Name: preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography
Uploaded: 2021-08-05T13:30:00
Duration: 7 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Это исследование полностью или частично финансировалось Wellcome Trust (212916/Z/18/Z). В целях открытого доступа автор применил публичную лицензию CC BY об авторском праве к любой версии рукописи, принятой автором, вытекающей из этого представления.
Этот проект, для которого был разработан этот метод, финансировался за счет гранта Совета по медицинским исследованиям MR / P010288 / 1, присужденного Хелен Р. Сайбил, Роланду А. Флеку и Майклу Дж. Культуры P. falciparum были выращены в Институте Фрэнсиса Крика при поддержке членов группы Майкла Блэкмана. Авторы хотели бы поблагодарить доктора Сер Ин (Мишель) Тан за предоставление изображений шизонтов, обработанных соединением 2 и E64, в тонких мазках крови. Большинство ламелей были изготовлены при поддержке сотрудников eBIC, и мы благодарны за доступ к двухлучевому криоFIB-SEM Scios по исследовательскому предложению NT21004. Авторы также выражают признательность за поддержку Программы отраслевых стипендий Королевского общества (INF\R2\202061) в продолжении разработки технологии FIB-фрезерования в рамках CUI. Авторы также хотели бы поблагодарить Хелен Р. Сайбил за полезные дискуссии в связи с этим документом о методах и руководство проектом.

Авторам раскрывать нечего.

В то время как криоFIB-фрезерование становится все более рутинным, подготовка оптимальных образцов для измельчения не имеет; поэтому большинство критических шагов в этом протоколе происходят до того, как образец достигнет криоFIB-SEM. Оптимизация образца с помощью нескольких раундов подготовки клеток, погружного замораживания и скрининга с помощью световой и электронной микроскопии необходимы для получения наилучшего образца перед попыткой измельчения. Наличие наилучшего образца не только увеличивает шансы на успех, но и оптимизирует использование оборудования. По этой причине большинство национальных предприятий требуют доказательств того, что была проведена достаточная оптимизация, прежде чем предоставлять время на их машины. Попав внутрь cryoFIB-SEM, максимизация эффективности платинорганического покрытия имеет решающее значение для получения равномерно тонких ламелей. Наконец, терпение и хорошее обращение с образцами являются обязательным навыком пользователя, который должен будет сидеть в течение нескольких дней, производя, а затем передавая сетки, содержащие тонкие ламели. Это может измениться с внедрением автоматизированных стратегий фрезерования47,48, но пока весь процесс фрезерования по-прежнему в основном выполняется вручную на большинстве предприятий.
В то время как работа была сосредоточена исключительно на P. falciparum schizonts, представленный здесь метод может быть легко модифицирован для оптимизации подготовки сетки и измельчения для других типов клеток. Важными факторами, которые следует учитывать, являются плотность ячеек, наносимых на сетку, тип сетки (медь токсична для некоторых ячеек), размер и расстояние между отверстиями в углеродной пленке, время блоттинга и метод блоттинга (односторонний/двухсторонний, ручной или автоматический). Кроме того, если клетки выращиваются на сетках (обычно золотых сетках с дырявой углеродной пленкой), слияние можно проверить с помощью световой микроскопии перед промоканием и замораживанием. Стратегия фрезерования зависит от того, как ячейки осаждаются на сетке. Для эритроцитов, инфицированных малярией, сетка по существу покрыта непрерывным слоем клеток, более толстым в одних областях и более тонким в других областях. Фрезерование выполняется в нескольких точках в одной области вдоль этого градиента, где толщина льда создает ламели, подходящие по размеру для томографии. Этот подход хорошо работает для небольших клеток, так как вы можете производить ламели, содержащие срез через несколько клеток. Для более крупных клеток или скоплений клеток может случиться так, что одна клетка или клеточный сгусток может продуцировать одну ламель.
Обработка сетки и перенос образцов остаются одной из основных проблем этого рабочего процесса. Ламели могут быть потеряны из-за поломок или трещин, занавесных артефактов, скрывающих биологию, чрезмерного загрязнения поверхности, а также проблем с ориентацией сетки в ПЭМ, что требует дополнительного шага обработки для изменения положения сетки. Степень потерь варьируется изо дня в день и от сети к сети, но со временем она улучшается благодаря практике и опыту обработки. В этом исследовании было обнаружено, что решетки могут быть тщательно переориентированы в автомате заряжания несколько раз, не разрушая ламели, и это иногда имеет преимущество смывания поверхностного льда. Еще одним основным ограничением этого рабочего процесса является время, необходимое для производства ламелей. Поскольку производство идет медленно, очень важно иметь правильно оптимизированный образец, чтобы сделать фрезерование максимально эффективным.
В последнее время был внедрен ряд приспособлений к FIB-фрезерованию биологических образцов стекловидного тела. Переломным моментом является внедрение криогенных охлаждаемых подъемных инструментов в камеру cryoFIB-SEM, которые позволяют измельчать более крупные блоки материала из замороженных образцов под высоким давлением. Блоки могут быть прикреплены к металлическому стержню или взяты в захват и перемещены во второе положение образца, содержащее специально модифицированную ЭМ-сетку. Затем блоки могут быть покрыты платиновой органикой и измельчены для получения ламелей. Способность фрезеровать ламели из замороженного материала под высоким давлением означает, что можно обрабатывать гораздо более крупные клетки и ткани, в частности, нацеливаясь на области с помощью корреляционной флуоресцентной микроскопии12. Другие недавние адаптации к методу FIB-фрезерования включают уменьшение артефактов занавески путем предварительного фрезерования образца16 клином, микрофлюидную криофиксацию49 и фотомикроструктурирование сеток электронной микроскопии для улучшения распределения клеток50. Кроме того, было продемонстрировано, что фрезерование зазоров микрорасширения по обе стороны ламели может облегчить сжатие окружающим образцом, когда он достигает своей окончательной тонкости51. Это может быть особенно полезно при фрезеровании непрерывных слоев ячеек, таких как образец в этом исследовании, где изгиб ламелей иногда наблюдается на заключительном этапе полировки.
Будущее электронной микроскопии, вероятно, будет заключаться в определении молекулярных структур in situ путем субтомограммного усреднения, а FIB-фрезерование является важным инструментом, который облегчит производство биологических образцов стекловидного тела для этих типов рабочих процессов. В то время как FIB-фрезерование все еще находится в зачаточном состоянии для биологических применений, разработка методов происходит быстрыми темпами благодаря напряженной работе исследователей, как академических, так и на национальных объектах, а также коммерческим инвестициям в разработку технологии криоFIB-SEM для поддержки исследований.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated from:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University
to:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
M. Alejandra Carbajal1 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Только клеточное содержимое биологических образцов толщиной <500 нм может быть эффективно визуализировано с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) при криогенных температурах, ограничивая диапазон образцов вирусами, прокариотами, простыми одноклеточными организмами и более тонкими областями более крупных эукариотических клеток1. Фрезерование сфокусированным ионным пучком (FIB) на сетке позволяет разбавлять более толстые замороженные биологические образцы до электронно-прозрачных ламелей при криогенных температурах (< -150 °C). Полученные ламели затем переносятся в ПЭМ для визуализации и сбора томографических данных, что позволяет проводить 3D-реконструкции клеточных и молекулярных особенностей внутри клеток с высоким разрешением (обзоры см. Rigort et al., 20122, Oikonomou et al., 20163 и Wagner et al., 20204).
FIB-фрезерование возникло в области материаловедения, где образцы обычно разбавляются, чтобы подготовить их к последующему анализу5. Он выполняется в сканирующем электронном микроскопе (SEM), который имеет две оптические колонки: обычную оптику сканирующего электронного микроскопа и вторую колонку, содержащую оптику, способную генерировать и точно контролировать сфокусированный ионный пучок (FIB), называемый FIB-SEM. Это позволяет удалить определенную область образца ионами, генерируемыми источником галлия, удаляя лишний материал и оставляя после себя ламель6. Процесс фрезерования управляется СЭМ-визуализацией топографии образца, которая используется для определения интересующих областей и мониторинга хода фрезерования. Для биологических применений базовая установка в основном такая же, но измельчение осуществляется при криогенных температурах. Это потребовало адаптации стандартных FIB-SEM к криоохлаждаемым ступеням, которые поддерживают постоянную температуру и низкий уровень поверхностного загрязнения, а также воздушные шлюзы для облегчения переноса образцов без девитрификации или загрязнения. Челноки для образцов также были модифицированы, чтобы позволить устанавливать ряд различных носителей внутри криоFIB-SEM, включая сетки TEM, планшеты и капилляры. Несколько ключевых групп исследователей сыграли центральную роль в разработке этих методов и продолжающихся технологических достижениях в этой области 7,8,9,10,11,12. В настоящее время более широко доступны коммерческие решения для биологического FIB-фрезерования при криогенной температуре, а сетевое измельчение ламелей становится все более рутинным при получении оптимизированного образца.
Ряд методов комнатной температуры и криоЭМ может быть использован для визуализации клеточной информации на всех уровнях жизни, от целых многоклеточных организмов при скромном разрешении до понимания контекста сложных процессов на клеточном уровне и еще более подробно, до определения in situ Молекулярные структуры13,14,15,16,17,18,19. Классические методы комнатной температуры включают секционирование фиксированных и окрашенных, погруженных в смолу клеток и тканей с помощью ультрамикротомии для анализа клеточной морфологии с помощью ПЭМ (обзор см. в Studer et al., 200820). Были разработаны альтернативные методы, использующие вторичное рассеяние электронов с помощью SEM для визуализации поверхности блоков сохраненных ячеек, прежде чем постепенно удалять материал либо ножом (серийная визуализация лица блока), либо сфокусированным ионным пучком21,22,23. Этот метод также был успешно реализован при криогенных температурах (называемых криообъемной визуализацией) с помощью криоFIB-SEM на стекловидных, неокрашенных блоках клеток или тканей24. В качестве альтернативы, более толстые ламели (толщиной ~ 15 мкм) могут быть фрезерованы и изучены с помощью STEM-визуализации25. Используя эти методы, можно визуализировать целые блоки, содержащие множество клеток, для сбора информации о популяции или весь орган / организм может быть изображен и реконструирован в 3D. Однако для доступа к молекулярной информации с высоким разрешением из клеток образцы должны быть сохранены в почти нативном, замороженно-гидратированном состоянии и, следовательно, должны быть подготовлены в криогенных условиях. Криоэлектронная микроскопия срезов стекловидного тела (CEMOVIS) - это метод, при котором замороженные блоки биологического материала под высоким давлением разрезаются в криогенных условиях с помощью ультрамикротома. При этом получаются ленты криосекций (толщиной 40-100 нм)26, которые прикреплены к ЭМ-сетке и отображены в ПЭМ. Однако физическое взаимодействие ножа с образцом стекловидного тела вызывает трещины и артефакты сжатия, которые могут сильно исказить клеточную структуру27,28,29,30. Более толстые участки более подвержены этим артефактам, что делает непрактичным использование участков толще ~ 70 нм26. Это ограничение сильно ограничивает 3D-вид биологической структуры на томограмме. FIB-фрезерование при криогенных температурах не испытывает этих проблем, но имеет свои собственные артефакты, вызванные разницей в скорости фрезерования по частям образца, что приводит к переменной толщине внутри ламели - так называемой завесе. Эта проблема смягчается нанесением органоплатинового покрытия, наносимого с помощью системы впрыска газа (GIS), которая защищает переднюю кромку ламели во время фрезерования31. Верхний предел толщины образца для FIB-фрезерования на сетке определяется возможностью погружения, замораживания образца с сохранением его стекловидного тела32, хотя, с внедрением методов криолифтинга и адаптированных носителей образцов для биологических образцов, FIB-фрезерование также может быть использовано для обработки замороженных образцов под высоким давлением31,33,34,35. Кроме того, замороженные образцы не могут быть слишком тонкими, так как должно быть достаточно биологического материала для создания ламели разумного размера, которая обеспечит достаточную площадь поверхности для сбора наклонных серий при требуемом увеличении. Эту проблему можно смягчить, измельчив скопления более мелких клеток, таких как бактерии или дрожжи. Конечная толщина ламели (~100-300 нм) обычно определяется целостностью образца и стратегией фрезерования. Более тонкие ламели лучше подходят для структурных работ с высоким разрешением, таких как усреднение субтомограммы, но более толстые ламели содержат гораздо большие клеточные объемы, чем могут быть достигнуты с помощью CEMOVIS, обеспечивая более клеточный контекст в почти естественно сохранившемся образце. FIB-фрезерование также может быть использовано для разжижения кристаллов белка с погружной заморозкой для исследований дифракции электронов36.
FIB-фрезерование стекловидных клеток стоит потраченного времени и усилий, если научный вопрос требует высокоразрешающей молекулярной детализации околонативных образцов in situ. Имея доступ к большему количеству мощностей для рутинного производства ламелей, этапом, ограничивающим скорость, часто является оптимизация образца перед фрезерованием, где необходимо время, чтобы убедиться, что образец является стекловидным и имеет соответствующую толщину для получения прочных и равномерно тонких ламелей. Здесь описана оптимизация образца для FIB-фрезерования погруженно-замороженных эритроцитов человека, инфицированных паразитами Plasmodium falciparum , возбудителем малярии, но этот подход может быть адаптирован для любого данного образца.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>c-clips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Direct quote from Thermo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>Sub-angstrom</td>
			<td>CSA-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound 2</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-FIB specific autogrid rims</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1205101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E64</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emitech K100X glow discharge unit</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12633012</td>
			<td>Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>350864X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11562203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Sub-angstrom</td>
			<td>PB</td>
			<td>For clipped grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>For clipped grids - direct quote from Thermo Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Home-made manual plunge freezing rig</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human blood</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>UK National Blood and Transplant service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>n/a</td>
			<td>FIB-SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td>sputter coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE900</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td>e-beam rotary coater. In a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linkam cryo-stage for light microscope</td>
			<td>Linkam</td>
			<td>Model No. CMS196</td>
			<td>Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse E200 light microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C17nCuH2-01</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C17nCu20-01</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum PP3010 prep-chamber</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>n/a</td>
			<td>sputter coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage.</td>
			<td>FEI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>FIB-SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen</td>
			<td>Viking Direct</td>
			<td>ND538522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFS Titan Krios 300 kV TEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>TEM equipped with a K2 or K3 camera.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatmann grade 1 filter paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA1001150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Scope A1 light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td>with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography

Здесь представлен протокол приготовления криоламелей из замороженных сеток инфицированных Plasmodium falciparum эритроцитов человека, который может быть легко адаптирован для других биологических образцов. Основные принципы подготовки образцов, фрезерования и просмотра ламелей являются общими для всех приборов, и протокол может быть использован в качестве общего руководства по подготовке криоламелей на сетке для криоэлектронной микроскопии (криоЭМ) и криоэлектронной томографии (криоЭТ). Сетки электронной микроскопии, поддерживающие клетки, погружаются в жидкий этан с охлаждением жидким азотом с помощью ручной или автоматической морозильной камеры, а затем экранируются на световом микроскопе, оснащенном криоступентом. Замороженные сетки переносятся в криосканирующий электронный микроскоп, оснащенный сфокусированным ионным пучком (cryoFIB-SEM). Перед фрезерованием решетки обычно наносятся напылением, что способствует рассеиванию накопления шихты во время фрезерования. В качестве альтернативы можно использовать ротационную машину для нанесения на решетки слоя углерода-платины, точную толщину которого можно более точно контролировать. Попав внутрь криоFIB-SEM, на поверхность решетки с помощью системы впрыска газа (ГИС) наносится дополнительное покрытие из платинового органического соединения. Этот слой защищает передний край ламели при фрезеровании, целостность которого имеет решающее значение для получения равномерно тонких ламелей. Области интереса идентифицируются с помощью SEM, и фрезерование выполняется поэтапно, уменьшая ток ионного пучка по мере того, как ламель достигает электронной прозрачности, чтобы избежать чрезмерного выделения тепла. Затем сетка с несколькими ламелями переносится в просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ) в криогенных условиях для получения наклонных рядов. Надежный и свободный от загрязнений рабочий процесс подготовки ламелей является важным этапом для последующих методов, включая клеточную криоЭМ, криоЭТ и усреднение субтомограммы. Разработка этих методов, особенно для подъема и измельчения замороженных образцов под высоким давлением, имеет первостепенное значение в полевых условиях.

Watch this Scientific Journal Video about Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Использование сфокусированного ионно-лучевого фрезерования для получения стекловидных пластинок на сетке из замороженных биологических образцов для криоэлектронной томографии.

Получение ламелей из биологических образцов стекловидного тела с помощью двухлучевого сканирующего электронного микроскопа для криоэлектронной томографии

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

В этом протоколе описывается подготовка стекловидных пластинок эритроцитов, инфицированных Plasmodium-falciparum, к криоэлектронной томографии. Это позволяет напрямую наблюдать подробную структурную информацию о том, как паразит вызывает малярию. Криоэлектронная томография записывает информацию высокого разрешения о внутренностях клеток.Он достаточно мощный, чтобы наблюдать одиночные белковые комплексы in situ, которые могут быть извлечены и усреднены с помощью вычислений, чтобы выявить трехмерную структурную информацию о белках. Этот протокол может быть легко адаптирован для различных типов клеток и может стать отправной точкой для тех, кто плохо знаком с получением пластинок стекловидного тела для криоэлектронной томографии. Это Алехандра Карбаджал, которая сегодня будет выполнять протокол.Для начала просейте замерзшие медные сетки с помощью CryoStage для светового микроскопа, уделяя особое внимание градиенту льда через сетку. Проверьте отдельные квадраты сетки на покрытие ячеек на более тонких участках льда. Используйте черный несмываемый маркер, чтобы отметить переднюю и противоположную стороны дисков Autogrid для Cryo-FIB-SEM.Загрузите обрезанную сетку в челнок Cryo-FIB-SEM углеродной стороной вверх и нанесите на поверхность ячеек углеродное или платиновое вращающееся покрытие из углерода или платины толщиной четыре нанометра. Загрузите шаттл в Cryo-FIB-SEM и оцените распределение ячеек в каждой сетке с помощью SEM при пяти киловольтах. Сделайте обзор с малым увеличением при 100 мощности, чтобы посмотреть на градиенты льда по всей сетке.Затем сделайте снимки с большим увеличением и мощностью 5 000, чтобы посмотреть на отдельные квадраты сетки. Нанесите двухмикрометровый платинорганический слой на поверхность каждой решетки, вставив иглу системы впрыска газа в камеру над решеткой и нагревая источник органоплатины до заданной температуры в течение заданного времени для получения потока пара. Чтобы наблюдать за образцом, наклоните образец так, чтобы плоскость сетки находилась примерно в 10 градусах от угла падения ионного пучка, и переместите центр подходящего квадрата сетки, который будет виден как на изображениях SEM, так и на изображениях FIB.используя ионный пучок при малом токе, Обследуйте сетку с большим увеличением, чтобы визуализировать ячейки в центре квадрата сетки. Разметьте два прямоугольных узора для фрезерования, один над защищенной областью толщиной три микрометра, а другой под ней. Затем выберите настройки луча и исправьте астигматизм, отрегулировав яркость и контрастность.после завершения настройки начните фрезерование при токе 300 пикоампер, отслеживая прогресс в реальном времени в виде ионного пучка и периодически с помощью SEM. Образец проверяется в виде SEM и после первого фрезерования, если ионный пучок не пробил образец выше и ниже защищенной области, удалите больше материала, увеличив высоту прямоугольных узоров. Прекратите фрезерование, когда поверхность над и под ламелью станет полностью гладкой в виде ионного пучка.Повторяйте процесс фрезерования поэтапно, каждый раз уменьшая ток ионного пучка до тех пор, пока толщина не достигнет 300 нанометров. Запишите положение X Y Z каждой ламели. Чтобы отполировать ламели в конце эксперимента, используйте обзор SEM с малым увеличением, чтобы выбрать группу ламелей для полировки и отметить полировальный корень.После того, как полировальный корень отмечен, уменьшите расстояние между двумя прямоугольными узорами до 100-200 нанометров и начните полировку при токе ионного пучка 30 пикоампер. Следите за прогрессом с помощью SEM при двух-трех киловольтах. Прекратите полировку, когда контраст в ламели теряется с помощью SEM или когда органоплатиновое покрытие или сама ламель начинает терять целостность.Получайте и сохраняйте изображения SEM с малым увеличением каждой ламели. После завершения эксперимента извлеките челнок из микроскопа. Снимите сетки с ламелями и храните их под жидким азотом.Обращайтесь с сетками осторожно. Для изучения морфологии шизонты были остановлены на разных стадиях выхода с использованием второго соединения в ингибиторах E-64. В присутствии второго соединения граница между паразитофорными мембранами и окружающим гемоглобином в эритроците хозяина была четко определена.Интактная паразитофорная вакуоль, или PV, была заполнена мерозоитами в одном кластере кристаллов гемозоина. Когда соединение двух синхронизированных шизонтов было вымыто в E-64, PV-мембрана разорвалась, и мерозоиты распространились внутри эритроцитов. Типичным примером хорошего распределения клеток на медной сетке являются крупные эритроциты с четко очерченной периферией и неповрежденной мембраной вакуоли.В частично разрушенных эритроцитах-хозяевах отдельные мерозоиты визуализировались в виде небольших клеточных кластеров. Каждый шизонт имел черное пятно в центре, указывающее на положение кристаллов гемозоина. После фрезерования сетки загружались в ПЭМ, чтобы определить положение ламелей и найти подходящие области для нацеливания с помощью томографии.На микрофотографии образца можно увидеть эритроцит, который недавно был захвачен мерозоитом. Мерозоит, окруженный мембраной, полученной из клетки-хозяина, можно было увидеть в пределах границ эритроцитов. На апикальном конце мерозоита были хорошо видны две мембраны, окружающие клетку, и четыре мембраны, уложенные на вершине мерозоита, связанные с электронно-плотным грибовидным элементом.В цитоплазме мерозоита было идентифицировано событие слияния между плазматической мембраной мерозоита и многослойной везикулой. В дополнительном ПЭМ-анализе ламели толщиной 230 нанометров наблюдалась типичная морфология зрелого мерозоита, обработанного Е-64. В мембране эритроцитов плазматическую мембрану мерозоита можно увидеть с органеллами, такими как комплекс внутренней мембраны, полярные кольца, микронемы, роптри и ядерная оболочка.Наиболее важной частью этого метода является оптимизация сеток для обеспечения воспроизводимого и эффективного производства тонких ламелей. Дальнейшее развитие этого метода позволит исследователям визуализировать молекулы одного белка в малярийных паразитах и определить их роль в выходе малярии.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Использование электронного парамагнитного резонанса в биологических образцах при окружающей температуре и 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Быстрая подготовка сетки для криоэлектроно-микроскопии с временным разрешением

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Подготовка и крио-FIB микрообработка Saccharomyces cerevisiae для криоэлектронной томографии

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Криоэлектронная микроскопия с одной частицей: от образца к структуре

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Микроструктурирование просвечивающих электронных микроскопических сеток для прямого позиционирования клеток в рабочих процессах криоэлектронной томографии цельноклеточной криоэлектронной томографии

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Надежный рабочий процесс обработки криоэлектронной микроскопии с одной частицей (крио-ЭМ) с криоСПАРК, RELION и Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Получение частиц ядра нуклеосом в комплексе с факторами репарации ДНК для определения структуры криоэлектронной микроскопии

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Извлечение модифицированных микротрубочек из клеток млекопитающих для изучения микротрубочек-белковых комплексов методом криоэлектронной микроскопии

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Применение монослойного графена в решетках криоэлектронной микроскопии для определения структуры с высоким разрешением

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...