Name: preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography
Uploaded: 2021-08-05T13:30:00
Duration: 7 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Denne forskningen ble finansiert helt eller delvis av Wellcome Trust (212916/Z/18/Z). Med henblikk på åpen tilgang har forfatteren anvendt en CC BY offentlig opphavsrettslisens til enhver forfatterakseptert manuskriptversjon som oppstår fra denne innsendingen.
Dette prosjektet som denne metoden ble utviklet for, ble finansiert av et medisinsk forskningsråds stipend MR / P010288 / 1 tildelt Helen R. Saibil, Roland A. Fleck og Michael J. Blackman. Kulturer av P. falciparum ble dyrket ved Francis Crick Institute, med støtte fra medlemmer av Michael J. Blackmans gruppe. Forfatterne vil gjerne takke Dr. Ser Ying (Michele) Tan for å gi bildene av sammensatte 2 og E64-behandlede schizonter i tynne blodutstryk. De fleste lamellene ble produsert med støtte fra ansatte ved eBIC, og vi er takknemlige for tilgang til Scios dual-beam cryoFIB-SEM på forskningsforslag NT21004. Forfatterne anerkjenner også støtten fra Royal Society Industry Fellowship-ordningen (INF\R2\202061) i å fortsette utviklingen av FIB-freseteknikken innen CUI. Forfatterne vil også takke Helen R. Saibil for nyttige diskusjoner i forhold til denne metodeoppgaven og veiledning av prosjektet.

Humant blod ble hentet fra anonymiserte givere gjennom UK National Blood and Transplant-tjenesten og brukes innen 2 uker etter mottak. Ingen etisk godkjenning er nødvendig for bruk.
1. Forberedelse og dypfrysing av Plasmodium falciparum-infiserte røde blodlegemer
<ol><li>Isoler modne schizonter ved sentrifugering (1 580 x g) over et 70 % (v/v) isotont tetthetsgradientmedium (for standardprosedyrer for dyrkning av aseksuelle blodstadier av 3D7 Plasmodium falciparum i humane erytrocytter, se Blackman M.J., 1995:37).</li>
	<li>Fest de lufttørkede tynne blodfilmene på et glassglass med 100 % metanol for å kontrollere schizontenes morfologiske homogenitet før farging med 10 % Giemsa-flekk i 6,7 mM fosfatbuffer, pH 7,1. MERK: For å berike preparatet for schizonter som stopper opp på bestemte utgangspunkter, kan schizonter synkroniseres ytterligere med forbindelse 2- og E64-hemmere (se representative resultater og figur 1 for en forklaring på effekten av disse hemmerne). FORSIKTIG: Plasmodium falciparum er et patogen hos mennesker og må kun håndteres i et egnet inneslutningsanlegg i henhold til lokale retningslinjer for helse og sikkerhet.</li>
	<li>Sentrifuge schizonter forsiktig (240 x g) for å pelletere dem og resuspendere i 2x volum av cellepelleten til RPMI-medier, noe som resulterer i en 50 % hematokritsuspensjon.</li>
	<li>På en manuell stupfryserigg, bruk 2,5 μL schizonter på karbonsiden av en glødutladet (Bruk innstillinger for glødeutladningsenhet på 60 s, 30 mA i luft, behandle bare karbonsiden av rutenettet) 200 mesh kobbergitter med en 2/4 holey karbonfilm og blett for ~ 20 s fra baksiden av rutenettet ved hjelp av klasse 1 filterpapir med revet kant. Kast deg ut i flytende nitrogenkjølt flytende etan og overfør ristene til lagring (se materialfortegnelse for utstyr som ble brukt i denne studien). MERK: Eksperimentet kan settes på pause her, og rutenett kan lagres under flytende nitrogen på ubestemt tid. FORSIKTIG: Flytende nitrogen er et kvelningsmiddel og forårsaker frostskader; Håndteres forsiktig i et egnet miljø med oksygenovervåking. FORSIKTIG: Flytende etan forårsaker alvorlige forbrenninger og er brannfarlig; Bruk i en avtrekkshette vekk fra tennkilder. MERK: Stupefrosne schizonter er ikke lenger levedyktige. Dette ble bestemt ved å inkubere humant blod med flere gullgitter av lufttinte stupfrosne schizonter og observere ingen parasittvekst etter flere dager, sammenlignet med ikke-frosne kontroller. Frosne rister av schizonter er derfor trygge å håndtere utenfor inneslutningsanlegg ved bruk av normale sikkerhets- og dekontamineringsprosedyrer (hansker, overflate/verktøysterilisering med >70% etanol og deponering av rister i >70% etanol).</li>
	<li>Skjerm rutenett ved hjelp av et kryo-stadium for et lysmikroskop, med spesiell oppmerksomhet på gradienten av is over rutenettet. I de tynnere områdene av is, sjekk individuelle rutenett for celledekning. MERK: De beste rutene skal være én celletykk i midten av rutenettet (figur 2). Dette sikrer at en lamell kan freses over midten av torget uten å treffe den tykkere isen i kantene mot gitterstengene. Forsøket kan settes på pause her, og nett kan lagres under flytende nitrogen på ubestemt tid. Hvis celler bærer en fluorescerende markør, kan rutenett også screenes av cryoCLEM for å lokalisere X/Y-posisjoner av interesse, som kan korreleres med rutenettplasseringer i kryoFIB-SEM for direkte fresing.</li>
</ol>2. On-grid FIB-fresing av stupefrosne celler
<ol><li>Merk forsiden av kryoFIB-spesifikke autogrid-felger med en svart, uutslettelig markørpenn for å indikere midten av den utskårne delen og motsatt side av felgen (figur 3). Sett opp klippestasjonen og klipp rutenett i de merkede ringene med karbonsiden ned.</li>
	<li>Legg rister inn i kryoFIB-SEM shuttle (vanligvis 2 rister, avhengig av skyttelbussen) karbonside opp og påfør et platina sputter coat i en argonatmosfære (5 x 10-2 mbar) (5 mA i 60 s - tykkelsen er variabel) eller et karbon / platina e-stråle roterende lag (~ 4 nm tykkelse) til overflaten av cellene. MERK: Begge typer belegg hjelper ladningsspredning under SEM-avbildning. Fordelen med e-beam roterende belegg er at den nøyaktige tykkelsen på belegget kan spesifiseres.</li>
	<li>Legg romfergen inn i kryoFIB-SEM og vurder cellefordelingen på hvert rutenett med SEM ved 5 kV (13 pA eller 25 pA). Ta en oversikt over lav forstørrelse (~ 100x) for å se på isgradienter over rutenettet. Ta deretter bilder med høyere forstørrelse (~ 5000x) for å se på individuelle rutenettfirkanter og identifisere områdene i rutenettet med synlige cellulære egenskaper og lav overflateforurensning til fres.</li>
	<li>Påfør et >2 μm organoplatinumbelegg på overflaten av hvert rutenett ved hjelp av gassinjeksjonssystemet (GIS). For å gjøre dette, stikk GIS-nålen inn i kammeret over rutenettet og varm organoplatinumkilden til en innstilt temperatur i en angitt tid (for eksempel ~ 27 ° C i 3-10 s) for å produsere en strøm av damp. MERK: Påføringsvinkelen, temperaturen og tidspunktet for organoplatinumbelegget via GIS-nålen bør optimaliseres for å maksimere et jevnt belegg. Dette vil avhenge av den spesifikke kryoFIB-SEM som brukes (se representative resultater for ytterligere forklaring).</li>
	<li>Vipp prøven slik at rutenettets plan er ~ 10 ° fra forekomstvinkelen til ionstrålen og flytt midten av en passende rutenettfirkant som skal ses i både SEM- og FIB-bildene.</li>
	<li>Undersøk rutenettet ved hjelp av ionstrålen ved lav strøm (nominelt 1,5 pA, 30 kV) og gå til høy nok forstørrelse (~ 7000x) for å visualisere cellene i sentrum av et rutenett firkant. Ta prøven i fokus ved første fresestrøm (300 pA) og korriger for astigmatisme. Juster lysstyrken og kontrasten, og merk deretter ut to rektangulære mønstre til frese, en over og en under en 3 μm tykk beskyttet region, hvis senter er ønsket plassering av den endelige lamellen. MERK: Den valgte bredden på mønstrene vil avhenge av topografien til det omkringliggende cellelaget og cellestørrelsen. 7-20 μm er en passende bredde for schizonter, men bredere lameller tar lengre tid å frese. Den valgte høyden på mønstrene for det første fresetrinnet avhenger av prøvetykkelsen, som starter rundt 6 μm; Dette må kanskje justeres under fresing. Fresing utføres retningsbestemt fra utvendige topp- og bunnkanter av mønstrene mot lamellens ansikt. Dette kan gjøres parallelt, hvor begge mønstrene freses samtidig eller sekvensielt, først fjerner materiale fra over lamellen og deretter fra undersiden.</li>
	<li>Begynn å frese ved første strøm; overvåke fremdriften i sanntid i ionstrålevisningen og periodisk med SEM (5 kV, 13 eller 25 pA). Kontroller at ionstrålen har brutt gjennom prøven over og under det beskyttede området. Hvis ikke, øk høyden på de rektangulære mønstrene for å fjerne mer materiale. Stopp når overflaten over og under lamellen er helt glatt i ionstrålevisningen. MERK: Ionstrålen har brutt gjennom prøven over og under det beskyttede området når innsiden av de rektangulære mønstrene ikke inneholder noen funksjoner i fokalplanet. Noen funksjoner, for eksempel rutenettstolper, kan være synlige ute av fokus i bakgrunnen.</li>
	<li>Bytt til neste fresestrøm (100 pA); Fokuser og juster lysstyrken/kontrasten. Reduser avstanden mellom de to rektangulære mønstrene til 1,5 μm og reduser mønsterhøyden til bare å dekke det ikke-malte materialet. Begynn å frese ved den nye strømmen til overflaten over og under lamellen er helt glatt.</li>
	<li>Gjenta denne prosessen trinnvis til en tykkelse på 0,3 μm er nådd, og reduser ionstrålestrømmen hver gang i henhold til freseskjemaet i tabell 1.</li>
	<li>Fres flere lameller (mengden er avhengig av prøvens tykkelse og tilgjengelig tid) på ett eller begge rutene til en tykkelse på 0,3 μm, registrer X / Y / Z-posisjonen til hver lamell og reserver ~ 1-2 timer på slutten av økten for å polere lamellene til deres endelige tykkelse (60-200 nm).</li>
	<li>Ta en SEM-oversikt med lav forstørrelse over hele rutenettet og planlegg en poleringsrute fra lameller foran i rutenettet (nærmere ionstrålekilden) til lameller på baksiden av rutenettet (lengst unna ionstrålekilden) (figur 5). MERK: Dette reduserer redeponering av ablert materiale tilbake på overflaten av polerte lameller.</li>
	<li>Reduser avstanden mellom de to rektangulære mønstrene til 100-200 nm og begynn det siste poleringstrinnet ved en ionstrålestrøm på 30 pA. Overvåk fremdriften ved SEM ved 2-3 kV (13 pA, bor = 300 n, 3072 x 2048, ~ 2 s for fullformat) og stopp poleringen når kontrasten går tapt i lamellen ved SEM eller når organoplatinumbelegget til lamellen selv begynner å miste integritet.</li>
	<li>Før du fjerner rutenettene, må du skaffe deg et SEM-bilde med lav forstørrelse av hele rutenettet og lagre bilder av hver lamell. Bruk dem til å kryssjekke rutenettet senere i TEM. Pause eksperimentet her og lagre ristene med lameller under flytende nitrogen - håndter med forsiktighet. MERK: Rister kan lett sputter belagt ved fjerning fra cryoFIB-SEM, noe som kan bidra til å begrense drift og lading i TEM ved høy forstørrelse, men dette bør gjøres forsiktig da for mye sputterbelegg kan skjule det biologiske innholdet inne i lamellene. Det er mulig å skjerme lameller for fluorescens på dette stadiet; Imidlertid vil det å få nok signal avhenge av overflod av det merkede proteinet i tykkelsen av lamellen. Det må utvises stor forsiktighet ved håndtering av ristene for å begrense skader på lamellene og forhindre overflateforurensning.</li>
</ol>3. Tilt-serieoppkjøp og generell oversikt over databehandling
<ol><li>Last rutenettene inn i TEM, og juster freseretningen vinkelrett på hellsaksen på trinnet. MERK: Justering av rutenettene gjøres med øyet ved hjelp av merkene på autogridfelgen. En ~ 10 ° feilmargin er akseptabelt, ellers kan veggene i grøften på hver side av lamellen skjule lamellen når rutenettet er vippet.</li>
	<li>Skaff deg et kart med lav forstørrelse (~ 150x) av hele rutenettet og finn lamellene; Deretter får du et middels forstørrelseskart (~ 1,500x, avhengig av lamellstørrelse) av hver lamell og finner interesseområdene.</li>
	<li>Vipp rutenettet ±10° for å gjøre lamellplanet (ikke rutenettet) vinkelrett på den optiske aksen MERK: Retningen på fortilten kan bestemmes av posisjonen til lamellens forkant (ser etter venstre over organoplatinumbelegg) i kartene med lav og middels forstørrelse. For TEM-en som brukes her, krever rutenett en +10° forvipping hvis lamellens forkant peker opp i kartene og krever en -10° forvipping hvis de peker nedover. Hvert rutenett kan være forskjellig på grunn av hvordan de ble plukket opp og satt inn i autoloaderen.</li>
	<li>Hent dosesymmetrisk vippeserie38 (for eksempel -54° til +54° med en økning på 3-5°) ved en pikselstørrelse som tillater både synsfeltet og oppløsningen som kreves for interesseområdet. Bruk et område med defokusverdier mellom -2 og -5 μm. Samle filmer med 3-10 bilder i hvert trinn, og juster disse parametrene avhengig av pikselstørrelsen for å akkumulere en total dose på ~ 150 e-/Å2 (for en 300 kV TEM). MERK: Sprekker i lamellen bør unngås da disse områdene kan drive. Overflatekontaminering bør også unngås, da det kan skjule interesseområdet eller fokusområdet ved høy tilt.</li>
	<li>Bevegelse korrigere filmene ved hjelp av et program som MotionCor239. Bruk et dosevektingsfilter på de korrigerte bildene (akkumulert e-/bilde)40 og estimere ufokuseringen for hvert bilde ved hjelp av et program som CTFFIND441.</li>
	<li>Bruk fiducial-less alignment (patch tracking) i et program som etomo (IMOD)42 for å beregne justeringen og vinkelforholdet mellom bildene i vippeserier.</li>
	<li>Skriv inn justerings- og rotasjonsinformasjonen, sammen med defokusverdiene i et program som kan bruke tredimensjonal CTF-korreksjon, for eksempel NovaCTF43. Beregn et korrigert tomogram for å få utdatatomogrammer med binningsfaktorer som er relevante for nedstrømsanalyse.</li>
	<li>Analyser rekonstruksjonene og forbered deg på eventuell nedstrømsbehandling, for eksempel filtrering, segmentering eller gjennomsnitt av sub-tomogram.</li>
</ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Mens kryoFIB-fresing blir mer rutinemessig, har ikke klargjøring av optimale prøver for fresing gjort det; Derfor skjer de fleste kritiske trinnene i denne protokollen før prøven når kryoFIB-SEM. Prøveoptimalisering ved flere runder med cellepreparering, stupefrysing og screening ved lys- og elektronmikroskopi er nødvendig for å produsere best mulig prøve før fresing forsøkes. Å ha best mulig prøve øker ikke bare sjansene for suksess, men optimaliserer også bruken av utstyret. Av denne grunn krever de fleste nasjonale anlegg bevis på at tilstrekkelig optimalisering er utført før de gir tid på maskinene sine. Inne i kryoFIB-SEM er det avgjørende å maksimere effektiviteten til organoplatinumbelegget for å produsere jevnt tynne lameller. Til slutt er tålmodighet og god prøvehåndtering en forutsetning fra brukeren, som vil bli pålagt å sitte i flere dager og produsere og deretter overføre rister som inneholder delikate lameller. Dette kan endre seg med introduksjonen av automatiserte fresestrategier47,48, men foreløpig er hele freseprosessen fortsatt stort sett manuell på de fleste anlegg.
Mens arbeidet fokuserte utelukkende på P. falciparum schizonts, kunne metoden som presenteres her enkelt modifiseres for å optimalisere gridforberedelse og fresing for andre celletyper. Viktige faktorer å vurdere er tettheten av cellene som påføres rutenettet, rutenetttypen (kobber er giftig for noen celler), størrelsen og avstanden mellom hull i karbonfilmen, blottingstiden og metoden for blotting (enkelt / dobbeltsidig, manuell eller automatisert). I tillegg, hvis cellene dyrkes på ristene (vanligvis gullgitter med en holey karbonfilm), kan sammenløp kontrolleres ved lysmikroskopi før blotting og frysing. Fresestrategien avhenger av hvordan cellene er avsatt på rutenettet. For malariainfiserte røde blodlegemer, er rutenettet i hovedsak belagt av et ubrutt lag av celler, tykkere i enkelte områder og tynnere i andre områder. Fresing utføres på flere punkter i en region langs denne gradienten hvor istykkelsen genererer lameller som er en passende størrelse for tomografi. Denne tilnærmingen fungerer bra for mindre celler, da du kan produsere lameller som inneholder et stykke gjennom flere celler. For større celler eller klumper av celler, kan det være tilfelle at en celle eller celle klump kan produsere en lamell.
Netthåndtering og prøveoverføring er fortsatt en av hovedutfordringene i denne arbeidsflyten. Lameller kan gå tapt på grunn av brudd eller sprekker, gardinerende gjenstander som skjuler biologien, overdreven overflateforurensning, samt rutenettorienteringsproblemer i TEM, noe som krever et ekstra håndteringstrinn for å flytte rutenettet. Graden av tap varierer fra dag til dag og fra nett til nett, men det forbedres gjennom praksis og håndteringserfaring over tid. I denne studien ble det funnet at ristene kan omorienteres forsiktig i autoloaderen flere ganger uten å ødelegge lameller, og dette har noen ganger fordelen av å vaske av overflateis. En annen hovedbegrensning i denne arbeidsflyten er tiden det tar å produsere lameller. Siden produksjonen er treg, er det avgjørende å ha en riktig optimalisert prøve, noe som gjør fresingen så effektiv som mulig.
En rekke tilpasninger til FIB-fresing av biologiske prøver i glasslegemet er nylig introdusert. En game-changer er implementeringen av kryogenisk avkjølte løfteverktøy i cryoFIB-SEM-kammeret som gjør det mulig å frese større blokker av materiale fra høytrykksfrosne prøver. Blokkene kan festes til en metallstang eller plukkes opp i en griper og flyttes til en annen prøveposisjon, som inneholder et spesielt modifisert EM-rutenett. Blokkene kan deretter belegges med organoplatinum og freses for å generere lameller. Evnen til å male lameller fra høytrykksfrosset materiale betyr at mye større celler og vev kan behandles, spesielt rettet mot områder ved korrelativ fluorescensmikroskopi12. Andre nylige tilpasninger til FIB-fresemetoden inkluderer reduksjon av gardineringsartefakter ved kileprefresing av prøven16, mikrofluidisk kryofiksering49 og fotomikromønster av elektronmikroskopigitter for å forbedre cellefordelingen50. Det har også blitt påvist at fresing av mikroekspansjonsgap på hver side av en lamell kan lindre kompresjonen av den omkringliggende prøven når den når sin endelige tynnhet51. Dette kan være spesielt nyttig ved fresing av kontinuerlige cellelag, slik som prøven i denne studien, hvor bøying av lameller noen ganger ses under det siste poleringstrinnet.
Fremtiden for elektronmikroskopi vil trolig være bestemmelse av in situ molekylære strukturer ved sub-tomogram gjennomsnitt og FIB-fresing er et viktig verktøy som vil lette produksjonen av glassaktige biologiske prøver for disse typer arbeidsflyter. Mens FIB-fresing fortsatt er i sin barndom for biologiske anvendelser, skjer metodeutviklingen i et raskt tempo takket være det harde arbeidet til forskere, både akademiske og ved nasjonale anlegg, pluss kommersielle investeringer i å utvikle cryoFIB-SEM-teknologi for å støtte forskning.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated from:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University
to:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
M. Alejandra Carbajal1 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Bare det cellulære innholdet i biologiske prøver <500 nm tykt kan avbildes effektivt ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM) ved kryogene temperaturer, og begrenser prøveområdet til virus, prokaryoter, enkle encellede organismer og tynnere områder av større eukaryote celler1. On-grid fokusert ionstråle (FIB)-fresing gjør at tykkere stupfrosne biologiske prøver kan tynnes til elektrontransparente lameller ved kryogene temperaturer (< -150 ° C). De resulterende lamellene overføres deretter til en TEM for visualisering og tomografisk datainnsamling, noe som muliggjør høyoppløselige 3D-rekonstruksjoner av de cellulære og molekylære egenskapene inne i celler (for vurderinger, se Rigort et al., 20122, Oikonomou et al., 20163, og Wagner et al., 20204).
FIB-fresing dukket opp fra materialvitenskap, hvor prøver rutinemessig tynnes for å forberede dem for nedstrømsanalyse5. Det utføres i et skanningelektronmikroskop (SEM), som har to optiske kolonner: konvensjonell skanningelektronmikroskopoptikk og en andre kolonne som inneholder optikk som kan generere og finstyre en fokusert ionstråle (FIB) - kalt en FIB-SEM. Dette gjør at en bestemt region av prøven kan ableres av ioner generert av en galliumkilde, fjerne overflødig materiale og etterlate en lamell6. Freseprosessen styres av SEM-avbildning av prøvens topografi, som brukes til å lokalisere regioner av interesse og overvåke fresefremgang. For biologiske applikasjoner er det grunnleggende oppsettet stort sett det samme, men fresing utføres ved kryogene temperaturer. Dette har krevd at standard FIB-SEM-er må tilpasses for å ha kryokjølte trinn som opprettholder konstante temperaturer og lave overflateforurensningsrater, samt luftsluser for å lette prøveoverføring uten avvik eller forurensning. Prøveskyttelbussene har også blitt modifisert for å gjøre det mulig å montere en rekke forskjellige bærere inne i kryoFIB-SEM, inkludert TEM-gitter, planchetter og kapillærer. Flere sentrale forskergrupper har vært sentrale i utviklingen av disse metodene og den fortsatte teknologiske utviklingen på dette området 7,8,9,10,11,12. Kommersielle løsninger er nå mer allment tilgjengelige for biologisk FIB-fresing ved kryogen temperatur, og on-grid fresing av lameller blir mer rutinemessig, gitt en optimalisert prøve.
En rekke romtemperatur- og kryoEM-teknikker kan brukes til å visualisere cellulær informasjon på tvers av alle livets skalaer, fra hele flercellede organismer med beskjeden oppløsning til å forstå sammenhengen mellom komplekse prosesser på mobilnivå og i enda større detalj, til bestemmelse av in situ Molekylære strukturer13,14,15,16,17,18,19. Klassiske romtemperaturteknikker inkluderer seksjonering av faste og fargede, harpikspregede celler og vev ved ultramikrotomi for analyse av cellulær morfologi ved TEM (for gjennomgang se Studer et al., 200820). Alternative teknikker har blitt utviklet ved å utnytte sekundær elektronspredning av SEM for å avbilde overflaten av blokker av bevarte celler, før man gradvis fjerner materiale enten med en kniv (seriell blokk ansiktsbilde) eller en fokusert ionstråle21,22,23. Denne teknikken har også blitt implementert ved kryogene temperaturer (referert til som kryovolumavbildning) med en cryoFIB-SEM på glassaktige, ufargede blokker av celler eller vev24. Alternativt kan tykkere lameller (~15 μm tykke) freses og studeres ved STEM-avbildning25. Ved hjelp av disse teknikkene kan hele blokker som inneholder mange celler avbildes for å samle befolkningsinformasjon, eller et helt organ / organisme kan avbildes og rekonstrueres i 3D. For å få tilgang til høyoppløselig molekylær informasjon fra celler, må prøvene imidlertid bevares i en nær-innfødt, frossen-hydrert tilstand og må derfor fremstilles under kryogene forhold. Kryo-elektronmikroskopi av glasslegemesnitt (CEMOVIS) er en teknikk der høytrykksfrosne blokker av biologisk materiale seksjoneres under kryogene forhold med et ultramikrotom. Dette gir bånd av kryoseksjoner (40-100 nm tykke)26, som er koblet til et EM-rutenett og avbildet i TEM. Imidlertid forårsaker den fysiske samspillet mellom kniven og glassprøven sprekker og kompresjonsartefakter som kan forvride cellulær struktur alvorlig27,28,29,30. Tykkere seksjoner er mer utsatt for disse artefaktene, noe som gjør det upraktisk å bruke seksjoner tykkere enn ~ 70 nm26. Denne begrensningen begrenser i stor grad 3D-visningen av den biologiske strukturen i tomogrammet. FIB-fresing ved kryogene temperaturer opplever ikke disse problemene, men har sine egne artefakter forårsaket av differensielle fresehastigheter over deler av prøven, noe som fører til variable tykkelser i en lamell - kalt gardinering. Dette problemet reduseres ved påføring av et organoplatinumbelegg påført via et gassinjeksjonssystem (GIS), som beskytter lamellens forkant under fresing31. Den øvre grensen for prøvetykkelse for FIB-fresing på nettet er definert av evnen til å stupe fryse prøven mens du holder den glassaktig32, men med introduksjonen av kryoutløftingsteknikker og tilpassede prøvebærere for biologiske prøver, kan FIB-fresing også brukes til å behandle høytrykksfrosne prøver31,33,34,35. I tillegg kan stupefrosne prøver ikke være for tynne, da det må være nok biologisk materiale til å generere en lamell av rimelig størrelse som vil gi nok overflateareal til å samle tilt-serier ved ønsket forstørrelse. Dette problemet kan lindres ved å frese klumper av mindre celler, for eksempel bakterier eller gjær. Endelig lamelltykkelse (~ 100-300 nm) dikteres vanligvis av prøveintegriteten og fresestrategien. Tynnere lameller er bedre for høyoppløselig strukturelt arbeid, for eksempel sub-tomogram gjennomsnitt, men tykkere lameller inneholder mye større cellulære volumer enn det som kan oppnås ved CEMOVIS, noe som gir mer cellulær kontekst i en nær til naturlig bevart prøve. FIB-fresing kan også brukes til å tynne stupfrosne proteinkrystaller for elektrondiffraksjonsstudier36.
FIB-fresing av glassceller er verdt tiden og kreftene å utføre hvis det vitenskapelige spørsmålet krever høyoppløselige molekylære detaljer av nærfødte prøver in situ. Med tilgang til flere fasiliteter for rutinemessig produksjon av lameller, er hastighetsbegrensende trinn ofte optimalisering av prøven før fresing, hvor det må tas tid for å sikre at prøven er glassaktig og en passende tykkelse for å produsere robuste og jevnt tynne lameller. Beskrevet her er prøveoptimaliseringen for FIB-fresing av stupefrosne humane røde blodlegemer infisert med Plasmodium falciparum-parasitter , det forårsakende middelet til malaria, men denne tilnærmingen kan tilpasses for en gitt prøve.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>c-clips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Direct quote from Thermo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>Sub-angstrom</td>
			<td>CSA-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound 2</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-FIB specific autogrid rims</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1205101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E64</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emitech K100X glow discharge unit</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12633012</td>
			<td>Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>350864X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11562203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Sub-angstrom</td>
			<td>PB</td>
			<td>For clipped grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>For clipped grids - direct quote from Thermo Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Home-made manual plunge freezing rig</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human blood</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>UK National Blood and Transplant service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>n/a</td>
			<td>FIB-SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td>sputter coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE900</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td>e-beam rotary coater. In a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linkam cryo-stage for light microscope</td>
			<td>Linkam</td>
			<td>Model No. CMS196</td>
			<td>Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse E200 light microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C17nCuH2-01</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C17nCu20-01</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum PP3010 prep-chamber</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>n/a</td>
			<td>sputter coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage.</td>
			<td>FEI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>FIB-SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen</td>
			<td>Viking Direct</td>
			<td>ND538522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFS Titan Krios 300 kV TEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>TEM equipped with a K2 or K3 camera.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatmann grade 1 filter paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA1001150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Scope A1 light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td>with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography

Presentert her er en protokoll for fremstilling av kryo-lameller fra stupfrosne rister av Plasmodium falciparum-infiserte humane erytrocytter, som lett kan tilpasses for andre biologiske prøver. De grunnleggende prinsippene for fremstilling av prøver, fresing og visning av lameller er felles for alle instrumenter, og protokollen kan følges som en generell veiledning for kryo-lamellforberedelse på nettet for kryo-elektronmikroskopi (kryoEM) og kryo-elektrontomografi (cryoET). Elektronmikroskopigitter som støtter cellene, stupefryses ned i flytende nitrogenkjølt flytende etan ved hjelp av en manuell eller automatisert dykkfryser, og screenes deretter på et lysmikroskop utstyrt med et kryotrinn. Frosne rister overføres til et kryoskanningselektronmikroskop utstyrt med en fokusert ionstråle (cryoFIB-SEM). Rister blir rutinemessig sputter belagt før fresing, noe som hjelper spredning av ladningsoppbygging under fresing. Alternativt kan en e-stråle roterende coater brukes til å påføre et lag karbon-platina til rutenettene, hvis nøyaktige tykkelse kan kontrolleres mer nøyaktig. Inne i kryoFIB-SEM påføres et ekstra belegg av en organoplatinumforbindelse på overflaten av rutenettet via et gassinjeksjonssystem (GIS). Dette laget beskytter lamellens forkant når den er malt, hvis integritet er avgjørende for å oppnå jevnt tynne lameller. Regioner av interesse identifiseres via SEM og fresing utføres trinnvis, noe som reduserer strømmen av ionstrålen når lamellen når elektrongjennomsiktighet for å unngå overdreven varmeutvikling. Et rutenett med flere lameller overføres deretter til et transmisjonselektronmikroskop (TEM) under kryogene forhold for tilt-serieoppkjøp. En robust og forurensningsfri arbeidsflyt for lamellklargjøring er et viktig trinn for nedstrømsteknikker, inkludert cellulær kryoEM, kryoET og gjennomsnitt av sub-tomogram. Utvikling av disse teknikkene, spesielt for løft og fresing av høytrykksfrosne prøver, er høyt prioritert i feltet.

Watch this Scientific Journal Video about Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Ved hjelp av fokusert ionstrålefresing for å produsere glassaktige lameller på nettet fra stupefrosne biologiske prøver for kryo-elektrontomografi.

Forbereder lameller fra glassaktige biologiske prøver ved hjelp av et dual-beam skanning elektronmikroskop for kryo-elektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Denne protokollen skisserer fremstillingen av glassaktige lameller av Plasmodium-falciparum-infiserte røde blodlegemer for kryo-elektrontomografi. Dette muliggjør direkte observasjon av detaljert strukturell informasjon om hvordan parasitten forårsaker malaria. Kryo-elektrontomografi registrerer høyoppløselig informasjon om innsiden av celler.Det er kraftig nok til å observere enkeltproteinkomplekser in situ, som kan beregningsmessig ekstraheres og gjennomsnittes for å avsløre tredimensjonal strukturell informasjon om proteiner. Denne protokollen kan enkelt tilpasses for forskjellige celletyper og kan være et utgangspunkt for noen nye til å produsere glassaktige lameller for kryo-elektrontomografi. Dette er Alejandra Carbajal, som skal gjennomføre protokollen i dag.Til å begynne med, skjerme de frosne kobberristene ved hjelp av et CryoStage for et lysmikroskop med spesiell oppmerksomhet på gradienten av is over rutenettet. Sjekk individuelle rutenettruter for celledekning i de tynnere områdene med is. Bruk en svart uutslettelig markør for å markere forsiden og motsatt side av Cryo-FIB-SEM-spesifikke Autogrid-felger.Legg det klippede rutenettet inn i Cryo-FIB-SEM shuttle med karbonsiden opp, og påfør et fire nanometer tykt karbon- eller platina e-stråle roterende lag på overflaten av cellene. Last romfergen inn i Cryo-FIB-SEM og vurder cellefordelingen på hvert rutenett med SEM ved fem kilovolt. Ta en oversikt over lav forstørrelse ved 100 effekt for å se på isgradienter over rutenettet.Ta deretter bilder med høyere forstørrelse ved 5.000 strøm for å se på individuelle rutenettruter. Påfør et to mikrometer organoplatinumbelegg på overflaten av hvert rutenett ved å sette gassinjeksjonssystemnålen inn i kammeret over rutenettet og varme organoplatinumkilden til en innstilt temperatur i en bestemt tid for å produsere en dampstrøm. For å observere prøven, vipp prøven slik at rutenettets plan er ca. 10 grader fra ionstrålens innfallsvinkel, og flytt midten av et passende rutenettkvadrat som skal ses på både SEM- og FIB-bildene.ved hjelp av ionstrålen ved lav strøm, Undersøk rutenettet ved høy forstørrelse for å visualisere cellene i sentrum av et rutenett firkant. Merk ut to rektangulære mønstre for å frese, ett over og ett under et tre mikrometer tykt beskyttet område. Velg deretter stråleinnstillingene og riktig astigmatisme ved å justere lysstyrken og kontrasten.Etter at oppsettet er fullført, start fresingen med en strøm på 300 picoampere mens du overvåker fremdriften i strømføringen i ionstrålevisningen og periodisk av SEM. Prøven kontrolleres i SEM-visningen, og etter den første fresing, Hvis ionstrålen ikke har brutt gjennom prøven over og under det beskyttede området, fjern mer materiale ved å øke høyden på de rektangulære mønstrene. Stopp fresingen når overflaten over og under lamellen er helt glatt i ionstrålevisningen.Gjenta freseprosessen trinnvis, reduser ionstrålestrømmen hver gang til en tykkelse på 300 nanometer er nådd. Registrer X Y Z-posisjonen til hver lamell. For å polere lamellene på slutten av eksperimentet, bruk en SEM-oversikt med lav forstørrelse for å velge en gruppe lameller som skal poleres og merke poleringsroten.Når poleringsroten er merket, reduser du mellomrommet mellom de to rektangulære mønstrene til 100 til 200 nanometer og begynner poleringen ved en ionstrålestrøm på 30 picoampere. Overvåk fremdriften ved SEM ved to til tre kilovolt. Stopp poleringen når kontrasten i lamellen går tapt av SEM eller når organoplatinumbelegget eller lamellen selv begynner å miste integritet.Skaff og lagre SEM-bilder med lav forstørrelse av hver lamell. Etter at forsøket er fullført, fjern skyttelbussen fra mikroskopet. Fjern ristene med lameller og oppbevar dem under flytende nitrogen.Håndter ristene med forsiktighet. For å studere morfologi ble schizontene stoppet på forskjellige stadier av utgang ved hjelp av forbindelse to i E-64-hemmere. I nærvær av forbindelse to var grensen mellom parasitoformembranene og det omkringliggende hemoglobin i vertsens røde blodlegemer veldefinert.Den intakte parasitoforøse vakuolen, eller PVene, ble pakket med merozoitter i en enkelt klynge av hemozoinkrystaller. Når sammensatte to synkroniserte schizonter ble vasket inn i E-64, ble PV-membranen sprukket og merozoittene spredt ut i RBC. Et typisk eksempel på god cellefordeling på et kobbergitter viser store røde blodlegemer med en veldefinert periferi og en intakt vakuolmembran.Innenfor en delvis kollapset verts røde blodcelle ble de enkelte merozoittene visualisert som små celleklynger. Hver schizont hadde en svart flekk i midten som indikerte posisjonen til hemozoinkrystallene. Etter fresing ble ristene lastet inn i TEM for å identifisere lamellens posisjoner og finne egnede områder å målrette ved tomografi.I prøvemikrografen kan man se en RBC som nylig hadde blitt invadert av en merozoitt. Merozoitten omgitt av vertscelleavledet membran kunne ses innenfor grensen til RBC. I den apikale enden av merozoitten var de to membranene som omgir cellen og fire membraner stablet i toppen av merozoitten assosiert med en elektrontett soppformet funksjon tydelig synlige.Innenfor merozoittens cytoplasma ble det identifisert en fusjonshendelse mellom merozoittplasmamembranen og en flerlags vesikkel. I en ytterligere TEM-analyse av en 230 nanometer tykk lamell ble den typiske morfologien til en moden merozoitt behandlet med E-64 observert. Innenfor den røde blodcellemembranen kan merozoittplasmamembranen ses med organeller som det indre membrankomplekset, polare ringer, mikronemes, rhoptries og nukleær konvolutt.Den viktigste delen av denne teknikken er å optimalisere ristene for å muliggjøre reproduserbar og effektiv produksjon av tynne lameller. Videre utvikling av denne teknikken vil gjøre det mulig for forskere å visualisere enkeltproteinmolekyler i malariaparasitter og bestemme deres rolle i malarial utgang.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Bruk av elektron spinn resonans i biologiske prøver omgivelsestemperatur og 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Rask nettforberedelse for tidsavklart kryo-elektronmikroskopi

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Forberedelse og Cryo-FIB mikromaskinering av Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: Fra prøve til struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Mikropattering overføring elektronmikroskopinett til direkte celleposisjonering i hele celler Cryo-Electron Tomography Arbeidsflyter

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

En robust kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) prosesseringsarbeidsflyt med kryoSPARC, RELION og scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Fremstilling av nukleosomkjernepartikler kompleksert med DNA-reparasjonsfaktorer for kryo-elektronmikroskopi strukturell bestemmelse

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Ekstrahering av modifiserte mikrotubuli fra pattedyrceller for å studere mikrotubuli-proteinkomplekser ved kryo-elektronmikroskopi

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Anvendelse av monolags grafen til kryo-elektronmikroskopigitter for høyoppløselig strukturbestemmelse

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...