Name: preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography
Uploaded: 2021-08-05T13:30:00
Duration: 7 min
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Esta investigación fue financiada en su totalidad, o en parte, por el Wellcome Trust (212916/Z/18/Z). Con el propósito de acceso abierto, el autor ha aplicado una licencia de derechos de autor pública CC BY a cualquier versión del manuscrito aceptado por el autor que surja de esta presentación.
Este proyecto para el cual se desarrolló este método fue financiado por una subvención del Consejo de Investigación Médica MR / P010288 / 1 otorgada a Helen R. Saibil, Roland A. Fleck y Michael J. Blackman. Los cultivos de P. falciparum se cultivaron en el Instituto Francis Crick, con el apoyo de miembros del grupo de Michael J. Blackman. Los autores desean agradecer al Dr. Ser Ying (Michele) Tan por proporcionar las imágenes de los esquizontes tratados con compuestos 2 y E64 en frotis de sangre delgada. La mayoría de las laminillas se produjeron con el apoyo del personal de eBIC y estamos agradecidos por el acceso a la crioFIB-SEM de doble haz Scios en la propuesta de investigación NT21004. Los autores también reconocen el apoyo del programa Royal Society Industry Fellowship (INF \ R2 \ 202061) para continuar el desarrollo de la técnica de fresado FIB dentro del CUI. Los autores también desean agradecer a Helen R. Saibil por las útiles discusiones en relación con este documento de métodos y la supervisión del proyecto.

La sangre humana se obtuvo de donantes anónimos a través del Servicio Nacional de Sangre y Trasplante del Reino Unido y se utiliza dentro de las 2 semanas posteriores a la recepción. No se requiere aprobación ética para su uso.
1. Preparación y congelación por inmersión de glóbulos rojos infectados con Plasmodium falciparum
<ol><li>Aislar esquizontes maduros por centrifugación (1.580 x g) sobre un medio de gradiente de densidad isotónica al 70% (v/v) (para procedimientos estándar sobre cómo cultivar estadios sanguíneos asexuales de 3D7 Plasmodium falciparum en eritrocitos humanos ver Blackman M.J., 199537).</li>
	<li>Fijar las películas de sangre fina secadas al aire en un portaobjetos de vidrio con metanol al 100% para comprobar la homogeneidad morfológica de los esquizontes antes de teñir con tinción de Giemsa al 10% en tampón fosfato de 6,7 mM, pH 7,1. NOTA: Para enriquecer la preparación para esquizontes estancados en puntos específicos de salida, los esquizontes pueden sincronizarse aún más con los inhibidores compuestos 2 y E64 (ver Resultados representativos y Figura 1 para una explicación del efecto de estos inhibidores). PRECAUCIÓN: Plasmodium falciparum es un patógeno humano y solo debe manipularse en una instalación de contención adecuada siguiendo las pautas locales de salud y seguridad.</li>
	<li>Centrifugar suavemente los esquizontes (240 x g) para granularlos y resuspender en 2x volumen el pellet celular del medio RPMI, lo que resulta en una suspensión de hematocrito al 50%.</li>
	<li>En una plataforma de congelación por inmersión manual, aplique 2.5 μL de esquizontes al lado de carbono de una rejilla de cobre de malla incandescente (use configuraciones de unidad de descarga incandescente de 60 s, 30 mA en el aire, tratando solo el lado de carbono de la rejilla) Rejilla de cobre de malla 200 con una película de carbono de 2/4 agujereada y borre para ~ 20 s desde la parte posterior de la rejilla usando papel de filtro de grado 1 con un borde rasgado. Sumérjase en el etano líquido refrigerado por nitrógeno líquido y transfiera las rejillas al almacenamiento (consulte la Tabla de materiales para conocer el equipo utilizado en este estudio). NOTA: El experimento se puede pausar aquí, y las rejillas se pueden almacenar bajo nitrógeno líquido indefinidamente. PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido es un asfixiante y causa congelación; Manejar con cuidado en un ambiente adecuado con monitoreo de oxígeno. PRECAUCIÓN: El etano líquido causa quemaduras graves y es inflamable; Úselo en una campana extractora lejos de fuentes de ignición. NOTA: Los esquizontes congelados de inmersión ya no son viables. Esto se determinó incubando sangre humana con varias rejillas doradas de esquizontes congelados por inmersión descongelados por aire y no observando el crecimiento de parásitos después de varios días, en comparación con los controles no congelados. Por lo tanto, las rejillas congeladas de esquizontes son seguras de manejar fuera de las instalaciones de contención utilizando procedimientos normales de seguridad y descontaminación (guantes, esterilización de superficies/herramientas con etanol >70% y eliminación de rejillas en etanol >70%).</li>
	<li>Rejillas de cribado utilizando una etapa criogénica para un microscopio óptico, prestando especial atención al gradiente de hielo a través de la rejilla. En las áreas más delgadas de hielo, verifique los cuadrados de cuadrícula individuales para la cobertura de la celda. NOTA: Los mejores cuadrados deben tener una celda de espesor en el centro del cuadrado de cuadrícula (Figura 2). Esto asegura que una lámina se pueda fresar a través del centro del cuadrado sin golpear el hielo más grueso en los bordes contra las barras de rejilla. El experimento se puede pausar aquí, y las rejillas se pueden almacenar bajo nitrógeno líquido indefinidamente. Si las células llevan un marcador fluorescente, las rejillas también pueden ser examinadas por cryoCLEM para localizar posiciones de interés X / Y, que se pueden correlacionar con ubicaciones de rejilla en el crioFIB-SEM para dirigir el fresado.</li>
</ol>2. Fresado FIB en red de células congeladas por inmersión
<ol><li>Marque la parte frontal de las llantas de autorejilla específicas de crioFIB con un rotulador indeleble negro para indicar el centro de la sección de corte y el lado opuesto de la llanta (Figura 3). Configure la estación de recorte y las rejillas de clip en los anillos marcados con el lado de carbono hacia abajo.</li>
	<li>Cargue las rejillas en la lanzadera cryoFIB-SEM (típicamente 2 rejillas, dependiendo de la lanzadera) con el lado del carbono hacia arriba y aplique una capa de pulverización catódica de platino en una atmósfera de argón (5 x 10-2 mbar) (5 mA durante 60 s - el espesor es variable) o una capa rotativa de haz electrónico de carbono / platino (~ 4 nm de espesor) a la superficie de las celdas. NOTA: Ambos tipos de recubrimientos ayudan a la dispersión de la carga durante las imágenes SEM. El beneficio del recubridor rotativo de viga electrónica es que se puede especificar el grosor exacto del recubrimiento.</li>
	<li>Cargue la lanzadera en el crioFIB-SEM y evalúe la distribución celular en cada red mediante SEM a 5 kV (13 pA o 25 pA). Tome una visión general de bajo aumento (~ 100x) para ver los gradientes de hielo en la cuadrícula. Luego, tome imágenes de mayor aumento (~ 5,000x) para mirar los cuadrados de la cuadrícula individuales e identificar las áreas de la cuadrícula con características celulares visibles y baja contaminación superficial para moler.</li>
	<li>Aplique una capa organoplatino de >2 μm a la superficie de cada rejilla utilizando el sistema de inyección de gas (GIS). Para hacer esto, inserte la aguja GIS en la cámara sobre la rejilla y caliente la fuente de organoplatino a una temperatura establecida durante un tiempo establecido (por ejemplo, ~ 27 ° C durante 3-10 s) para producir un flujo de vapor. NOTA: El ángulo de aplicación, la temperatura y el tiempo de la capa organoplatino a través de la aguja GIS deben optimizarse para maximizar un recubrimiento uniforme. Esto dependerá de la crioFIB-SEM específica utilizada (ver Resultados representativos para una explicación más detallada).</li>
	<li>Incline la muestra de modo que el plano de la cuadrícula sea ~10° desde el ángulo de incidencia del haz de iones y mueva el centro de un cuadrícula cuadrado adecuado para ser visto en las imágenes SEM y FIB.</li>
	<li>Examine la cuadrícula utilizando el haz de iones a baja corriente (nominalmente 1.5 pA, 30 kV) y vaya a un aumento lo suficientemente alto (~ 7,000x) para visualizar las celdas en el centro de un cuadrado de cuadrícula. Enfocar la muestra a la primera corriente de fresado (300 pA) y corregir el astigmatismo. Ajuste el brillo y el contraste, luego marque dos patrones rectangulares para fresar, uno por encima y otro por debajo de una región protegida de 3 μm de espesor, cuyo centro es la ubicación deseada de la lámina final. NOTA: El ancho elegido de los patrones dependerá de la topografía de la capa de celda circundante y del tamaño de la celda. 7-20 μm es un ancho adecuado para esquizontes, pero las laminillas más anchas tardan más en fresarse. La altura elegida de los patrones para el primer paso de fresado depende del grosor de la muestra, comenzando alrededor de 6 μm; Esto puede necesitar ser ajustado durante el fresado. El fresado se lleva a cabo direccionalmente desde los bordes superior e inferior exterior de los patrones hacia la cara de la lámina. Esto se puede hacer en paralelo, donde ambos patrones se muelen concurrente o secuencialmente, primero eliminando material por encima de la lámina y luego por debajo.</li>
	<li>Comience a fresar a la primera corriente; monitorizar el progreso en directo en la vista del haz de iones y de forma intermitente mediante SEM (5 kV, 13 o 25 pA). Compruebe que el haz de iones ha atravesado la muestra por encima y por debajo de la región protegida. Si no, aumente la altura de los patrones rectangulares para eliminar más material. Deténgase cuando la superficie por encima y por debajo de la lámina esté completamente lisa en la vista del haz de iones. NOTA: El haz de iones ha atravesado la muestra por encima y por debajo de la región protegida cuando el interior de los patrones rectangulares no contiene características en el plano focal. Algunas entidades, como las barras de cuadrícula, pueden ser visibles fuera de foco en segundo plano.</li>
	<li>Cambio a la siguiente corriente de fresado (100 pA); Enfoca y ajusta el brillo/contraste. Disminuya el espacio entre los dos patrones rectangulares a 1,5 μm y disminuya la altura del patrón para cubrir solo el material sin fresar. Comience a fresar a la nueva corriente hasta que la superficie por encima y por debajo de la lámina esté completamente lisa.</li>
	<li>Repita este proceso paso a paso hasta alcanzar un espesor de 0,3 μm, reduciendo la corriente del haz de iones cada vez de acuerdo con el esquema de fresado de la Tabla 1.</li>
	<li>Moler varias laminillas (la cantidad depende del espesor de la muestra y del tiempo disponible) en una o ambas rejillas hasta un espesor de 0,3 μm, registrar la posición X/Y/Z de cada lámina y reservar ~1-2 h al final de la sesión para pulir las laminillas hasta su espesor final (60-200 nm).</li>
	<li>Tome una visión general SEM de bajo aumento de toda la cuadrícula y planifique una ruta de pulido comenzando desde las laminillas en la parte frontal de la cuadrícula (más cerca de la fuente del haz de iones) hasta las laminillas en la parte posterior de la rejilla (más alejadas de la fuente del haz de iones) (Figura 5). NOTA: Esto reduce la redeposición del material ablacionado de nuevo en la superficie de las laminillas pulidas.</li>
	<li>Reduzca el espacio entre los dos patrones rectangulares a 100-200 nm y comience el paso final de pulido a una corriente de haz de iones de 30 pA. Monitoree el progreso por SEM a 2-3 kV (13 pA, permanencia = 300 n, 3072 x 2048, ~ 2 s para un fotograma completo) y detenga el pulido cuando el contraste se pierde en la lámina por SEM o cuando la capa organoplatino de la lámina comienza a perder integridad.</li>
	<li>Antes de quitar las rejillas, adquiera una imagen SEM de bajo aumento de toda la cuadrícula y guarde las imágenes de cada lámina. Utilícelos para verificar la cuadrícula más adelante en el TEM. Haga una pausa en el experimento aquí y almacene las rejillas con laminillas bajo nitrógeno líquido, manéjelas con cuidado. NOTA: Las rejillas pueden estar ligeramente recubiertas por pulverización catódica al retirarlas del crioFIB-SEM, lo que puede ayudar a limitar la deriva y la carga en el TEM a gran aumento, pero esto debe hacerse con precaución ya que demasiado recubrimiento por pulverización catódica puede oscurecer el contenido biológico dentro de las láminas. Es posible examinar las laminillas para detectar fluorescencia en esta etapa; Sin embargo, obtener suficiente señal dependerá de la abundancia de la proteína marcada dentro del grosor de la lámina. Se debe tener mucho cuidado al manipular las rejillas para limitar el daño a las láminas y evitar la contaminación de la superficie.</li>
</ol>3. Adquisición de la serie Tilt y visión general del procesamiento de datos
<ol><li>Cargue las rejillas en el TEM, alineando la dirección de fresado perpendicular al eje de inclinación del plato. NOTA: La alineación de las rejillas se realiza a simple vista utilizando las marcas en el borde de la rejilla automática. Un margen de error de ~ 10 ° es aceptable, de lo contrario, las paredes de la zanja a ambos lados de la lámina pueden oscurecer la lámina a medida que la rejilla se inclina.</li>
	<li>Adquiera un mapa de bajo aumento (~ 150x) de toda la cuadrícula y localice las laminillas; Luego, adquiera un mapa de aumento medio (~ 1,500x, dependiendo del tamaño de la lámina) de cada lámina y localice las áreas de interés.</li>
	<li>Incline previamente la rejilla ±10° para que el plano de la lámina (no la rejilla) sea perpendicular al eje óptico. NOTA: La dirección de la pre-inclinación se puede determinar por la posición del borde frontal de las láminas (buscando la capa de organoplatino sobrante) en los mapas de aumento bajo y medio. Para el TEM utilizado aquí, las cuadrículas requieren una preinclinación de +10° si los bordes frontales de las laminillas apuntan hacia arriba en los mapas y requieren una preinclinación de -10° si apuntan hacia abajo. Cada rejilla puede ser diferente debido a cómo fueron recogidas e insertadas en el cargador automático.</li>
	<li>Adquiera la serie de inclinación simétrica de dosis38 (por ejemplo, -54° a +54° con un incremento de 3-5°) a un tamaño de píxel que permita tanto el campo de visión como la resolución requeridos para la región de interés. Utilice un rango de valores de desenfoque entre -2 y -5 μm. Recopile películas con 3-10 fotogramas en cada incremento y, para ello, ajuste estos parámetros en función del tamaño del píxel para acumular una dosis total de ~150 e-/Å2 (para un TEM de 300 kV). NOTA: Se deben evitar las grietas en la lámina, ya que estas regiones pueden derivarse. También debe evitarse la contaminación de la superficie, ya que puede oscurecer la región de interés o el área de enfoque en alta inclinación.</li>
	<li>Motion corrige las películas usando un programa como MotionCor239. Aplique un filtro de ponderación de dosis a las imágenes corregidas (e-/imagen acumulada)40 y estime el desenfoque de cada imagen utilizando un programa como CTFFIND441.</li>
	<li>Utilice la alineación sin fiducial (seguimiento de parches) en un programa como etomo (IMOD)42 para calcular la alineación y la relación angular de las imágenes en la serie de inclinación.</li>
	<li>Ingrese la información de alineación y rotación, junto con los valores de desenfoque en un programa que pueda aplicar corrección CTF tridimensional, por ejemplo, NovaCTF43. Calcule una tomografía corregida para obtener tomogramas de salida con factores de agrupación relevantes para el análisis posterior.</li>
	<li>Analice las reconstrucciones y prepárese para cualquier procesamiento posterior, por ejemplo, filtrado, segmentación o promedio de subtogramas.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Mientras que la molienda crioFIB se está volviendo más rutinaria, la preparación de muestras óptimas para la molienda no lo ha hecho; por lo tanto, la mayoría de los pasos críticos en este protocolo ocurren antes de que la muestra llegue al crioFIB-SEM. Se requiere la optimización de la muestra mediante múltiples rondas de preparación celular, congelación por inmersión y cribado por microscopía óptica y electrónica para producir la mejor muestra posible antes de intentar la molienda. Tener la mejor muestra posible no solo aumenta las posibilidades de éxito sino que también optimiza el uso del equipo. Por esta razón, la mayoría de las instalaciones nacionales requieren evidencia de que se ha llevado a cabo una optimización suficiente antes de otorgar tiempo en sus máquinas. Una vez dentro de la crioFIB-SEM, maximizar la efectividad de la capa organoplatino es fundamental para producir laminillas uniformemente delgadas. Finalmente, la paciencia y el buen manejo de la muestra es una habilidad previa del usuario, que deberá sentarse durante varios días produciendo y luego transfiriendo rejillas que contengan delicadas laminillas. Esto puede cambiar con la introducción de estrategias de fresado automatizado47,48, pero hasta ahora, todo el proceso de fresado sigue siendo en gran medida manual en la mayoría de las instalaciones.
Si bien el trabajo se centró únicamente en los esquizontes de P. falciparum , el método presentado aquí podría modificarse fácilmente para optimizar la preparación de la rejilla y el fresado para otros tipos de células. Los factores importantes a considerar son la densidad de las celdas que se aplican a la rejilla, el tipo de rejilla (el cobre es tóxico para algunas celdas), el tamaño y el espaciado de los orificios en la película de carbono, el tiempo de transferencia y el método de transferencia (de una o dos caras, manual o automatizado). Además, si las células se cultivan en las rejillas (generalmente rejillas doradas con una película de carbono agujereada), la confluencia se puede verificar mediante microscopía óptica antes de secarse y congelarse. La estrategia de fresado depende de cómo se depositan las celdas en la rejilla. Para los glóbulos rojos infectados con malaria, la rejilla está esencialmente recubierta por una capa ininterrumpida de células, más gruesas en algunas áreas y más delgadas en otras. El fresado se lleva a cabo en múltiples puntos en una región a lo largo de este gradiente donde el espesor del hielo genera laminillas que son de un tamaño adecuado para la tomografía. Este enfoque funciona bien para células más pequeñas, ya que puede producir laminillas que contienen un corte a través de múltiples células. Para células más grandes o grupos de células, podría darse el caso de que una célula o grupo de células pueda producir una lámina.
El manejo de la red y la transferencia de muestras siguen siendo uno de los principales desafíos de este flujo de trabajo. Las laminillas pueden perderse debido a roturas o grietas, artefactos de cortina que oscurecen la biología, contaminación excesiva de la superficie, así como problemas de orientación de la rejilla dentro del TEM, lo que requiere un paso de manejo adicional para reposicionar la rejilla. El grado de pérdidas varía de un día a otro y de una red a otra, pero se mejora a través de la práctica y la experiencia de manejo a lo largo del tiempo. En este estudio, se encontró que las rejillas se pueden reorientar cuidadosamente en el cargador automático varias veces sin destruir las laminillas y esto a veces tiene el beneficio de lavar el hielo de la superficie. Otra limitación principal de este flujo de trabajo es el tiempo que lleva producir laminillas. Como la producción es lenta, es fundamental tener una muestra correctamente optimizada, haciendo que la molienda sea lo más eficiente posible.
Recientemente se han introducido varias adaptaciones a la molienda FIB de muestras biológicas vítreas. Un cambio de juego es la implementación de herramientas de elevación enfriadas criogénicamente dentro de la cámara crioFIB-SEM que permiten fresar bloques más grandes de material a partir de muestras congeladas a alta presión. Los bloques pueden fijarse a una varilla de metal o recogerse en una pinza y moverse a una segunda posición de muestra, que contiene una rejilla EM especialmente modificada. Los bloques pueden ser recubiertos con organoplatino y molidos para generar laminillas. La capacidad de fresar laminillas a partir de material congelado a alta presión significa que se pueden procesar células y tejidos mucho más grandes, específicamente dirigidos a áreas mediante microscopía de fluorescencia correlativa12. Otras adaptaciones recientes al método de fresado FIB incluyen la reducción de artefactos de cortina mediante el prefresado en cuña de la muestra16, la criofijación microfluídica49 y el fotomicropatrón de rejillas de microscopía electrónica para mejorar la distribución celular50. Además, se ha demostrado que los huecos de microexpansión de molienda a ambos lados de una lámina pueden aliviar la compresión de la muestra circundante a medida que alcanza su delgadez final51. Esto puede ser particularmente útil cuando se fresan capas celulares continuas, como la muestra en este estudio, donde a veces se observa flexión de laminillas durante el paso final de pulido.
El futuro de la microscopía electrónica probablemente será la determinación de estructuras moleculares in situ mediante el promedio de subtomogramas y el fresado FIB es una herramienta importante que facilitará la producción de muestras biológicas vítreas para este tipo de flujos de trabajo. Si bien la molienda FIB todavía está en su infancia para aplicaciones biológicas, el desarrollo de métodos está ocurriendo a un ritmo rápido gracias al arduo trabajo de los investigadores, tanto académicos como en instalaciones nacionales, además de la inversión comercial en el desarrollo de tecnología crioFIB-SEM para apoyar la investigación.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated from:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University
to:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
M. Alejandra Carbajal1 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Solo el contenido celular de muestras biológicas de <500 nm de espesor puede ser fotografiado de manera efectiva por microscopía electrónica de transmisión (TEM) a temperaturas criogénicas, limitando el rango de especímenes a virus, procariotas, organismos unicelulares simples y regiones más delgadas de células eucariotas más grandes1. El molienda por haz de iones enfocado en la red (FIB) permite que las muestras biológicas congeladas por inmersión más gruesas se adelgazen a láminas transparentes con electrones a temperaturas criogénicas (< -150 °C). Las laminillas resultantes se transfieren a un TEM para la visualización y la recopilación de datos tomográficos, lo que permite reconstrucciones 3D de alta resolución de las características celulares y moleculares dentro de las células (para revisiones, consulte Rigort et al., 20122, Oikonomou et al., 20163, y Wagner et al., 20204).
El fresado FIB surgió del campo de las ciencias de los materiales, donde las muestras se diluyen rutinariamente para prepararlas para el análisis posterior5. Se lleva a cabo en un microscopio electrónico de barrido (SEM), que tiene dos columnas ópticas: óptica de microscopio electrónico de barrido convencional y una segunda columna que contiene óptica capaz de generar y controlar finamente un haz de iones enfocado (FIB), llamado FIB-SEM. Esto permite que una región específica de la muestra sea ablacionada por iones generados por una fuente de galio, eliminando el exceso de material y dejando una lámina6. El proceso de fresado se guía por imágenes SEM de la topografía de la muestra, que se utiliza para localizar regiones de interés y monitorear el progreso del fresado. Para aplicaciones biológicas, la configuración básica es en gran medida la misma, pero la molienda se lleva a cabo a temperaturas criogénicas. Esto ha requerido que los FIB-SEM estándar se adapten para tener etapas crioenfriadas que mantengan temperaturas constantes y bajas tasas de contaminación superficial, así como esclusas de aire para facilitar la transferencia de muestras sin desvitrificación o contaminación. Los transbordadores de muestra también se han modificado para permitir que se monte una gama de portadores diferentes dentro de la crioFIB-SEM, incluidas rejillas TEM, planchetas y capilares. Varios grupos clave de investigadores han sido fundamentales para el desarrollo de estos métodos y los continuos avances tecnológicos en esta área 7,8,9,10,11,12. Las soluciones comerciales están ahora más ampliamente disponibles para el fresado biológico FIB a temperatura criogénica y el fresado en la red de laminillas se está volviendo más rutinario, dada una muestra optimizada.
Se puede utilizar una gama de técnicas de temperatura ambiente y crioEM para visualizar información celular en todas las escalas de la vida, desde organismos multicelulares completos a una resolución modesta hasta la comprensión del contexto de procesos complejos a nivel celular y con mayor detalle, hasta la determinación de in situ Estructuras moleculares13,14,15,16,17,18,19. Las técnicas clásicas a temperatura ambiente incluyen la seccionación fija y teñida, de células y tejidos incrustados en resina por ultramicrotomía para el análisis de la morfología celular por TEM (para revisión, véase Studer et al., 200820). Se han desarrollado técnicas alternativas que explotan la dispersión secundaria de electrones mediante SEM para obtener imágenes de la superficie de bloques de células preservadas, antes de eliminar progresivamente el material, ya sea con un cuchillo (imagen de cara de bloque en serie) o un haz de iones enfocado.21,22,23. Esta técnica también se ha implementado con éxito a temperaturas criogénicas (denominadas imágenes de criovolumen) con un crioFIB-SEM en bloques vítreos de células o tejidos sin teñir.24. Alternativamente, las laminillas más gruesas (~ 15 μm de espesor) se pueden fresar y estudiar mediante imágenes STEM.25. Usando estas técnicas, se pueden obtener imágenes de bloques enteros que contienen muchas células para recopilar información de la población o se puede obtener una imagen de un órgano / organismo completo y reconstruirlo en 3D. Sin embargo, para acceder a la información molecular de alta resolución de las células, las muestras deben conservarse en un estado casi nativo, congelado e hidratado y, por lo tanto, deben prepararse en condiciones criogénicas. La criomicroscopía electrónica de secciones vítreas (CEMOVIS) es una técnica mediante la cual se seccionan bloques congelados de material biológico a alta presión en condiciones criogénicas con un ultramicrótomo. Esto produce cintas de criosecciones (40-100 nm de espesor)26, que se adjuntan a una cuadrícula EM y se visualizan en el TEM. Sin embargo, la interacción física del cuchillo con la muestra vítrea causa grietas y artefactos de compresión que pueden distorsionar gravemente la estructura celular.27,28,29,30. Las secciones más gruesas son más propensas a estos artefactos, por lo que no es práctico usar secciones más gruesas que ~ 70 nm26. Esta limitación restringe en gran medida la vista 3D de la estructura biológica en el tomograma. La molienda FIB a temperaturas criogénicas no experimenta estos problemas, pero tiene sus propios artefactos causados por las tasas de molienda diferenciales en partes de la muestra, lo que lleva a espesores variables dentro de una lámina, llamada cortina. Este problema se mitiga mediante la aplicación de una capa organoplatino aplicada a través de un sistema de inyección de gas (GIS), que protege el borde frontal de la lámina durante la molienda31. El límite superior del espesor de la muestra para el fresado FIB en la red se define por la capacidad de congelar la muestra mientras se mantiene vítrea.32, aunque, con la introducción de técnicas de elevación criogénica y portadores de muestras adaptados para muestras biológicas, la molienda FIB también se puede utilizar para procesar muestras congeladas a alta presión31,33,34,35. Además, las muestras congeladas por inmersión no pueden ser demasiado delgadas, ya que debe haber suficiente material biológico para generar una lámina de tamaño razonable que proporcione suficiente área de superficie para recolectar series de inclinación con el aumento requerido. Este problema puede aliviarse moliendo grupos de células más pequeñas, como bacterias o levaduras. El espesor final de la lámina (~ 100-300 nm) generalmente está dictado por la integridad de la muestra y la estrategia de fresado. Las laminillas más delgadas son mejores para trabajos estructurales de alta resolución, como el promedio de subtomograma, pero las laminillas más gruesas contienen volúmenes celulares mucho más grandes que los que se pueden lograr con CEMOVIS, proporcionando más contexto celular en una muestra casi conservada de forma nativa. La molienda FIB también se puede utilizar para diluir cristales de proteína congelados por inmersión para estudios de difracción de electrones36.
La molienda FIB de células vítreas vale la pena el tiempo y el esfuerzo para llevar a cabo si la cuestión científica requiere detalles moleculares de alta resolución de especímenes casi nativos in situ. Con acceso a más instalaciones para la producción rutinaria de laminillas, el paso limitante de la velocidad es a menudo la optimización de la muestra antes de la molienda, donde se debe tomar tiempo para garantizar que la muestra sea vítrea y un grosor adecuado para producir laminillas robustas y uniformemente delgadas. Aquí se describe la optimización de la muestra para los glóbulos rojos humanos congelados por inmersión de molienda FIB infectados con parásitos Plasmodium falciparum , el agente causante de la malaria, pero este enfoque podría adaptarse para cualquier muestra dada.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>c-clips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Direct quote from Thermo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>Sub-angstrom</td>
			<td>CSA-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound 2</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-FIB specific autogrid rims</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1205101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E64</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emitech K100X glow discharge unit</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12633012</td>
			<td>Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>350864X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11562203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Sub-angstrom</td>
			<td>PB</td>
			<td>For clipped grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>For clipped grids - direct quote from Thermo Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Home-made manual plunge freezing rig</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human blood</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>UK National Blood and Transplant service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>n/a</td>
			<td>FIB-SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td>sputter coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE900</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td>e-beam rotary coater. In a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linkam cryo-stage for light microscope</td>
			<td>Linkam</td>
			<td>Model No. CMS196</td>
			<td>Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse E200 light microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C17nCuH2-01</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C17nCu20-01</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum PP3010 prep-chamber</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>n/a</td>
			<td>sputter coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage.</td>
			<td>FEI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>FIB-SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen</td>
			<td>Viking Direct</td>
			<td>ND538522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFS Titan Krios 300 kV TEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>TEM equipped with a K2 or K3 camera.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatmann grade 1 filter paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA1001150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Scope A1 light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td>with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography

Aquí se presenta un protocolo para preparar criolaminillas a partir de rejillas congeladas por inmersión de eritrocitos humanos infectados con Plasmodium falciparum, que podrían adaptarse fácilmente para otras muestras biológicas. Los principios básicos para preparar muestras, fresar y ver laminillas son comunes a todos los instrumentos y el protocolo se puede seguir como una guía general para la preparación de criolaminillas en red para microscopía crioelectrónica (cryoEM) y tomografía crioelectrónica (cryoET). Las rejillas de microscopía electrónica que soportan las células se congelan por inmersión en etano líquido refrigerado por nitrógeno líquido utilizando un congelador de inmersión manual o automatizado, luego se criban en un microscopio óptico equipado con una etapa criogénica. Las rejillas congeladas se transfieren a un microscopio electrónico de criobarrido equipado con un haz de iones enfocado (cryoFIB-SEM). Las rejillas se recubren rutinariamente por pulverización catódica antes del fresado, lo que ayuda a la dispersión de la acumulación de carga durante el fresado. Alternativamente, se puede usar una recubridora rotativa de viga electrónica para aplicar una capa de carbono-platino a las rejillas, cuyo grosor exacto se puede controlar con mayor precisión. Una vez dentro del crioFIB-SEM, se aplica un recubrimiento adicional de un compuesto organoplatino a la superficie de la rejilla a través de un sistema de inyección de gas (GIS). Esta capa protege el borde frontal de la lámina a medida que se fresa, cuya integridad es fundamental para lograr laminillas uniformemente delgadas. Las regiones de interés se identifican a través de SEM y el fresado se lleva a cabo de manera gradual, reduciendo la corriente del haz de iones a medida que la lámina alcanza la transparencia de electrones, para evitar la generación excesiva de calor. Una rejilla con múltiples laminillas se transfiere a un microscopio electrónico de transmisión (TEM) bajo condiciones criogénicas para la adquisición en serie de inclinación. Un flujo de trabajo robusto y libre de contaminación para la preparación de láminas es un paso esencial para las técnicas posteriores, incluida la crioEM celular, la crioET y el promedio de subtomograma. El desarrollo de estas técnicas, especialmente para la extracción y molienda de muestras congeladas a alta presión, es de alta prioridad en el campo.

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Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Uso de molienda de haz de iones enfocado para producir láminas vítreas en la rejilla a partir de muestras biológicas congeladas por inmersión para tomografía crioelectrónica.

Preparación de laminillas a partir de muestras biológicas vítreas utilizando un microscopio electrónico de barrido de doble haz para la criotomografía electrónica

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Este protocolo describe la preparación de láminas vítreas de glóbulos rojos infectados con Plasmodium-falciparum para la criotomografía electrónica. Esto permite la observación directa de información estructural detallada sobre cómo el parásito causa la malaria. La criotomografía electrónica registra información de alta resolución sobre el interior de las células.Es lo suficientemente potente como para observar complejos de proteínas individuales in situ, que pueden extraerse computacionalmente y promediarse para revelar información estructural tridimensional sobre las proteínas. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para diferentes tipos de células y puede ser un punto de partida para alguien nuevo en la producción de láminas vítreas para la tomografía crioelectrónica. Se trata de Alejandra Carbajal, quien estará llevando a cabo el protocolo hoy.Para comenzar, examine las rejillas de cobre congelado utilizando un CryoStage para un microscopio óptico con especial atención al gradiente de hielo a través de la rejilla. Verifique los cuadrados de cuadrícula individuales para la cobertura celular en las áreas más delgadas de hielo. Utilice un marcador negro indeleble para marcar la parte delantera y el lado opuesto de las llantas Autogrid específicas de Cryo-FIB-SEM.Cargue la rejilla recortada en el transbordador Cryo-FIB-SEM con el lado de carbono hacia arriba y aplique una capa giratoria de haz electrónico de carbono o platino de cuatro nanómetros de espesor a la superficie de las células. Cargue la lanzadera en el Cryo-FIB-SEM y evalúe la distribución celular en cada red mediante SEM a cinco kilovoltios. Tome una visión general de bajo aumento a 100 potencias para observar los gradientes de hielo en toda la red.Luego tome imágenes de mayor aumento a 5, 000 de potencia para mirar cuadrados de cuadrícula individuales. Aplique una capa organoplatino de dos micrómetros a la superficie de cada rejilla insertando la aguja del sistema de inyección de gas en la cámara sobre la rejilla y calentando la fuente de organoplatino a una temperatura establecida durante un tiempo determinado para producir un flujo de vapor. Para observar la muestra, incline la muestra de modo que el plano de la cuadrícula esté aproximadamente 10 grados desde el ángulo de incidencia del haz de iones, y mueva el centro de un cuadrado de cuadrícula adecuado para ser visto en las imágenes SEM y FIB.usando el haz de iones a baja corriente, Examine la cuadrícula con un aumento alto para visualizar las celdas en el centro de un cuadrado de cuadrícula. Marque dos patrones rectangulares para fresar, uno por encima y otro por debajo de una región protegida de tres micrómetros de espesor. A continuación, elija la configuración del haz y corrija el astigmatismo ajustando el brillo y el contraste.una vez completada la configuración, comience a fresar a una corriente de 300 picoamperios mientras monitorea el progreso en vivo en la vista del haz de iones e intermitentemente por SEM. La muestra se comprueba En la vista SEM, y después del primer fresado, Si el haz de iones no ha atravesado la muestra por encima y por debajo de la región protegida, elimine más material aumentando la altura de los patrones rectangulares. Detenga el fresado cuando la superficie por encima y por debajo de la lámina esté completamente lisa en la vista del haz de iones.Repita el proceso de fresado paso a paso, reduciendo la corriente del haz de iones cada vez hasta alcanzar un espesor de 300 nanómetros. Registre la posición X Y Z de cada lámina. Para pulir las laminillas al final del experimento, utilice una descripción general de SEM de bajo aumento para seleccionar un grupo de láminas que se pulirán y marcar la raíz de pulido.Una vez marcada la raíz de pulido, reduzca el espacio entre los dos patrones rectangulares a 100 a 200 nanómetros y comience el pulido a una corriente de haz de iones de 30 picoamperios. Monitoree el progreso por SEM a dos o tres kilovoltios. Deje de pulir cuando el contraste en la lámina se pierde por SEM o cuando la capa organoplatino o la propia lámina comienzan a perder integridad.Adquiera y guarde imágenes SEM de bajo aumento de cada lámina. Después de completar el experimento, retire la lanzadera del microscopio. Retire las rejillas con laminillas y guárdelas bajo nitrógeno líquido.Maneje las rejillas con cuidado. Para estudiar la morfología, los esquizontes se estancaron en diferentes etapas de salida utilizando el compuesto dos en inhibidores de E-64. En presencia del compuesto dos, el límite entre las membranas parasitóforas y la hemoglobina circundante en el glóbulo rojo del huésped estaba bien definido.La vacuola parasitófora intacta, o PV, estaba llena de merozoítos en un solo grupo de cristales de hemozoína. Cuando el compuesto dos esquizontes sincronizados se lavó en E-64, la membrana fotovoltaica se rompió y los merozoítos se extendieron dentro del RBC. Un ejemplo típico de buena distribución celular en una rejilla de cobre muestra grandes glóbulos rojos con una periferia bien definida y una membrana vacuola intacta.Dentro de un glóbulo rojo huésped parcialmente colapsado, los merozoítos individuales se visualizaron como grupos de células pequeñas. Cada esquizonte tenía una mancha negra en su centro que indicaba la posición de los cristales de hemozoína. Después del fresado, las rejillas se cargaron en el TEM para identificar las posiciones de las laminillas y encontrar áreas adecuadas para apuntar por tomografía.En la micrografía de la muestra, se puede ver un RBC que recientemente había sido invadido por un merozoíto. El merozoíto rodeado por la membrana derivada de la célula huésped se podía ver dentro del límite del RBC. En el extremo apical del merozoíto, las dos membranas que rodean la célula y cuatro membranas apiladas en el vértice del merozoíto asociadas con una característica en forma de hongo densa en electrones eran claramente visibles.Dentro del citoplasma del merozoíto, se identificó un evento de fusión entre la membrana plasmática del merozoíto y una vesícula multicapa. En un análisis TEM adicional de una lámina de 230 nanómetros de espesor, se observó la morfología típica de un merozoíto maduro tratado con E-64. Dentro de la membrana de los glóbulos rojos, la membrana plasmática del merozoíto se puede ver con orgánulos como el complejo de membrana interna, los anillos polares, los micronemes, las rhoptries y la envoltura nuclear.La parte más importante de esta técnica es optimizar las rejillas para permitir la producción reproducible y eficiente de laminillas delgadas. El desarrollo adicional de esta técnica permitirá a los investigadores visualizar moléculas de una sola proteína dentro de los parásitos de la malaria y determinar su papel en la salida de la malaria.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Uso de resonancia paramagnética electrónica en muestras biológicas a temperatura ambiente y 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Investigación

Bioquímica

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Preparación rápida de la rejilla para la crio-microscopía electrónica resuelta en el tiempo

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparación y micromecanizado Crio-FIB de Saccharomyces cerevisiae para Crio-Tomografía Electrónica

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Microscopía crioelectrónica de partícula única: de la muestra a la estructura

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatronaje Transmisión Microscopía Microscopía Rejillas para Dirigir el Posicionamiento Celular dentro de los Flujos de Trabajo de Tomografía Crioelectrónica de Celda Entera

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Un robusto flujo de trabajo de procesamiento de criomicroscopía electrónica de una sola partícula (cryo-EM) con cryoSPARC, RELION y Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Preparación de partículas de núcleo de nucleosomas complejadas con factores de reparación de ADN para la determinación estructural de la criomicroscopía electrónica

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Extracción de microtúbulos modificados de células de mamíferos para estudiar complejos microtúbulos-proteínas mediante microscopía crioelectrónica

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Aplicación de grafeno monocapa a rejillas de criomicroscopía electrónica para la determinación de estructuras de alta resolución

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...