレスアライメント(パッチトラッキング)を使用して、傾斜系列の画像のアライメントと角度関係を計算します。</li>
	<li>アライメントと回転情報を、デフォーカス値とともに、3次元CTF補正を適用できるプログラム、たとえばNovaCTF43に入力します。補正された断層写真を計算して、下流の分析に関連するビニング係数を含む出力断層図を取得します。</li>
	<li>再構成を分析し、フィルタリング、セグメンテーション、サブトモグラム平均化などのダウンストリーム処理に備えます。</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

クライオFIBミリングはより日常的になりつつありますが、ミリングに最適なサンプルの準備はそうではありません。したがって、このプロトコルの重要なステップのほとんどは、サンプルがクライオFIB-SEMに到達する前に発生します。粉砕を試みる前に、可能な限り最良のサンプルを生成するには、複数回の細胞調製、プランジ凍結、および光学顕微鏡および電子顕微鏡によるスクリーニングによるサンプルの最適化が必要です。可能な限り最高のサンプルを持つことは、成功の可能性を高めるだけでなく、機器の使用を最適化します。このため、ほとんどの国の施設では、マシンに時間を与える前に、十分な最適化が実行されたという証拠が必要です。クライオFIB-SEM内に入ると、有機白金コートの効果を最大化することが、均一に薄いラメラを生成するために重要です。最後に、忍耐と適切なサンプル処理は、繊細なラメラを含むグリッドを数日間作成して転送する必要があるユーザーからの前提条件スキルです。これは、自動フライス加工戦略47,48の導入によって変わる可能性がありますが、まだ、ほとんどの施設でフライス加工プロセス全体が依然として大部分が手動です。
この研究は 熱帯熱マラリア原虫 にのみ焦点を当てていますが、ここで紹介する方法は、他の細胞タイプのグリッド調製とミリングを最適化するために簡単に変更できます。考慮すべき重要な要素は、グリッドに適用されるセルの密度、グリッドタイプ(銅は一部のセルに有毒です)、炭素膜の穴のサイズと間隔、ブロッティング時間、およびブロッティングの方法(片面/両面、手動、または自動)。さらに、細胞がグリッド(通常は穴のある炭素膜を有する金のグリッド)上で増殖している場合、ブロッティングおよび凍結の前に光学顕微鏡によってコンフルエンシーをチェックすることができる。ミリング戦略は、セルがグリッド上にどのように堆積されるかによって異なります。マラリアに感染した赤血球の場合、グリッドは本質的に壊れていない細胞の層によってコーティングされており、一部の領域では厚く、他の領域では薄くなっています。粉砕は、氷の厚さが断層撮影に適したサイズのラメラを生成するこの勾配に沿った1つの領域の複数の点で実行されます。このアプローチは、複数のセルを通るスライスを含むラメラを生成できるため、より小さなセルに適しています。より大きな細胞または細胞の塊の場合、1つの細胞または細胞塊が1つのラメラを生成する場合があります。
グリッドハンドリングとサンプル転送は、このワークフローの主な課題の1つです。ラメラは、破損や亀裂、生物学を覆い隠すカーテンアーティファクト、過度の表面汚染、およびTEM内のグリッド配向の問題により失われる可能性があり、グリッドを再配置するための追加の処理手順が必要になります。損失の程度は日常的およびグリッドごとに異なりますが、時間の経過とともに練習と取り扱いの経験を通じて改善されます。この研究では、ラメラを破壊することなく、オートローダー内でグリッドの向きを何度も注意深く変更でき、表面の氷を洗い流すという利点があることがわかりました。このワークフローのもう一つの主な制限は、ラメラの製造にかかる時間です。生産が遅いため、適切に最適化されたサンプルを用意して、フライス加工を可能な限り効率的にすることが重要です。
ガラス体生物学的サンプルのFIB粉砕への多くの適応が最近導入されている。ゲームチェンジャーは、クライオFIB-SEMチャンバー内に極低温冷却リフトアウトツールを実装し、高圧凍結サンプルからより大きな材料ブロックを粉砕できるようにすることです。ブロックは、金属棒に取り付けるか、グリッパーでピックアップして、特別に変更されたEMグリッドを含む2番目のサンプル位置に移動することができます。次に、ブロックを有機白金でコーティングし、粉砕してラメラを生成することができます。高圧凍結材料からラメラを粉砕する能力は、相関蛍光顕微鏡によって領域を特異的に標的とする、はるかに大きな細胞および組織を処理できることを意味する12。FIBミリング法への他の最近の適応には、サンプル16のウェッジプレミリングによるカーテンアーチファクトの低減、マイクロ流体クライオ固定49 、および細胞分布を改善するための電子顕微鏡グリッドのフォトマイクロパターニング50が含まれる。また、ラメラの両側の微小膨張ギャップを粉砕することで、周囲のサンプルが最終的な薄さ51に達するにつれて、周囲のサンプルによる圧縮を緩和できることが実証されています。これは、この研究のサンプルなど、最終研磨ステップ中にラメラの曲がりが見られることがある連続セル層を粉砕する場合に特に役立ちます。
電子顕微鏡法の未来は、サブトモグラム平均化による in situ 分子構造の決定である可能性が高く、FIBミリングは、これらのタイプのワークフローのための硝子体生物学的サンプルの製造を容易にする重要なツールです。FIBミリングは生物学的応用にはまだ揺籃期にありますが、学術施設と国立施設の両方の研究者の努力と、研究をサポートするためのクライオFIB-SEM技術の開発への商業投資のおかげで、メソッド開発は急速に進んでいます。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated from:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University
to:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
M. Alejandra Carbajal1 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

極低温での透過型電子顕微鏡(TEM)によって効果的にイメージングできるのは、厚さ<500 nmの生物学的サンプルの細胞内容物のみであり、標本の範囲をウイルス、原核生物、単純な単細胞生物、およびより大きな真核細胞のより薄い領域に限定します1。オングリッド集束イオンビーム(FIB)ミリングにより、極低温(<-150°C)で、より厚いプランジ凍結生物学的サンプルを電子透過性のラメラに薄くすることができます。得られたラメラは、可視化および断層撮影データ収集のためにTEMに移され、細胞内の細胞および分子的特徴の高解像度3D再構成を可能にする(レビューについては、Rigort et al., 20122、Oikonomou et al., 20163、およびWagnerら, 20204を参照)。
FIBミリングは、サンプルが定期的に薄くなり、下流の分析に備える材料科学の分野から生まれました5。これは、従来の走査型電子顕微鏡光学系と、FIB-SEMと呼ばれる集束イオンビーム(FIB)を生成して細かく制御できる光学系を含む2番目のカラムの2つの光学カラムを備えた走査型電子顕微鏡(SEM)で行われます。これにより、試料の特定の領域をガリウム源によって生成されたイオンによってアブレーションし、余分な物質を除去し、ラメラ6を残すことができる。フライス加工プロセスは、サンプルのトポグラフィーのSEMイメージングによってガイドされ、関心のある領域を特定し、フライス加工の進行状況を監視するために使用されます。生物学的用途の場合、基本的なセットアップはほぼ同じですが、粉砕は極低温で行われます。これには、標準的なFIB-SEMを、一定の温度と低い表面汚染率を維持する低温冷却ステージと、失透や汚染なしにサンプルの移動を容易にするエアロックを備えているように適合させる必要がありました。サンプルシャトルも変更され、TEMグリッド、プランシェット、キャピラリーなど、クライオFIB-SEM内にさまざまなキャリアを取り付けることができます。いくつかの主要な研究者グループは、これらの方法の開発とこの分野における継続的な技術的進歩の中心となっています7,8,9,10,11,12。市販のソリューションは、極低温での生物学的FIBミリングのためにより広く利用可能であり、最適化されたサンプルを考えると、ラメラのオングリッドミリングはより日常的になりつつあります。
さまざまな室温およびクライオ電子顕微鏡技術を使用して、多細胞生物全体から、適度な解像度での複雑なプロセスのコンテキストの理解、さらに詳細な決定まで、生命のあらゆるスケールにわたる細胞情報を視覚化できます。 in situ 分子構造13,14,15,16,17,18,19.古典的な室温技術には、TEMによる細胞形態の分析のための超ミクロトミーによる固定および染色された樹脂埋め込み細胞および組織の切片化が含まれる(レビューについては、Studer et al., 2008を参照のこと20).ナイフ(シリアルブロックフェースイメージング)または集束イオンビームのいずれかで材料を徐々に除去する前に、保存された細胞のブロックの表面を画像化するためにSEMによる二次電子散乱を利用する代替技術が開発されている21,22,23.この技術は、細胞または組織の硝子体の染色されていないブロック上のクライオFIB-SEMを用いて、極低温(クライオボリュームイメージングと呼ばれる)でも首尾よく実装されています24.あるいは、より厚いラメラ(~15 μmの厚さ)を粉砕し、STEMイメージングによって研究することもできます25.これらの技術を使用すると、多くの細胞を含むブロック全体を画像化して集団情報を収集したり、臓器/生物全体を画像化して3Dで再構築したりできます。ただし、細胞から高分解能の分子情報にアクセスするには、サンプルを天然に近い凍結水和状態で保存する必要があるため、極低温条件下で調製する必要があります。ガラス体切片のクライオ電子顕微鏡(CEMOVIS)は、生体材料の高圧凍結ブロックを極低温条件下でウルトラミクロトームで切片化する技術です。これにより、クライオセクション(厚さ40〜100 nm)のリボンが生成されます26これはEMグリッドに取り付けられ、TEMで画像化されます。ただし、ナイフと硝子体サンプルとの物理的相互作用により、クレバスおよび圧縮アーティファクトが発生し、細胞構造が大幅に歪む可能性があります27,28,29,30.厚い切片はこれらのアーチファクトの影響を受けやすく、~70 nmより厚い切片を使用することは実用的ではありません26.この制限は、断層撮影における生物学的構造の3Dビューを大きく制限する。極低温でのFIBフライス加工ではこれらの問題は発生しませんが、試験片の部品間で異なるフライス加工速度によって引き起こされる独自のアーティファクトがあり、カーテンと呼ばれるラメラ内の厚さが変動します。この問題は、フライス加工中にラメラの前端を保護するガス注入システム(GIS)を介して塗布された有機白金コートを適用することによって軽減されます31.オングリッドFIBフライス加工のサンプル厚さの上限は、ガラス質を維持しながら試料を急落凍結する能力によって定義されます32ただし、クライオリフトアウト技術と生物学的試料に適合したサンプルキャリアの導入により、FIBミリングを使用して高圧凍結サンプルを処理することもできます31,33,34,35.さらに、プランジ凍結サンプルは、必要な倍率で傾斜系列を収集するのに十分な表面積を提供する妥当なサイズのラメラを生成するのに十分な生物学的材料が必要であるため、薄すぎることはできません。この問題は、細菌や酵母などの小さな細胞の塊を粉砕することで軽減できます。最終的なラメラの厚さ(~100-300 nm)は、通常、サンプルの完全性と粉砕戦略によって決まります。薄いラメラは、サブトモグラム平均法などの高解像度の構造作業に適していますが、厚いラメラはCEMOVISで達成できるよりもはるかに大きな細胞量を含み、ネイティブに保存されたサンプルに近い細胞コンテキストを提供します。FIBミリングは、電子回折研究のためにプランジ凍結タンパク質結晶を薄くするためにも使用できます36.
硝子体細胞のFIB粉砕は、科学的な問題が その場で天然に近い標本の高解像度の分子詳細を必要とする場合、実行する時間と労力の価値があります。ラメラのルーチン生産のためのより多くの施設へのアクセスにより、律速ステップは多くの場合、粉砕前のサンプルの最適化であり、サンプルがガラス質であり、堅牢で均一に薄いラメラを生成するために適切な厚さを確保するために時間をかける必要があります。ここでは、マラリアの原因物質である 熱帯熱マラリア原虫 に感染したFIB粉砕プランジ凍結ヒト赤血球のサンプル最適化について説明しますが、このアプローチは任意のサンプルに適用できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>c-clips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Direct quote from Thermo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>Sub-angstrom</td>
			<td>CSA-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound 2</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-FIB specific autogrid rims</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1205101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E64</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emitech K100X glow discharge unit</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12633012</td>
			<td>Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>350864X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11562203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Sub-angstrom</td>
			<td>PB</td>
			<td>For clipped grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>For clipped grids - direct quote from Thermo Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Home-made manual plunge freezing rig</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human blood</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>UK National Blood and Transplant service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>n/a</td>
			<td>FIB-SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td>sputter coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE900</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td>e-beam rotary coater. In a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linkam cryo-stage for light microscope</td>
			<td>Linkam</td>
			<td>Model No. CMS196</td>
			<td>Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse E200 light microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C17nCuH2-01</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C17nCu20-01</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum PP3010 prep-chamber</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>n/a</td>
			<td>sputter coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage.</td>
			<td>FEI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>FIB-SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen</td>
			<td>Viking Direct</td>
			<td>ND538522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFS Titan Krios 300 kV TEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>TEM equipped with a K2 or K3 camera.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatmann grade 1 filter paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA1001150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Scope A1 light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td>with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography

ここでは、 熱帯熱マラリア原虫に感染したヒト赤血球の急落凍結グリッドから凍結ラメラを調製するためのプロトコルを示しており、他の生物学的サンプルに容易に適合させることができます。サンプルの調製、粉砕、およびラメラの表示に関する基本原則はすべての機器に共通であり、クライオ電子顕微鏡(クライオEM)およびクライオ電子線トモグラフィー(クライオET)用のオングリッドクライオラメラ調製の一般的なガイドとしてプロトコルに従うことができます。細胞を支持する電子顕微鏡グリッドは、手動または自動プランジフリーザーを使用して液体窒素冷却液体エタンにプランジ凍結され、クライオステージを備えた光学顕微鏡でスクリーニングされます。凍結したグリッドは、集束イオンビームを備えたクライオ走査型電子顕微鏡(クライオFIB-SEM)に移されます。グリッドはフライス加工前に定期的にスパッタコーティングされ、フライス加工中の電荷蓄積の分散に役立ちます。あるいは、電子ビームロータリーコーターを使用して、カーボン - 白金の層をグリッドに適用することができ、その正確な厚さをより正確に制御することができる。クライオFIB-SEM内に入ると、有機白金化合物の追加コーティングがガス注入システム(GIS)を介してグリッドの表面に適用されます。この層は、粉砕時にラメラの前縁を保護し、その完全性は均一に薄いラメラを達成するために重要です。関心のある領域はSEMを介して識別され、ミリングは段階的に実行され、ラメラが電子透過性に達するとイオンビームの電流を減らして、過度の発熱を回避します。次に、複数のラメラを持つグリッドを極低温条件下で透過型電子顕微鏡(TEM)に転送し、傾斜系列を取得します。ラメラ調製のための堅牢で汚染のないワークフローは、細胞クライオEM、クライオET、サブトモグラム平均化などのダウンストリーム技術にとって不可欠なステップです。これらの技術の開発、特に高圧凍結サンプルのリフトアウトと粉砕は、現場で優先度が高いです。

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Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

集束イオンビームミリングを使用して、凍結した生物学的サンプルを急落させてクライオ電子線トモグラフィー用にガラス体オングリッドラメラを作成します。

クライオ電子線トモグラフィー用デュアルビーム走査電子顕微鏡を用いたガラス質生体試料からのラメラの調製(英語)

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

このプロトコルは、クライオ電子線トモグラフィーのための熱帯熱マラリア原虫感染赤血球の硝子体ラメラの調製について概説しています。これにより、寄生虫がどのようにマラリアを引き起こすかについての詳細な構造情報を直接観察することができます。クライオ電子線トモグラフィーは、細胞の内部に関する高解像度情報を記録します。単一のタンパク質複合体をその場で観察するのに十分強力であり、計算的に抽出および平均化して、タンパク質に関する3次元構造情報を明らかにすることができます。このプロトコルは、さまざまな細胞タイプに簡単に適合させることができ、クライオ電子線トモグラフィー用の硝子体ラメラを作製する初心者の出発点となります。これは、今日プロトコルを実行するアレハンドラ・カルバハルです。まず、CryoStageを使用して凍結した銅グリッドを光学顕微鏡用にスクリーニングし、グリッド全体の氷の勾配に特に注意を払います。個々のグリッドの正方形をチェックして、氷の薄い領域のセルカバレッジを確認します。黒い消えないマーカーを使用して、クライオ-FIB-SEM固有のオートグリッドリムの前面と反対側をマークします。クリップしたグリッドをカーボン側を上にしてクライオ-FIB-SEMシャトルにロードし、厚さ4ナノメートルのカーボンまたはプラチナ電子ビーム回転コートをセルの表面に塗布します。シャトルをクライオ-FIB-SEMにロードし、SEMによって各グリッド上のセル分布を5キロボルトで評価します。100乗で低倍率の概要を把握して、グリッド全体の氷の勾配を確認します。次に、5, 000の累乗で高倍率の画像を撮影して、個々のグリッドの正方形を確認します。ガス注入システムの針をグリッドの上のチャンバーに挿入し、有機白金源を設定温度に設定時間加熱して蒸気の流れを生成することにより、各グリッドの表面に2マイクロメートルの有機白金コートを塗布します。試料を観察するには、グリッドの平面がイオンビームの入射角から約10度になるように試料を傾け、SEM画像とFIB画像の両方で見られるように適切なグリッド正方形の中心を移動します。低電流のイオンビームを使用して、グリッドを高倍率で調査し、グリッド正方形の中心にあるセルを視覚化します。厚さ3マイクロメートルの保護領域の上と下の2つの長方形パターンをフライス加工します。次に、ビーム設定を選択し、明るさとコントラストを調整して非点収差を修正します。セットアップが完了したら、イオンビームビューでライブの進行状況を監視しながら、SEMで断続的に300ピコアンペアの電流でフライス加工を開始します。サンプルがチェックされます SEMビューで、最初のフライス加工後、イオンビームが保護領域の上下のサンプルを突破していない場合は、長方形のパターンの高さを増やして、より多くの材料を除去します。ラメラの上下の表面がイオンビームビューで完全に滑らかになったら、フライス加工を停止します。フライス加工を段階的に繰り返し、300ナノメートルの厚さに達するまで毎回イオンビーム電流を減らします。各ラメラのXYZ位置を記録します。実験の最後にラメラを研磨するには、低倍率のSEM概要を使用して、研磨するラメラのグループを選択し、研磨ルートにマークを付けます。研磨ルートにマークを付けたら、2つの長方形パターン間のスペースを100〜200ナノメートルに減らし、30ピコアンペアのイオンビーム電流で研磨を開始します。SEMで2〜3キロボルトで進行状況を監視します。ラメラのコントラストがSEMによって失われた場合、または有機プラチナコートまたはラメラ自体が完全性を失い始めた場合は、研磨を停止します。各ラメラの低倍率SEM画像を取得して保存します。実験が完了したら、シャトルを顕微鏡から取り出します。ラメラでグリッドを取り外し、液体窒素の下に保管します。グリッドの取り扱いには注意してください。形態を研究するために、シゾントはE-64阻害剤の化合物2を使用して、出口のさまざまな段階で失速しました。化合物2の存在下では、宿主赤血球中の寄生性膜と周囲のヘモグロビンとの間の境界が明確に定義されていた。無傷の寄生液胞(PV)は、ヘモゾイン結晶の単一のクラスターにメロゾイトを詰めていました。化合物2つの同期シゾントをE-64に洗浄すると、PV膜が破裂し、メロゾイトが赤血球内に広がりました。銅グリッド上の良好な細胞分布の典型的な例は、明確に定義された周辺と無傷の液胞膜を有する大きな赤血球を示す。部分的に崩壊した宿主赤血球内で、個々のメロゾイトを小細胞クラスターとして視覚化した。各シゾントの中心には、ヘモゾイン結晶の位置を示す黒い斑点がありました。フライス加工後、グリッドをTEMにロードして、ラメラの位置を特定し、断層撮影によってターゲットとするのに適した領域を見つけました。サンプルの顕微鏡写真では、最近メロゾイトに侵入されたRBCを見ることができます。宿主細胞由来の膜に囲まれたメロゾイトは、赤血球の境界内に見られました。メロゾイトの頂端では、細胞を囲む2つの膜と、電子密度の高いキノコ形の特徴に関連するメロゾイトの頂点に積み重ねられた4つの膜がはっきりと見えました。メロゾイトの細胞質内では、メロゾイト原形質膜と多層小胞との間の融合事象が同定された。厚さ230ナノメートルのラメラの追加のTEM分析では、E-64で処理された成熟メロゾイトの典型的な形態が観察されました。赤血球膜内では、メロゾイト原形質膜は、内膜複合体、極リング、ミクロネム、ロプトリー、核膜などの細胞小器官で見ることができます。この技術の最も重要な部分は、薄いラメラの再現性のある効率的な生産を可能にするためにグリッドを最適化することです。この技術のさらなる開発により、研究者はマラリア原虫内の単一タンパク質分子を視覚化し、マラリアの排出におけるそれらの役割を決定することができます。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

周囲温度、77 K で生体試料の電子常磁性共鳴の使用

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

時間分解型クライオ電子顕微鏡のための高速グリッド調製

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

クライオ電子断層撮影のための サッカロミセス・セレビシエ の調製とクライオFIBマイクロマシニング

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

単粒子クライオ電子顕微鏡:試料から構造まで

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

全細胞クライオ電子断層撮影ワークフロー内での細胞位置のダイレクト位置を測定するマイクロパターン化透過電子顕微鏡グリッド

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

クライオスパーク、リオン、サイピオンによる堅牢な単一粒子クライオ電子顕微鏡(クライオEM)処理ワークフロー

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

クライオ電子顕微鏡による構造決定のためのDNA修復因子と複合体を形成したヌクレオソームコア粒子の作製

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

クライオ電子顕微鏡による微小管-タンパク質複合体の研究のための哺乳類細胞からの修飾微小管抽出

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

単層グラフェンのクライオ電子顕微鏡グリッドへの高分解能構造決定への応用

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...