Name: preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography
Uploaded: 2021-08-05T13:30:00
Duration: 7 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Esta pesquisa foi financiada no todo ou em parte pelo Wellcome Trust (212916/Z/18/Z). Para fins de acesso aberto, o autor aplicou uma licença pública de direitos autorais CC BY a qualquer versão do Manuscrito Aceito pelo Autor decorrente desta submissão.
Este projeto para o qual este método foi desenvolvido foi financiado por uma bolsa do Conselho de Pesquisa Médica MR/P010288/1 concedida a Helen R. Saibil, Roland A. Fleck e Michael J. Blackman. Culturas de P. falciparum foram cultivadas no The Francis Crick Institute, com o apoio de membros do grupo de Michael J. Blackman. Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Ser Ying (Michele) Tan por fornecer as imagens dos esquizontos tratados com composto 2 e E64 em esfregaços de sangue fino. A maioria das lamelas foi produzida com o apoio da equipe da eBIC e somos gratos pelo acesso ao Scios dual-beam cryoFIB-SEM na proposta de pesquisa NT21004. Os autores também agradecem o apoio do esquema Royal Society Industry Fellowship (INF\R2\202061) na continuidade do desenvolvimento da técnica de fresagem FIB dentro da CSI. Os autores também gostariam de agradecer a Helen R. Saibil pelas discussões úteis em relação a este artigo de métodos e supervisão do projeto.

O sangue humano foi obtido de doadores anônimos através do Serviço Nacional de Sangue e Transplante do Reino Unido e é usado dentro de 2 semanas após o recebimento. Não é necessária aprovação ética para sua utilização.
1. Preparação e congelamento por imersão de hemácias infectadas por Plasmodium falciparum
<ol><li>Isolar esquizontos maduros por centrifugação (1.580 x g) sobre um meio de gradiente de densidade isotônico de 70% (v/v) (para procedimentos padrão sobre como cultivar estágios sanguíneos assexuados de Plasmodium falciparum 3D7 em eritrócitos humanos, ver Blackman M.J., 199537).</li>
	<li>Fixar os filmes finos de sangue secos ao ar em uma lâmina de vidro com metanol a 100% para verificar a homogeneidade morfológica dos esquizontos antes de corar com coloração de Giemsa a 10% em tampão fosfato 6,7 mM, pH 7,1. NOTA: Para enriquecer a preparação para esquizontos estacionados em pontos específicos de saída, os esquizontos podem ser sincronizados com os inibidores dos compostos 2 e E64 (consulte Resultados Representativos e Figura 1 para obter uma explicação do efeito desses inibidores). CUIDADO: O Plasmodium falciparum é um patógeno humano e só deve ser manuseado em uma instalação de contenção adequada seguindo as diretrizes locais de saúde e segurança.</li>
	<li>Centrifugar suavemente os esquizontes (240 x g) para pelletá-los e ressuspender em 2x volume do pellet celular do meio RPMI, resultando em uma suspensão de hematócrito a 50%.</li>
	<li>Em uma plataforma de congelamento manual, aplique 2,5 μL de esquizontos no lado de carbono de uma descarga de brilho (Use configurações de unidade de descarga de brilho de 60 s, 30 mA no ar, tratando apenas o lado de carbono da grade) Grade de cobre de malha 200 com um filme de carbono de 2/4 holey e mancha por ~20 s da parte de trás da grade usando papel de filtro de grau 1 com uma borda rasgada. Mergulhe em etano líquido resfriado por nitrogênio líquido e transfira as grades para armazenamento (consulte Tabela de materiais para equipamentos usados neste estudo). NOTA: O experimento pode ser pausado aqui, e as grades podem ser armazenadas sob nitrogênio líquido indefinidamente. CUIDADO: O nitrogênio líquido é um asfixiante e causa congelamento; manusear com cuidado em um ambiente adequado com monitoramento de oxigênio. CUIDADO: O etano líquido causa queimaduras graves e é inflamável; Utilização num exaustor de fumos longe de fontes de ignição. NOTA: Mergulhar esquizontes congelados não são mais viáveis. Isso foi determinado incubando o sangue humano com várias grades de ouro de esquizontes congelados por imersão descongelados e descongelados pelo ar e não observando nenhum crescimento do parasita após vários dias, em comparação com controles não congelados. As grades congeladas de esquizontos são, portanto, seguras para manusear fora das instalações de contenção usando procedimentos normais de segurança e descontaminação (luvas, esterilização de superfícies/ferramentas com etanol >70% e descarte de grades em etanol >70%).</li>
	<li>Grades de tela usando um estágio criogênico para um microscópio de luz, prestando especial atenção ao gradiente de gelo através da grade. Nas áreas mais finas de gelo, verifique os quadrados de grade individuais para cobertura celular. NOTA: Os melhores quadrados devem ter uma célula de espessura no centro do quadrado da grade (Figura 2). Isso garante que uma lamela possa ser fresada no centro do quadrado sem atingir o gelo mais espesso nas bordas contra as barras de grade. O experimento pode ser pausado aqui, e as grades podem ser armazenadas sob nitrogênio líquido indefinidamente. Se as células carregam um marcador fluorescente, as grades também podem ser rastreadas por crioCLEM para localizar posições X/Y de interesse, que podem ser correlacionadas com a localização da grade no crioFIB-MEV para fresagem direta.</li>
</ol>2. Moagem FIB on-grid de células congeladas por imersão
<ol><li>Marque a frente das jantes de grelha automática específicas para crioFIB com uma caneta de marcação preta indelével para indicar o centro da secção de corte e o lado oposto da jante (Figura 3). Configure a estação de recorte e as grades de clipe nos anéis marcados de lado para baixo.</li>
	<li>Carregue grades no vaivém cryoFIB-SEM (normalmente 2 grades, dependendo do vaivém) e aplique uma camada de pulverização de platina em uma atmosfera de argônio (5 x 10-2 mbar) (5 mA para 60 s - a espessura é variável) ou uma camada rotativa de feixe eletrônico de carbono/platina (~4 nm de espessura) na superfície das células. NOTA: Ambos os tipos de revestimentos auxiliam a dispersão da carga durante a obtenção de imagens por MEV. O benefício do revestidor rotativo e-beam é que a espessura exata do revestimento pode ser especificada.</li>
	<li>Coloque o vaivém no microscopia eletrônica de varredura e avalie a distribuição celular em cada grade por MEV a 5 kV (13 pA ou 25 pA). Faça uma visão geral de baixa ampliação (~100x) para observar os gradientes de gelo em toda a grade. Em seguida, tire imagens de maior ampliação (~5.000x) para examinar quadrados de grade individuais e identificar as áreas da grade com características celulares visíveis e baixa contaminação da superfície para moer.</li>
	<li>Aplicar uma camada de organoplatina de >2 μm na superfície de cada grelha utilizando o sistema de injecção de gás (SIG). Para fazer isso, insira a agulha GIS na câmara acima da grade e aqueça a fonte de organoplatina a uma temperatura definida por um tempo definido (por exemplo, ~27 °C por 3-10 s) para produzir um fluxo de vapor. NOTA: O ângulo de aplicação, a temperatura e o tempo do revestimento de organoplatina através da agulha GIS devem ser otimizados para maximizar um revestimento uniforme. Isso dependerá do crioFIB-MEV específico usado (consulte Resultados Representativos para maiores explicações).</li>
	<li>Incline a amostra de modo que o plano da grade seja ~10° do ângulo de incidência do feixe de íons e mova o centro de um quadrado de grade adequado para ser visto nas imagens MEV e FIB.</li>
	<li>Pesquise a grade usando o feixe de íons em baixa corrente (nominalmente 1,5 pA, 30 kV) e vá para uma ampliação alta o suficiente (~7.000x) para visualizar as células no centro de um quadrado de grade. Coloque a amostra em foco na primeira corrente de fresagem (300 pA) e corrija o astigmatismo. Ajuste o brilho e o contraste e, em seguida, marque dois padrões retangulares para moer, um acima e outro abaixo de uma região protegida de 3 μm de espessura, cujo centro é o local desejado da lamela final. Observação : a largura escolhida dos padrões dependerá da topografia da camada de célula circundante e do tamanho da célula. 7-20 μm é uma largura adequada para esquizontes, mas lamelas mais largas levam mais tempo para moer. A altura escolhida dos padrões para a primeira etapa de fresagem depende da espessura da amostra, iniciando em torno de 6 μm; Isso pode precisar ser ajustado durante a fresagem. A fresagem é realizada direcionalmente das bordas externas superior e inferior dos padrões em direção à face da lamela. Isso pode ser feito em paralelo, onde ambos os padrões são fresados simultaneamente ou sequencialmente, primeiro removendo o material de cima da lamela e depois de baixo.</li>
	<li>Iniciar a fresagem na primeira corrente; monitorar o progresso ao vivo na visão do feixe de íons e intermitentemente por MEV (5 kV, 13 ou 25 pA). Verifique se o feixe de íons rompeu a amostra acima e abaixo da região protegida. Caso contrário, aumente a altura dos padrões retangulares para remover mais material. Pare quando a superfície acima e abaixo da lamela estiver completamente lisa na visão do feixe de íons. NOTA: O feixe de íons rompeu a amostra acima e abaixo da região protegida quando o interior dos padrões retangulares não contém características no plano focal. Alguns recursos, como barras de grade, podem estar visíveis fora de foco em segundo plano.</li>
	<li>Mudança para a próxima corrente de fresagem (100 pA); Foco e ajuste o brilho/contraste. Diminua o espaço entre os dois padrões retangulares para 1,5 μm e diminua a altura do padrão para cobrir apenas o material não fresado. Comece a fresar na nova corrente até que a superfície acima e abaixo da lamela esteja completamente lisa.</li>
	<li>Repita este processo passo a passo até atingir uma espessura de 0,3 μm, reduzindo a corrente do feixe de íons a cada vez de acordo com o esquema de moagem da Tabela 1.</li>
	<li>Moer várias lamelas (a quantidade depende da espessura da amostra e do tempo disponível) em uma ou ambas as grades até uma espessura de 0,3 μm, registrar a posição X/Y/Z de cada lamela e reservar ~1-2 h no final da sessão para polir as lamelas até sua espessura final (60-200 nm).</li>
	<li>Faça uma visão geral de MEV de baixa ampliação de toda a grade e planeje uma rota de polimento partindo de lamelas na frente da grade (mais próximas da fonte do feixe de íons) até lamelas na parte de trás da grade (mais distante da fonte do feixe de íons) (Figura 5). NOTA: Isso reduz a reposição de material ablado, de volta à superfície das lamelas polidas.</li>
	<li>Reduza o espaço entre os dois padrões retangulares para 100-200 nm e inicie a etapa final de polimento com uma corrente de feixe de íons de 30 pA. Monitore o progresso por MEV a 2-3 kV (13 pA, permanência = 300 n, 3072 x 2048, ~2 s para um quadro completo) e pare de polir quando o contraste é perdido na lamela por MEV ou quando a camada organoplatina da própria lamela começa a perder integridade.</li>
	<li>Antes de remover as grades, adquira uma imagem SEM de baixa ampliação de toda a grade e salve as imagens de cada lamela. Use-os para cruzar a grade mais tarde no TEM. Pause o experimento aqui e armazene as grades com lamelas sob nitrogênio líquido - manuseie com cuidado. NOTA: As grades podem ser levemente revestidas após a remoção do cryoFIB-SEM, o que pode ajudar a limitar a deriva e a carga no MET em alta ampliação, mas isso deve ser feito com cautela, pois muito revestimento de pulverização pode obscurecer o conteúdo biológico dentro das lamelas. É possível rastrear lamelas para fluorescência nesta fase; no entanto, a obtenção de sinal suficiente dependerá da abundância da proteína marcada dentro da espessura da lamela. Muito cuidado deve ser tomado ao manusear as grades para limitar os danos às lamelas e evitar a contaminação da superfície.</li>
</ol>3. Aquisição da série Tilt e visão geral do processamento de dados
<ol><li>Carregue as grades no MET, alinhando a direção de fresagem perpendicularmente ao eixo de inclinação do estágio. NOTA: O alinhamento das grades é feito a olho nu usando as marcas no aro da grade automática. Uma margem de erro de ~10° é aceitável, caso contrário, as paredes da trincheira de ambos os lados da lamela podem obscurecer a lamela à medida que a grade é inclinada.</li>
	<li>Adquira um mapa de baixa ampliação (~150x) de toda a grade e localize as lamelas; Em seguida, adquira um mapa de ampliação média (~1.500x, dependendo do tamanho da lamela) de cada lamela e localize as áreas de interesse.</li>
	<li>Pré-incline a grade em ±10° para tornar o plano da lamela (não a grade) perpendicular ao eixo óptico NOTA: A direção da pré-inclinação pode ser determinada pela posição da borda frontal das lamelas (procurando a sobra sobre a camada organoplatina) nos mapas de ampliação baixa e média. Para o MET usado aqui, as grades exigem uma pré-inclinação de +10° se as bordas frontais das lamelas apontarem para cima nos mapas e requerem uma pré-inclinação de -10° se apontarem para baixo. Cada grade pode ser diferente devido à forma como foram pegas e inseridas no carregador automático.</li>
	<li>Adquira a série de inclinação simétrica de dose38 (por exemplo, -54° a +54° com um incremento de 3-5°) em um tamanho de pixel que permita o campo de visão e a resolução necessários para a região de interesse. Use um intervalo de valores de desfocagem entre -2 e -5 μm. Colete filmes com 3-10 quadros em cada incremento e, para isso, ajuste esses parâmetros dependendo do tamanho do pixel para acumular uma dose total de ~150 e-/Å2 (para um MET de 300 kV). NOTA: Rachaduras na lamela devem ser evitadas, pois essas regiões podem se afastar. A contaminação da superfície também deve ser evitada, pois pode obscurecer a região de interesse ou a área de foco em alta inclinação.</li>
	<li>Corrija o movimento dos filmes usando um programa como o MotionCor239. Aplicar um filtro de ponderação de dose às imagens corrigidas (e-/imagem acumulada)40 e estimar o desfoco de cada imagem usando um programa como o CTFFIND441.</li>
	<li>Use o alinhamento fiducial-less (patch tracking) em um programa como o etomo (IMOD)42 para calcular o alinhamento e a relação angular das imagens em tilt-series.</li>
	<li>Insira as informações de alinhamento e rotação, juntamente com os valores de desfocagem em um programa que pode aplicar a correção de CTF tridimensional, por exemplo, NovaCTF43. Calcule um tomograma corrigido para obter tomogramas de saída com fatores de ligação relevantes para a análise a jusante.</li>
	<li>Analise as reconstruções e prepare-se para qualquer processamento downstream, por exemplo, filtragem, segmentação ou média de subtomograma.</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Embora a fresagem crioFIB esteja se tornando mais rotineira, a preparação de amostras ideais para moagem não; portanto, a maioria das etapas críticas deste protocolo ocorre antes que a amostra atinja o crioFIB-MEV. A otimização da amostra por várias rodadas de preparação celular, congelamento por imersão e triagem por microscopia de luz e eletrônica são necessárias para produzir a melhor amostra possível antes que a moagem seja tentada. Ter a melhor amostra possível não só aumenta as chances de sucesso, mas também otimiza o uso do equipamento. Por esta razão, a maioria das instalações nacionais exige evidências de que foi realizada otimização suficiente antes de conceder tempo em suas máquinas. Uma vez dentro do cryoFIB-SEM, maximizar a eficácia do revestimento de organoplatina é fundamental para produzir lamelas uniformemente finas. Finalmente, paciência e bom manuseio de amostras é uma habilidade pré-requisito do usuário, que será obrigado a sentar por vários dias produzindo e depois transferindo grades contendo lamelas delicadas. Isso pode mudar com a introdução de estratégias de fresagem automatizada47,48, mas, até o momento, todo o processo de fresagem ainda é em grande parte manual na maioria das instalações.
Enquanto o trabalho se concentrou apenas em esquizontos de P. falciparum , o método aqui apresentado pode ser facilmente modificado para otimizar a preparação da grade e a moagem para outros tipos celulares. Fatores importantes a serem considerados são a densidade das células que estão sendo aplicadas à grade, o tipo de grade (o cobre é tóxico para algumas células), o tamanho e o espaçamento dos furos no filme de carbono, o tempo de blotting e o método de blotting (face simples/dupla, manual ou automatizado). Além disso, se as células estão sendo cultivadas nas grades (geralmente grades de ouro com um filme de carbono holey), a confluência pode ser verificada por microscopia de luz antes de manchar e congelar. A estratégia de moagem depende de como as células são depositadas na grade. Para os glóbulos vermelhos infectados pela malária, a grade é essencialmente revestida por uma camada ininterrupta de células, mais espessa em algumas áreas e mais fina em outras. A fresagem é realizada em vários pontos em uma região ao longo desse gradiente, onde a espessura do gelo gera lamelas de tamanho adequado para a tomografia. Essa abordagem funciona bem para células menores, pois você pode produzir lamelas contendo uma fatia através de várias células. Para células maiores ou aglomerados de células, pode ser o caso de uma célula ou aglomerado de células produzir uma lamela.
O manuseio da grade e a transferência de amostras continuam sendo um dos principais desafios desse fluxo de trabalho. Lamelas podem ser perdidas devido a quebras ou rachaduras, artefatos de cortina obscurecendo a biologia, contaminação superficial excessiva, bem como problemas de orientação da grade dentro do MET, exigindo uma etapa extra de manuseio para reposicionar a grade. O grau de perdas varia de dia para dia e de grade para rede, mas é melhorado através da prática e experiência de manuseio ao longo do tempo. Neste estudo, verificou-se que as grades podem ser cuidadosamente reorientadas no carregador automático várias vezes sem destruir lamelas e isso às vezes tem o benefício de lavar o gelo da superfície. Outra limitação principal desse fluxo de trabalho é o tempo necessário para produzir lamelas. Como a produção é lenta, é fundamental ter uma amostra devidamente otimizada, tornando a moagem o mais eficiente possível.
Uma série de adaptações à moagem FIB de amostras biológicas vítreas tem sido recentemente introduzida. Um divisor de águas é a implementação de ferramentas de elevação resfriadas criogenicamente dentro da câmara crioFIB-SEM que permitem que blocos maiores de material sejam fresados a partir de amostras congeladas de alta pressão. Os blocos podem ser fixados a uma haste metálica ou apanhados em uma garra e movidos para uma segunda posição de amostra, contendo uma grade EM especialmente modificada. Os blocos podem então ser revestidos com organoplatina e moídos para gerar lamelas. A capacidade de moer lamelas a partir de material congelado de alta pressão significa que células e tecidos muito maiores podem ser processados, visando especificamente áreas por microscopia de fluorescência correlativa12. Outras adaptações recentes ao método de moagem FIB incluem a redução de artefatos de cortina por pré-moagem em cunha da amostra16, criofixação microfluídica49 e foto-micropadronização de grades de microscopia eletrônica para melhorar a distribuição celular50. Além disso, foi demonstrado que as lacunas de microexpansão de fresagem de ambos os lados de uma lamela podem aliviar a compressão pela amostra circundante à medida que ela atinge sua finura final51. Isso pode ser particularmente útil ao fresar camadas contínuas de células, como a amostra deste estudo, onde a flexão das lamelas às vezes é vista durante a etapa final de polimento.
O futuro da microscopia eletrônica provavelmente será a determinação de estruturas moleculares in situ pela média do subtomograma e a moagem por FIB é uma importante ferramenta que facilitará a produção de amostras biológicas vítreas para esses tipos de fluxos de trabalho. Embora a moagem FIB ainda esteja em sua infância para aplicações biológicas, o desenvolvimento de métodos está acontecendo em um ritmo acelerado graças ao trabalho árduo de pesquisadores, tanto acadêmicos quanto em instalações nacionais, além do investimento comercial no desenvolvimento da tecnologia cryoFIB-SEM para apoiar a pesquisa.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated from:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University
to:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
M. Alejandra Carbajal1 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Somente o conteúdo celular de amostras biológicas com <500 nm de espessura pode ser obtido efetivamente por microscopia eletrônica de transmissão (MET) em temperaturas criogênicas, limitando a gama de espécimes a vírus, procariontes, organismos unicelulares simples e regiões mais finas de células eucarióticasmaiores1. A fresagem por feixe de íons focalizado na grade (FIB) permite que amostras biológicas congeladas por imersão mais espessas sejam desbastadas para lamelas transparentes de elétrons a temperaturas criogênicas (< -150 °C). As lamelas resultantes são então transferidas para um MET para visualização e coleta de dados tomográficos, permitindo reconstruções 3D de alta resolução das características celulares e moleculares dentro das células (para revisões ver Rigort et al., 20122, Oikonomou et al., 20163 e Wagner et al., 20204).
A moagem FIB surgiu no campo das ciências dos materiais, onde as amostras são rotineiramente desbastadas para prepará-las para análise a jusante5. É realizado em um microscópio eletrônico de varredura (MEV), que possui duas colunas ópticas: óptica convencional de varredura eletrônica e uma segunda coluna contendo óptica capaz de gerar e controlar finamente um feixe de íons focalizados (FIB) - chamado de FIB-SEM. Isso permite que uma região específica da amostra seja ablidada por íons gerados por uma fonte de gálio, removendo o excesso de material e deixando para trás uma lamela6. O processo de moagem é guiado por imagens por MEV da topografia da amostra, que é usada para localizar regiões de interesse e monitorar o progresso da moagem. Para aplicações biológicas, a configuração básica é basicamente a mesma, mas a moagem é realizada em temperaturas criogênicas. Isso exigiu que os FIB-SEMs padrão fossem adaptados para ter estágios crio-resfriados que mantêm temperaturas constantes e baixas taxas de contaminação da superfície, bem como bloqueios de ar para facilitar a transferência de amostras sem desvirtuamento ou contaminação. Os ônibus espaciais de amostra também foram modificados para permitir que uma variedade de diferentes suportes sejam montados dentro do cryoFIB-SEM, incluindo grades TEM, planchettes e capilares. Vários grupos-chave de pesquisadores têm sido centrais para o desenvolvimento desses métodos e para os contínuos avanços tecnológicos nessa área7,8,9,10,11,12. Soluções comerciais estão agora mais amplamente disponíveis para moagem biológica de FIB em temperatura criogênica e a moagem on-grid de lamelas está se tornando mais rotineira, dada uma amostra otimizada.
Uma gama de técnicas de temperatura ambiente e crioEM pode ser usada para visualizar informações celulares em todas as escalas de vida, desde organismos multicelulares inteiros em resolução modesta até a compreensão do contexto de processos complexos no nível celular e, em detalhes ainda maiores, até a determinação de in situ estruturas moleculares13,14,15,16,17,18,19. As técnicas clássicas de temperatura ambiente incluem a seccionação de células e tecidos fixos e corados, embutidos em resina por ultramicrotomia para análise da morfologia celular por TEM (para revisão ver Studer et al., 200820). Técnicas alternativas têm sido desenvolvidas explorando o espalhamento secundário de elétrons por MEV para obter imagens da superfície de blocos de células preservadas, antes de remover progressivamente o material com uma faca (serial block face imaging) ou um feixe de íons focalizado21,22,23. Esta técnica também foi implementada com sucesso em temperaturas criogênicas (conhecidas como imagens criovolume) com uma crioFIB-MEV em blocos vítreos e não corados de células ou tecidos24. Alternativamente, lamelas mais espessas (~15 μm de espessura) podem ser fresadas e estudadas por imagens STEM25. Usando essas técnicas, blocos inteiros contendo muitas células podem ser fotografados para coletar informações populacionais ou um órgão/organismo inteiro pode ser fotografado e reconstruído em 3D. No entanto, para acessar informações moleculares de alta resolução das células, as amostras precisam ser preservadas em um estado quase nativo, congelado-hidratado e, portanto, precisam ser preparadas sob condições criogênicas. A microscopia crioeletrônica de seções vítreas (CEMOVIS) é uma técnica pela qual blocos congelados de alta pressão de material biológico são seccionados sob condições criogênicas com um ultramicrótomo. Isso produz fitas de crioseções (40-100 nm de espessura)26, que são anexados a uma grade EM e fotografados no MET. No entanto, a interação física da faca com a amostra vítrea causa artefatos de fenda e compressão que podem distorcer severamente a estrutura celular27,28,29,30. Seções mais grossas são mais propensas a esses artefatos, tornando impraticável o uso de seções mais grossas do que ~70 nm26. Essa limitação restringe muito a visão 3D da estrutura biológica no tomograma. A moagem FIB em temperaturas criogênicas não experimenta esses problemas, mas tem seus próprios artefatos causados por taxas de moagem diferenciais em partes do corpo-de-prova, levando a espessuras variáveis dentro de uma lamela - chamada de cortina. Esse problema é amenizado pela aplicação de uma camada de organoplatina aplicada através de um sistema de injeção de gás (SIG), que protege a borda frontal da lamela durante a fresagem31. O limite superior da espessura da amostra para a fresagem FIB na grade é definido pela capacidade de mergulhar, congelar o corpo de prova, mantendo-o vítreo32, embora, com a introdução de técnicas de cryo lift-out e transportadores de amostras adaptados para amostras biológicas, a moagem FIB também possa ser usada para processar amostras congeladas de alta pressão31,33,34,35. Além disso, as amostras congeladas de imersão não podem ser muito finas, pois deve haver material biológico suficiente para gerar uma lamela de tamanho razoável que forneça área de superfície suficiente para coletar séries de inclinação na ampliação necessária. Esse problema pode ser amenizado pela moagem de aglomerados de células menores, como bactérias ou leveduras. A espessura final da lamela (~100-300 nm) é geralmente ditada pela integridade da amostra e pela estratégia de fresagem. Lamelas mais finas são melhores para trabalhos estruturais de alta resolução, como a média do subtomograma, mas lamelas mais espessas contêm volumes celulares muito maiores do que podem ser alcançados pelo CEMOVIS, fornecendo mais contexto celular em uma amostra próxima à nativamente preservada. A moagem FIB também pode ser usada para finar cristais de proteína congelados por imersão para estudos de difração de elétrons36.
A moagem FIB de células vítreas vale a pena o tempo e o esforço para realizar se a questão científica exigir detalhes moleculares de alta resolução de espécimes quase nativos in situ. Com acesso a mais instalações para a produção rotineira de lamelas, a etapa de limitação da taxa é muitas vezes a otimização da amostra antes da moagem, onde o tempo deve ser tomado para garantir que a amostra seja vítrea e uma espessura apropriada para produzir lamelas robustas e uniformemente finas. Descreve-se aqui a otimização da amostra para hemácias humanas congeladas com FIB infectadas com parasitas do Plasmodium falciparum , o agente causador da malária, mas essa abordagem poderia ser adaptada para qualquer amostra.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>c-clips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Direct quote from Thermo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>Sub-angstrom</td>
			<td>CSA-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound 2</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-FIB specific autogrid rims</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1205101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E64</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emitech K100X glow discharge unit</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12633012</td>
			<td>Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>350864X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11562203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Sub-angstrom</td>
			<td>PB</td>
			<td>For clipped grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>For clipped grids - direct quote from Thermo Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Home-made manual plunge freezing rig</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human blood</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>UK National Blood and Transplant service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>n/a</td>
			<td>FIB-SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td>sputter coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE900</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td>e-beam rotary coater. In a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linkam cryo-stage for light microscope</td>
			<td>Linkam</td>
			<td>Model No. CMS196</td>
			<td>Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse E200 light microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C17nCuH2-01</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C17nCu20-01</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum PP3010 prep-chamber</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>n/a</td>
			<td>sputter coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage.</td>
			<td>FEI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>FIB-SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen</td>
			<td>Viking Direct</td>
			<td>ND538522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFS Titan Krios 300 kV TEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>TEM equipped with a K2 or K3 camera.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatmann grade 1 filter paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA1001150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Scope A1 light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td>with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography

Apresenta-se aqui um protocolo para o preparo de crio-lamelas a partir de grades congeladas por imersão de eritrócitos humanos infectados por Plasmodium falciparum, que poderia ser facilmente adaptado para outras amostras biológicas. Os princípios básicos para a preparação de amostras, moagem e visualização de lamelas são comuns a todos os instrumentos e o protocolo pode ser seguido como um guia geral para a preparação de crio-lamelas em grade para microscopia crioeletrônica (cryoEM) e tomografia crioeletrônica (cryoET). As grades de microscopia eletrônica que suportam as células são congeladas em etano líquido resfriado por nitrogênio líquido usando um freezer de imersão manual ou automatizado e, em seguida, rastreadas em um microscópio de luz equipado com um estágio criográfico. Grades congeladas são transferidas para um microscópio eletrônico de criovarredura equipado com um feixe de íons focalizado (cryoFIB-SEM). As grades são rotineiramente revestidas com pulverização antes da fresagem, o que ajuda na dispersão do acúmulo de carga durante a fresagem. Alternativamente, um revestidor rotativo de feixe eletrônico pode ser usado para aplicar uma camada de carbono-platina às grades, cuja espessura exata pode ser controlada com mais precisão. Uma vez dentro do cryoFIB-SEM, um revestimento adicional de um composto organoplatina é aplicado à superfície da rede através de um sistema de injeção de gás (GIS). Esta camada protege a borda frontal da lamela à medida que é fresada, cuja integridade é crítica para alcançar lamelas uniformemente finas. As regiões de interesse são identificadas via MEV e a fresagem é realizada de forma escalonada, reduzindo a corrente do feixe de íons à medida que a lamela atinge a transparência eletrônica, a fim de evitar a geração excessiva de calor. Uma grade com múltiplas lamelas é então transferida para um microscópio eletrônico de transmissão (MET) sob condições criogênicas para aquisição em série tilt. Um fluxo de trabalho robusto e livre de contaminação para a preparação de lamelas é uma etapa essencial para técnicas a jusante, incluindo crioEM celular, crioET e média de subtomograma. O desenvolvimento dessas técnicas, especialmente para levantamento e fresagem de amostras congeladas de alta pressão, é de alta prioridade no campo.

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Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Usando fresagem por feixe de íons focalizado para produzir lamelas vítreas on-grid a partir de amostras biológicas congeladas por imersão para tomografia crio-eletrônica.

Preparação de Lamelas a partir de Amostras Biológicas Vítreas Usando um Microscópio Eletrônico de Varredura de Feixe Duplo para Tomografia Crio-Eletrônica

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Este protocolo descreve a preparação de lamelas vítreas de hemácias infectadas por Plasmodium-falciparum para tomografia crioeletrônica. Isso permite a observação direta de informações estruturais detalhadas sobre como o parasita causa malária. A tomografia crio-eletrônica registra informações de alta resolução sobre o interior das células.É poderoso o suficiente para observar complexos de proteínas individuais in situ, que podem ser extraídos computacionalmente e medidos para revelar informações estruturais tridimensionais sobre proteínas. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para diferentes tipos celulares e pode ser um ponto de partida para alguém novo na produção de lamelas vítreas para tomografia crio-eletrônica. Trata-se de Alejandra Carbajal, que cumprirá o protocolo hoje.Para começar, faça a triagem das grades de cobre congeladas usando um CryoStage para um microscópio de luz com atenção especial ao gradiente de gelo ao longo da grade. Verifique os quadrados de grade individuais para cobertura celular nas áreas mais finas do gelo. Use um marcador preto indelével para marcar a frente e o lado oposto das jantes Autogrid específicas para Cryo-FIB-SEM.Carregue a grade cortada no vaivém Cryo-FIB-SEM com o lado carbono para cima e aplique um revestimento rotativo de feixe eletrônico de carbono ou platina de quatro nanômetros de espessura na superfície das células. Coloque o vaivém no Cryo-FIB-SEM e avalie a distribuição de células em cada rede por MEV a cinco quilovolts. Faça uma visão geral de baixa ampliação com 100 potências para observar os gradientes de gelo em toda a rede.Em seguida, tire imagens de ampliação mais alta com 5.000 de potência para ver os quadrados de grade individuais. Aplique uma camada de organoplatina de dois micrômetros na superfície de cada grade, inserindo a agulha do sistema de injeção de gás na câmara acima da grade e aquecendo a fonte de organoplatina a uma temperatura definida por um tempo determinado para produzir um fluxo de vapor. Para observar a amostra, incline-a de modo que o plano da grade fique a aproximadamente 10 graus do ângulo de incidência do feixe de íons e mova o centro de um quadrado de grade adequado para ser visto nas imagens de MEV e FIB.usando o feixe de íons em baixa corrente, Pesquise a grade em uma ampliação alta para visualizar as células no centro de um quadrado de grade. Marque dois padrões retangulares para moer, um acima e outro abaixo de uma região protegida de três micrômetros de espessura. Em seguida, escolha as configurações do feixe e corrija o astigmatismo ajustando o brilho e o contraste.após a conclusão da instalação, inicie a fresagem a uma corrente de 300 picoamperes enquanto monitora o progresso ao vivo na visão do feixe de íons e intermitentemente por MEV. A amostra é verificada na visualização MEV, e após a primeira fresagem, se o feixe de íons não tiver rompido a amostra acima e abaixo da região protegida, remova mais material aumentando a altura dos padrões retangulares. Pare de fresar quando a superfície acima e abaixo da lamela estiver completamente lisa na visão do feixe de íons.Repita o processo de moagem gradualmente, reduzindo a corrente do feixe de íons a cada vez até atingir uma espessura de 300 nanômetros. Registre a posição X Y Z de cada lamela. Para polir as lamelas no final do experimento, use uma visão geral de MEV de baixa ampliação para selecionar um grupo de lamelas a serem polidas e marcar a raiz de polimento.Uma vez marcada a raiz de polimento, reduza o espaço entre os dois padrões retangulares para 100 a 200 nanômetros e inicie o polimento em uma corrente de feixe de íons de 30 picoamperes. Monitore o progresso por MEV em dois a três quilovolts. Pare de polir quando o contraste na lamela é perdido por MEV ou quando a camada organoplatina ou a própria lamela começa a perder a integridade.Adquira e salve imagens SEM de baixa ampliação de cada lamela. Após a conclusão do experimento, remova o vaivém do microscópio. Retire as grades com lamelas e guarde-as sob nitrogênio líquido.Manuseie as grades com cuidado. Para estudar a morfologia, os esquizontos foram estagnados em diferentes estágios de saída usando o composto dois em inibidores E-64. Na presença do composto dois, o limite entre as membranas parasitóforas e a hemoglobina circundante na hemácia do hospedeiro foi bem definido.O vacúolo parasitóforo intacto, ou PVs, foi embalado com merozoítos em um único aglomerado de cristais de hemozoína. Quando dois esquizontes sincronizados foram lavados em E-64, a membrana PV foi rompida e os merozoítos espalhados dentro da hemácia. Um exemplo típico de boa distribuição celular em uma grade de cobre mostra grandes hemácias com uma periferia bem definida e uma membrana de vacúolo intacta.Dentro de uma hemácia hospedeira parcialmente colapsada, os merozoítos individuais foram visualizados como pequenos aglomerados de células. Cada esquizonto tinha uma mancha preta em seu centro, indicando a posição dos cristais de hemozoína. Após a fresagem, as grades foram carregadas no ETM para identificar as posições das lamelas e encontrar áreas adequadas para serem alvo pela tomografia.Na micrografia da amostra, um eritrócito que havia sido invadido recentemente por um merozoíto pode ser visto. O merozoíto envolto pela membrana derivada da célula hospedeira pôde ser visto dentro do limite da hemácia. Na extremidade apical do merozoíto, as duas membranas que circundam a célula e quatro membranas empilhadas no ápice do merozoíto associadas a uma característica em forma de cogumelo elétron-denso eram claramente visíveis.Dentro do citoplasma do merozoíto, um evento de fusão entre a membrana plasmática do merozoíto e uma vesícula multicamadas foi identificado. Em uma análise adicional de MET de uma lamela de 230 nanômetros de espessura, a morfologia típica de um merozoíto maduro tratado com E-64 foi observada. Dentro da membrana dos glóbulos vermelhos, a membrana plasmática do merozoíto pode ser vista com organelas como o complexo de membrana interna, anéis polares, micronêmicos, rópticas e o envelope nuclear.A parte mais importante desta técnica é a otimização das grades para permitir a produção reprodutível e eficiente de lamelas finas. O desenvolvimento desta técnica permitirá aos pesquisadores visualizar moléculas de proteína única dentro de parasitas da malária e determinar seu papel na saída da malária.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Uso de ressonância paramagnética electrónica em amostras biológicas em temperatura ambiente e 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Bioquímica

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Preparação rápida da grade para microscopia crio-elétron resolvida pelo tempo

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparação e micromaquinção Crio-FIB de Saccharomyces cerevisiae para Tomografia Crio-Elétron

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Microscopia crio-elétron de partículas únicas: da amostra à estrutura

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning Transmissão Electron Microscopy Grids para Posicionamento Direto celular dentro de fluxos de trabalho de tomografia crio-elétron inteira

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Um fluxo de trabalho robusto de crio-elétron de partículas únicas (crio-EM) com cryoSPARC, RELION e Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Preparação de Partículas Nucleares Complexadas com Fatores de Reparo de DNA para Determinação Estrutural por Microscopia Crio-Eletrônica

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Extração de Microtúbulos Modificados de Células de Mamíferos para Estudo de Complexos Microtúbulo-Proteína por Microscopia Crio-Eletrônica

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Aplicação do Grafeno Monocamada em Grades de Microscopia Crio-Eletrônica para Determinação de Estruturas de Alta Resolução

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...