Name: preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography
Uploaded: 2021-08-05T13:30:00
Duration: 7 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Denna forskning finansierades helt eller delvis av Wellcome Trust (212916/Z/18/Z). För öppen tillgång har författaren tillämpat en CC BY offentlig upphovsrättslicens på alla författaraccepterade manuskriptversioner som härrör från detta bidrag.
Detta projekt för vilket denna metod utvecklades finansierades av ett Medical Research Council-anslag MR/P010288/1 som tilldelades Helen R. Saibil, Roland A. Fleck och Michael J. Blackman. Kulturer av P. falciparum odlades vid The Francis Crick Institute, med stöd av medlemmar i Michael J. Blackmans grupp. Författarna vill tacka Dr. Ser Ying (Michele) Tan för att ha tillhandahållit bilderna av förening 2 och E64-behandlade schizonter i tunna blodutstryk. De flesta lamellerna producerades med stöd från personal på eBIC och vi är tacksamma för tillgång till Scios dubbelstrålande kryoFIB-SEM på forskningsförslag NT21004. Författarna erkänner också stödet från Royal Society Industry Fellowship-systemet (INF\R2\202061) för att fortsätta utvecklingen av FIB-fräsningstekniken inom CUI. Författarna vill också tacka Helen R. Saibil för nyttiga diskussioner i relation till detta metoddokument och handledning av projektet.

Humant blod erhölls från anonymiserade givare genom UK National Blood and Transplant service och används inom 2 veckor efter mottagandet. Inget etiskt godkännande krävs för dess användning.
1. Beredning och djupfrysning av Plasmodium falciparum-infekterade röda blodkroppar
<ol><li>Isolera mogna schizonter genom centrifugering (1,580 x g) över ett 70% (v / v) isotoniskt densitetsgradientmedium (för standardprocedurer för hur man odlar asexuella blodstadier av 3D7 Plasmodium falciparum i humana erytrocyter, se Blackman M.J., 1995:37).</li>
	<li>Fixera de lufttorkade tunna blodfilmerna på en glasskiva med 100% metanol för att kontrollera schizonternas morfologiska homogenitet innan du färgar med 10% Giemsa-fläck i 6,7 mM fosfatbuffert, pH 7,1. OBS: För att berika preparatet för schizonter som stannar vid specifika utgångspunkter kan schizonter synkroniseras ytterligare med förening 2 och E64-hämmare (se representativa resultat och figur 1 för en förklaring av effekten av dessa hämmare). VARNING: Plasmodium falciparum är en humanpatogen och får endast hanteras i en lämplig inneslutningsanläggning enligt lokala hälso- och säkerhetsriktlinjer.</li>
	<li>Centrifugera försiktigt schizonter (240 x g) för att pellet dem och återsuspendera i 2x volym av cellpelleten av RPMI-media, vilket resulterar i en 50% hematokritsuspension.</li>
	<li>På en manuell dykfrysrigg, applicera 2,5 μL schizonts på kolsidan av en glödurladdad (Använd glödurladdningsenhetsinställningar på 60 s, 30 mA i luft, behandla endast kolsidan av gallret) 200 mesh kopparnät med en 2/4 hålig kolfilm och blotta i ~ 20 s från baksidan av gallret med hjälp av klass 1 filterpapper med en sönderriven kant. Doppa i flytande kvävekyld flytande etan och överför gallren till lagring (se materialtabell för utrustning som används i denna studie). OBS: Experimentet kan pausas här, och galler kan lagras under flytande kväve på obestämd tid. VARNING: Flytande kväve är kvävande och orsakar frostskador; Hantera varsamt i lämplig miljö med syrgasövervakning. VARNING: Flytande etan orsakar allvarliga brännskador och är brandfarligt; Använd i en dragskåp borta från antändningskällor. OBS: Doppfrysta schizonter är inte längre livskraftiga. Detta bestämdes genom att inkubera humant blod med flera guldgaller av lufttinade doppfrysta schizonter och observera ingen parasittillväxt efter flera dagar, jämfört med ofrysta kontroller. Frysta galler av schizonter är därför säkra att hantera utanför inneslutningsanläggningar med normala säkerhets- och dekontamineringsprocedurer (handskar, yt-/verktygssterilisering med >70% etanol och bortskaffande av galler i >70% etanol).</li>
	<li>Skärmgaller med hjälp av ett kryosteg för ett ljusmikroskop, med särskild uppmärksamhet på isens lutning över gallret. I de tunnare isområdena, kontrollera enskilda rutnätrutor för celltäckning. OBS: De bästa rutorna ska vara en cell tjock i mitten av rutnätet (figur 2). Detta säkerställer att en lamell kan fräsas över mitten av torget utan att träffa den tjockare isen vid kanterna mot gallerstängerna. Experimentet kan pausas här, och galler kan lagras under flytande kväve på obestämd tid. Om celler bär en fluorescerande markör kan galler också screenas av kryoCLEM för att lokalisera X / Y-positioner av intresse, vilket kan korreleras med rutnätplatser i kryoFIB-SEM för direkt fräsning.</li>
</ol>2. FIB-fräsning på nätet av djupfrysta celler
<ol><li>Markera framsidan av kryoFIB-specifika autogridfälgar med en svart outplånlig markeringspenna för att indikera mitten av cutaway-sektionen och motsatt sida av fälgen (figur 3). Ställ in urklippsstationen och klippgallren i de markerade ringarna med kolsidan nedåt.</li>
	<li>Ladda galler i kryoFIB-SEM-skytteln (vanligtvis 2 galler, beroende på skytteln) kolsidan uppåt och applicera en platina-sputterbeläggning i en argonatmosfär (5 x 10-2 mbar) (5 mA i 60 s - tjockleken är variabel) eller en kol / platina e-stråle roterande beläggning (~ 4 nm tjocklek) på cellens yta. OBS: Båda typerna av beläggningar hjälper laddningsspridning under SEM-avbildning. Fördelen med e-balkens roterande beläggning är att beläggningens exakta tjocklek kan specificeras.</li>
	<li>Ladda skytteln i kryoFIB-SEM och bedöm cellfördelningen på varje rutnät med SEM vid 5 kV (13 pA eller 25 pA). Ta en översikt över låg förstoring (~ 100x) för att titta på isgradienter över rutnätet. Ta sedan bilder med högre förstoring (~ 5 000x) för att titta på enskilda rutnätsrutor och identifiera de områden i rutnätet med synliga cellulära funktioner och låg ytkontaminering att mala.</li>
	<li>Applicera ett >2 μm organoplatinaskikt på ytan av varje galler med hjälp av gasinsprutningssystemet (GIS). För att göra detta, sätt in GIS-nålen i kammaren ovanför gallret och värm organoplatinakällan till en inställd temperatur under en viss tid (till exempel ~ 27 ° C i 3-10 s) för att producera ett flöde av ånga. OBS: Appliceringsvinkeln, temperaturen och tidpunkten för organoplatinumbeläggningen via GIS-nålen bör optimeras för att maximera en jämn beläggning. Detta beror på den specifika kryoFIB-SEM som används (se Representativa resultat för ytterligare förklaring).</li>
	<li>Luta provet så att rutnätets plan är ~10° från jonstrålens infallsvinkel och flytta mitten av en lämplig rutnätskvadrat som ska ses i både SEM- och FIB-bilderna.</li>
	<li>Kartlägg nätet med hjälp av jonstrålen vid låg ström (nominellt 1,5 pA, 30 kV) och gå till tillräckligt hög förstoring (~ 7 000x) för att visualisera cellerna i mitten av ett rutnät. Ta provet i fokus vid den första fräsströmmen (300 pA) och korrigera för astigmatism. Justera ljusstyrkan och kontrasten och markera sedan ut två rektangulära mönster för att fräsa, ett ovanför och ett under ett 3 μm tjockt skyddat område, vars mitt är den önskade platsen för den slutliga lamellen. OBS: Den valda bredden på mönstren beror på topografin i det omgivande cellskiktet och cellstorleken. 7-20 μm är en lämplig bredd för schizonter, men bredare lameller tar längre tid att mala. Den valda höjden på mönstren för det första frässteget beror på provets tjocklek, med början runt 6 μm; Detta kan behöva justeras under fräsningen. Fräsning utförs riktningsmässigt från utsidans övre och nedre kanter av mönstren mot lamellens yta. Detta kan göras parallellt, där båda mönstren fräss samtidigt eller sekventiellt, först avlägsna material ovanför lamellen och sedan underifrån.</li>
	<li>Börja fräsa vid den första strömmen; övervaka förloppet i jonstrålevyn och intermittent med SEM (5 kV, 13 eller 25 pA). Kontrollera att jonstrålen har brutit igenom provet ovanför och under det skyddade området. Om inte, öka höjden på de rektangulära mönstren för att ta bort mer material. Stanna när ytan ovanför och under lamellen är helt slät i jonstrålvyn. OBS: Jonstrålen har brutit igenom provet ovanför och under det skyddade området när insidan av de rektangulära mönstren inte innehåller några detaljer i fokalplanet. Vissa funktioner, till exempel rutnätsfält, kan vara synliga utanför fokus i bakgrunden.</li>
	<li>Byt till nästa fräsström (100 pA); Fokusera och justera ljusstyrkan/kontrasten. Minska utrymmet mellan de två rektangulära mönstren till 1,5 μm och minska mönsterhöjden så att den endast täcker det ofrästa materialet. Börja fräsa vid den nya strömmen tills ytan ovanför och under lamellen är helt slät.</li>
	<li>Upprepa denna process stegvis tills en tjocklek på 0,3 μm uppnås, vilket minskar jonstrålströmmen varje gång enligt frässchemat i tabell 1.</li>
	<li>Mal flera lameller (mängden beror på provets tjocklek och den tillgängliga tiden) på ett eller båda gallren till en tjocklek av 0,3 μm, registrera X / Y / Z-positionen för varje lamell och reservera ~ 1-2 timmar i slutet av sessionen för att polera lamellerna till deras slutliga tjocklek (60-200 nm).</li>
	<li>Ta en SEM-översikt med låg förstoring av hela rutnätet och planera en poleringsväg från lameller längst fram på gallret (närmare jonstrålkällan) till lameller längst bak i gallret (längst bort från jonstrålkällan) (figur 5). OBS: Detta minskar återavsättning av ablerat material tillbaka på ytan av polerade lameller.</li>
	<li>Minska utrymmet mellan de två rektangulära mönstren till 100-200 nm och börja det sista poleringssteget vid en jonstrålström på 30 pA. Övervaka framstegen med SEM vid 2-3 kV (13 pA, bo = 300 n, 3072 x 2048, ~ 2 s för en hel ram) och sluta polera när kontrasten går förlorad i lamellen av SEM eller när själva lamellens organoplatinabeläggning börjar förlora integriteten.</li>
	<li>Innan du tar bort rutnätet, skaffa en SEM-bild med låg förstoring av hela rutnätet och spara bilder av varje lamell. Använd dem för att dubbelkontrollera rutnätet senare i TEM. Pausa experimentet här och förvara gallret med lameller under flytande kväve - hantera försiktigt. OBS: Galler kan lätt sprutas belagda vid borttagning från kryoFIB-SEM, vilket kan bidra till att begränsa drift och laddning i TEM vid hög förstoring, men detta bör göras försiktigt eftersom för mycket sputterbeläggning kan dölja det biologiska innehållet inuti lamellerna. Det är möjligt att screena lameller för fluorescens i detta skede; Att få tillräckligt med signal beror emellertid på överflödet av det märkta proteinet inom lamellens tjocklek. Stor försiktighet måste iakttas vid hantering av gallren för att begränsa skador på lamellerna och förhindra ytkontaminering.</li>
</ol>3. Insamling av tilt-serier och allmän översikt över databehandling
<ol><li>Fyll på stödrastren i TEM och rikta in fräsriktningen vinkelrätt mot stegets lutningsaxel. OBS: Justering av rutnäten görs med ögat med hjälp av märkena på autogridfälgen. En ~ 10 ° felmarginal är acceptabel, annars kan väggarna i diket på vardera sidan av lamellen dölja lamellen när gallret lutas.</li>
	<li>Skaffa en karta med låg förstoring (~ 150x) av hela rutnätet och lokalisera lamellerna; Skaffa sedan en medelförstoringskarta (~ 1 500x, beroende på lamellstorlek) för varje lamell och hitta intressanta områden.</li>
	<li>Vinkla rutnätet ±10° så att lamellplanet (inte rutnätet) är vinkelrätt mot den optiska axeln OBS: Förlutningens riktning kan bestämmas av positionen för lamellernas framkant (letar efter den överblivna organoplatinabeläggningen) i kartorna med låg och medelhög förstoring. För det varvtalsskydd som används här kräver rutnät +10° förlutning om lamellernas framkanter pekar uppåt på kartorna och kräver en förlutning på -10° om de pekar nedåt. Varje rutnät kan vara annorlunda på grund av hur de plockades upp och sattes in i autoladdaren.</li>
	<li>Hämta dossymmetrisk lutningsserie38 (till exempel -54° till +54° med en ökning på 3-5°) vid en pixelstorlek som tillåter både synfält och upplösning som krävs för det berörda området. Använd ett intervall med oskärpevärden mellan -2 och -5 μm. Samla filmer med 3-10 bilder vid varje steg och för detta, justera dessa parametrar beroende på pixelstorleken för att ackumulera en total dos på ~ 150 e-/Å2 (för en 300 kV TEM). OBS: Sprickor i lamellen bör undvikas eftersom dessa regioner kan driva. Ytkontaminering bör också undvikas eftersom det kan skymma intresseområdet eller fokusområdet vid hög lutning.</li>
	<li>Rörelsekorrigera filmerna med ett program som MotionCor239. Använd ett dosviktningsfilter på de korrigerade bilderna (ackumulerad e-/bild)40 och uppskatta varje bilds oskärpa med hjälp av ett program som CTFFIND441.</li>
	<li>Använd fiducial-less alignment (patch tracking) i ett program som etomo (IMOD)42 för att beräkna justeringen och vinkelförhållandet mellan bilderna i tilt-serien.</li>
	<li>Ange justerings- och rotationsinformation, tillsammans med defokusvärdena i ett program som kan tillämpa tredimensionell CTF-korrigering, till exempel NovaCTF43. Beräkna ett korrigerat tomogram för att få utdatatomogram med binning-faktorer som är relevanta för nedströmsanalys.</li>
	<li>Analysera rekonstruktionerna och förbereda för eventuell nedströmsbearbetning, till exempel filtrering, segmentering eller sub-tomogrammedelvärde.</li>
</ol>

Författarna har inget att avslöja.

Medan kryoFIB-fräsning blir mer rutinmässig har beredning av optimala prover för fräsning inte; därför inträffar de flesta av de kritiska stegen i detta protokoll innan provet når kryoFIB-SEM. Provoptimering genom flera omgångar av cellberedning, doppfrysning och screening med ljus- och elektronmikroskopi krävs för att producera bästa möjliga prov innan fräsning försöks. Att ha bästa möjliga prov ökar inte bara chanserna för framgång utan optimerar också användningen av utrustningen. Av denna anledning kräver de flesta nationella anläggningar bevis för att tillräcklig optimering har utförts innan de beviljar tid på sina maskiner. Väl inne i kryoFIB-SEM är det viktigt att maximera effektiviteten hos den organoplatina beläggningen för att producera jämnt tunna lameller. Slutligen är tålamod och god provhantering en förutsättning för användaren, som kommer att behöva sitta i flera dagar för att producera och sedan överföra galler som innehåller känsliga lameller. Detta kan förändras med införandet av automatiserade frässtrategier47,48, men än så länge är hela malningsprocessen fortfarande till stor del manuell på de flesta anläggningar.
Medan arbetet enbart fokuserade på P. falciparum schizonts, kunde metoden som presenteras här enkelt modifieras för att optimera nätberedning och fräsning för andra celltyper. Viktiga faktorer att tänka på är densiteten hos cellerna som appliceras på gallret, rutnätstypen (koppar är giftigt för vissa celler), storleken och avståndet mellan hål i kolfilmen, blottningstiden och metoden för blotting (enkel/dubbelsidig, manuell eller automatiserad). Dessutom, om cellerna odlas på gallret (vanligtvis guldnät med en hålig kolfilm), kan sammanflödet kontrolleras med ljusmikroskopi före blottning och frysning. Fräsningsstrategin beror på hur cellerna deponeras på gallret. För malariainfekterade röda blodkroppar är gallret i huvudsak belagt av ett obrutet lager av celler, tjockare i vissa områden och tunnare i andra områden. Fräsning utförs på flera punkter i ett område längs denna gradient där istjockleken genererar lameller som är en lämplig storlek för tomografi. Detta tillvägagångssätt fungerar bra för mindre celler eftersom du kan producera lameller som innehåller en skiva genom flera celler. För större celler eller klumpar av celler kan det vara så att en cell eller cellklump kan producera en lamell.
Näthantering och provöverföring är fortfarande en av de största utmaningarna i detta arbetsflöde. Lameller kan gå förlorade på grund av brott eller sprickor, gardinartefakter som döljer biologin, överdriven ytkontaminering samt problem med nätorientering inom TEM, vilket kräver ett extra hanteringssteg för att flytta gallret. Graden av förluster varierar från dag till dag och rutnät till rutnät, men det förbättras genom övning och hanteringserfarenhet över tid. I denna studie fann man att gallren kan omorienteras noggrant i autoladdaren flera gånger utan att förstöra lameller och detta har ibland fördelen att tvätta bort ytis. En annan viktig begränsning av detta arbetsflöde är den tid det tar att producera lameller. Eftersom produktionen är långsam är det viktigt att ha ett korrekt optimerat prov, vilket gör fräsningen så effektiv som möjligt.
Ett antal anpassningar av FIB-fräsning av glaskroppsprover har nyligen införts. En spelväxlare är implementeringen av kryogeniskt kylda lyftverktyg i kryoFIB-SEM-kammaren som gör det möjligt att fräsa större materialblock från högtrycksfrysta prover. Blocken kan fästas på en metallstav eller plockas upp i en gripare och flyttas till en andra provposition, innehållande ett speciellt modifierat EM-rutnät. Blocken kan sedan beläggas med organoplatina och fräsas för att generera lameller. Förmågan att mala lameller från högtrycksfryst material innebär att mycket större celler och vävnader kan bearbetas, specifikt riktade områden genom korrelativ fluorescensmikroskopi12. Andra nya anpassningar av FIB-fräsningsmetoden inkluderar minskning av gardinartefakter genom kilförfräsning av provet16, mikrofluidisk kryofixering49 och fotomikromönstring av elektronmikroskopinät för att förbättra cellfördelningen50. Det har också visats att fräsning av mikroexpansionsgap på vardera sidan av en lamell kan lindra kompressionen av det omgivande provet när det når sin slutliga tunnhet51. Detta kan vara särskilt användbart vid fräsning av kontinuerliga cellskikt, såsom provet i denna studie, där böjning av lameller ibland ses under det sista poleringssteget.
Framtiden för elektronmikroskopi kommer sannolikt att vara bestämning av in situ-molekylära strukturer genom subtomogrammedelvärde och FIB-fräsning är ett viktigt verktyg som underlättar produktionen av glaskroppsbiologiska prover för dessa typer av arbetsflöden. Medan FIB-fräsning fortfarande är i sin linda för biologiska tillämpningar, sker metodutveckling i snabb takt tack vare hårt arbete från forskare, både akademiska och vid nationella anläggningar, plus kommersiella investeringar i att utveckla kryoFIB-SEM-teknik för att stödja forskning.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated from:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University
to:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
M. Alejandra Carbajal1 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Endast det cellulära innehållet i biologiska prover < 500 nm tjockt kan avbildas effektivt genom transmissionselektronmikroskopi (TEM) vid kryogena temperaturer, vilket begränsar provintervallet till virus, prokaryoter, enkla encelliga organismer och tunnare regioner av större eukaryota celler1. On-grid-fokuserad jonstrålefräsning (FIB) gör det möjligt att tunnas ut tjockare djupfrysta biologiska prover till elektrontransparenta lameller vid kryogena temperaturer (< -150 °C). De resulterande lamellerna överförs sedan till en TEM för visualisering och tomografisk datainsamling, vilket möjliggör högupplösta 3D-rekonstruktioner av cellulära och molekylära egenskaper inuti celler (för recensioner se Rigort et al., 20122, Oikonomou et al., 20163 och Wagner et al., 20204).
FIB-fräsning uppstod från materialvetenskapen, där prover rutinmässigt gallras för att förbereda dem för nedströmsanalys5. Det utförs i ett svepelektronmikroskop (SEM), som har två optiska kolumner: konventionell skanningselektronmikroskopoptik och en andra kolonn som innehåller optik som kan generera och finstyra en fokuserad jonstråle (FIB) - kallad FIB-SEM. Detta gör att en specifik region av provet kan ableras av joner genererade av en galliumkälla, avlägsna överflödigt material och lämna efter sig en lamell6. Fräsningsprocessen styrs av SEM-avbildning av provets topografi, som används för att lokalisera intressanta regioner och övervaka fräsningsförloppet. För biologiska tillämpningar är grundinställningen i stort sett densamma, men malning utförs vid kryogena temperaturer. Detta har krävt att standard FIB-SEM anpassas för att ha kryokylda steg som upprätthåller konstanta temperaturer och låga ytkontamineringshastigheter, samt luftslussar för att underlätta provöverföring utan devitrifiering eller kontaminering. Provskyttlar har också modifierats för att tillåta en rad olika bärare att monteras inuti kryoFIB-SEM, inklusive TEM-galler, planchetter och kapillärer. Flera nyckelgrupper av forskare har varit centrala för utvecklingen av dessa metoder och de fortsatta tekniska framstegen inom detta område 7,8,9,10,11,12. Kommersiella lösningar är nu mer allmänt tillgängliga för biologisk FIB-fräsning vid kryogen temperatur och malning av lameller på nätet blir mer rutinmässigt, givet ett optimerat prov.
En rad rumstemperatur- och kryoEM-tekniker kan användas för att visualisera cellulär information över alla livsskalor, från hela flercelliga organismer med blygsam upplösning till att förstå sammanhanget för komplexa processer på cellulär nivå och i ännu större detalj, till bestämning av in situ Molekylära strukturer13,14,15,16,17,18,19. Klassiska rumstemperaturtekniker inkluderar sektionering av fixerade och färgade, hartsinbäddade celler och vävnader genom ultramikrotomi för analys av cellulär morfologi med TEM (för granskning se Studer et al., 200820). Alternativa tekniker har utvecklats genom att utnyttja sekundär elektronspridning av SEM för att avbilda ytan på block av bevarade celler, innan material gradvis avlägsnas antingen med en kniv (seriell blockavbildning) eller en fokuserad jonstråle21,22,23. Denna teknik har också framgångsrikt implementerats vid kryogena temperaturer (kallad kryovolymavbildning) med en kryoFIB-SEM på glasaktiga, ofärgade block av celler eller vävnader24. Alternativt kan tjockare lameller (~ 15 μm tjocka) fräsas och studeras genom STEM-avbildning25. Med hjälp av dessa tekniker kan hela block som innehåller många celler avbildas för att samla befolkningsinformation eller ett helt organ / organism kan avbildas och rekonstrueras i 3D. För att få tillgång till högupplöst molekylär information från celler måste prover dock bevaras i ett nästan inhemskt, fryst hydratiserat tillstånd och måste därför beredas under kryogena förhållanden. Kryoelektronmikroskopi av glaskroppssektioner (CEMOVIS) är en teknik där högtrycksfrysta block av biologiskt material skärs under kryogena förhållanden med en ultramikrotom. Detta ger band av kryosektioner (40-100 nm tjocka)26, som är anslutna till ett EM-rutnät och avbildade i TEM. Knivens fysiska interaktion med glaskroppsprovet orsakar emellertid sprickor och kompressionsartefakter som allvarligt kan snedvrida cellulär struktur27,28,29,30. Tjockare sektioner är mer benägna att dessa artefakter, vilket gör det opraktiskt att använda sektioner tjockare än ~ 70 nm26. Denna begränsning begränsar kraftigt 3D-vyn av den biologiska strukturen i tomogrammet. FIB-fräsning vid kryogena temperaturer upplever inte dessa problem, men har sina egna artefakter orsakade av olika fräshastigheter över delar av provet, vilket leder till varierande tjocklekar inom en lamell - kallad gardin. Detta problem mildras genom applicering av en organoplatinabeläggning applicerad via ett gasinsprutningssystem (GIS), som skyddar lamellens framkant under fräsning31. Den övre gränsen för provtjocklek för FIB-fräsning på nätet definieras av förmågan att frysa provet samtidigt som det förblir glasaktigt32, men med införandet av kryolyftningstekniker och anpassade provbärare för biologiska prover kan FIB-fräsning också användas för att bearbeta frysta prover med högt tryck31,33,34,35. Dessutom kan frysta prover inte vara för tunna eftersom det måste finnas tillräckligt med biologiskt material för att generera en lagom stor lamell som ger tillräckligt med yta för att samla lutningsserier vid önskad förstoring. Detta problem kan lindras genom att mala klumpar av mindre celler, såsom bakterier eller jäst. Slutlig lamelltjocklek (~ 100-300 nm) dikteras vanligtvis av provets integritet och fräsningsstrategi. Tunnare lameller är bättre för högupplöst strukturellt arbete, såsom subtomogrammedelvärde, men tjockare lameller innehåller mycket större cellulära volymer än vad som kan uppnås med CEMOVIS, vilket ger mer cellulärt sammanhang i ett nära till naturligt bevarat prov. FIB-fräsning kan också användas för att tunna djupfrysta proteinkristaller för elektrondiffraktionsstudier36.
FIB-fräsning av glasceller är värt tiden och ansträngningen att utföra om den vetenskapliga frågan kräver högupplösta molekylära detaljer av nära inhemska prover in situ. Med tillgång till fler anläggningar för rutinproduktion av lameller är det hastighetsbegränsande steget ofta optimering av provet före malning, där tid måste tas för att säkerställa att provet är glasaktigt och en lämplig tjocklek för att producera robusta och jämnt tunna lameller. Här beskrivs provoptimeringen för FIB-fräsning av djupfrysta humana röda blodkroppar infekterade med Plasmodium falciparum-parasiter , malarians orsakssamband, men detta tillvägagångssätt kan anpassas för ett givet prov.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>c-clips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Direct quote from Thermo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipping station</td>
			<td>Sub-angstrom</td>
			<td>CSA-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound 2</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-FIB specific autogrid rims</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1205101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E64</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emitech K100X glow discharge unit</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12633012</td>
			<td>Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>350864X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11562203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Sub-angstrom</td>
			<td>PB</td>
			<td>For clipped grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>For clipped grids - direct quote from Thermo Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid boxes</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Home-made manual plunge freezing rig</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human blood</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>UK National Blood and Transplant service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>n/a</td>
			<td>FIB-SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td>sputter coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE900</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td>e-beam rotary coater. In a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linkam cryo-stage for light microscope</td>
			<td>Linkam</td>
			<td>Model No. CMS196</td>
			<td>Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse E200 light microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C17nCuH2-01</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C17nCu20-01</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum PP3010 prep-chamber</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>n/a</td>
			<td>sputter coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage.</td>
			<td>FEI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>FIB-SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen</td>
			<td>Viking Direct</td>
			<td>ND538522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFS Titan Krios 300 kV TEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>TEM equipped with a K2 or K3 camera.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatmann grade 1 filter paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA1001150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Scope A1 light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td>with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography

Här presenteras ett protokoll för beredning av kryolameller från djupfrysta galler av Plasmodium falciparum-infekterade humana erytrocyter, som lätt kan anpassas för andra biologiska prover. De grundläggande principerna för beredning av prover, fräsning och visning av lameller är gemensamma för alla instrument och protokollet kan följas som en allmän guide till kryo-lamellberedning på nätet för kryoelektronmikroskopi (kryo-elektronmikroskopi) och kryoelektrontomografi (kryoET). Elektronmikroskopigaller som stöder cellerna fryses i flytande kvävekyld flytande etan med hjälp av en manuell eller automatiserad frys och screenas sedan på ett ljusmikroskop utrustat med ett kryosteg. Frysta galler överförs till ett kryo-skanningselektronmikroskop utrustat med en fokuserad jonstråle (cryoFIB-SEM). Galler är rutinmässigt sputterbelagda före fräsning, vilket underlättar spridning av laddningsuppbyggnad under fräsning. Alternativt kan en e-balk roterande beläggning användas för att applicera ett lager kol-platina på gallren, vars exakta tjocklek kan kontrolleras mer exakt. Väl inne i kryoFIB-SEM appliceras en ytterligare beläggning av en organoplatinaförening på nätets yta via ett gasinjektionssystem (GIS). Detta skikt skyddar lamellens framkant när den fräss, vars integritet är avgörande för att uppnå jämnt tunna lameller. Intressanta regioner identifieras via SEM och fräsning utförs stegvis, vilket minskar jonstrålens ström när lamellen når elektrontransparens för att undvika överdriven värmeproduktion. Ett galler med flera lameller överförs sedan till ett transmissionselektronmikroskop (TEM) under kryogena förhållanden för insamling av tilt-serier. Ett robust och kontamineringsfritt arbetsflöde för lamellberedning är ett viktigt steg för nedströmstekniker, inklusive cellulär kryoEM, kryoET och subtomogrammedelvärde. Utveckling av dessa tekniker, särskilt för lyftning och malning av högtrycksfrysta prover, är av hög prioritet i fält.

Watch this Scientific Journal Video about Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Använda fokuserad jonstrålefräsning för att producera glasartade lameller på nätet från frysta biologiska prover för kryoelektrontomografi.

Förbereda lameller från glaskroppsbiologiska prover med hjälp av ett dubbelstråleskanningselektronmikroskop för kryoelektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Detta protokoll beskriver beredningen av glaskroppslameller av Plasmodium-falciparum-infekterade röda blodkroppar för kryoelektrontomografi. Detta möjliggör direkt observation av detaljerad strukturell information om hur parasiten orsakar malaria. Kryoelektrontomografi registrerar högupplöst information om cellernas insida.Det är tillräckligt kraftfullt för att observera enstaka proteinkomplex in situ, som kan extraheras beräkningsmässigt och medelvärdet för att avslöja tredimensionell strukturell information om proteiner. Detta protokoll kan enkelt anpassas för olika celltyper och kan vara en utgångspunkt för någon som är ny på att producera glaskroppslameller för kryoelektrontomografi. Detta är Alejandra Carbajal, som kommer att genomföra protokollet i dag.För att börja, screena de frusna kopparnäten med en CryoStage för ett ljusmikroskop med särskild uppmärksamhet på isgradienten över gallret. Kontrollera enskilda rutnätsrutor för celltäckning i de tunnare isområdena. Använd en svart outplånlig markör för att markera framsidan och motsatt sida av Cryo-FIB-SEM-specifika Autogrid-fälgar.Ladda det klippta gallret i Cryo-FIB-SEM-skytteln med kolsidan uppåt och applicera en fyra nanometer tjock kol- eller platina e-stråle-stråle-roterande beläggning på cellernas yta. Ladda skytteln i Cryo-FIB-SEM och bedöm cellfördelningen på varje nät med SEM vid fem kilovolt. Ta en översikt över låg förstoring vid 100 effekt för att titta på isgradienter över nätet.Ta sedan bilder med högre förstoring vid 5 000 effekt för att titta på enskilda rutnätrutor. Applicera ett två mikrometer organoplatinaskikt på ytan av varje galler genom att sätta in gasinjektionssystemets nål i kammaren ovanför gallret och värma organoplatinakällan till en inställd temperatur under en viss tid för att producera ett flöde av ånga. För att observera provet, luta provet så att rutnätets plan är ungefär 10 grader från jonstrålens infallsvinkel och flytta mitten av en lämplig rutnätkvadrat som ska ses i både SEM- och FIB-bilderna.med hjälp av jonstrålen vid låg ström, Kartlägg rutnätet med hög förstoring för att visualisera cellerna i mitten av en rutnätkvadrat. Markera ut två rektangulära mönster för att fräsa, ett ovanför och ett under ett tre mikrometer tjockt skyddat område. Välj sedan strålinställningarna och korrigera astigmatism genom att justera ljusstyrkan och kontrasten.När installationen är klar, börja fräsa vid en ström av 300 picoamperes medan du övervakar förloppet i jonstrålevyn och intermittent av SEM. Provet kontrolleras I SEM-vyn och efter den första fräsningen, Om jonstrålen inte har brutit igenom provet ovanför och under det skyddade området, ta bort mer material genom att öka höjden på de rektangulära mönstren. Sluta fräsa när ytan ovanför och under lamellen är helt slät i jonstrålens vy.Upprepa fräsningsprocessen stegvis och minska jonstrålströmmen varje gång tills en tjocklek på 300 nanometer uppnås. Anteckna X Y Z-positionen för varje lamell. För att polera lamellerna i slutet av experimentet, använd en SEM-översikt med låg förstoring för att välja en grupp lameller som ska poleras och markera poleringsroten.När poleringsroten är markerad, minska utrymmet mellan de två rektangulära mönstren till 100 till 200 nanometer och börja poleringen vid en jonstrålström på 30 picoamperes. Övervaka framstegen med SEM vid två till tre kilovolt. Sluta polera när kontrasten i lamellen förloras av SEM eller när organoplatinumbeläggningen eller lamellen själv börjar förlora integritet.Hämta och spara SEM-bilder med låg förstoring av varje lamell. Efter avslutad experiment, ta bort skytteln från mikroskopet. Ta bort gallret med lameller och förvara dem under flytande kväve.Hantera gallren med försiktighet. För att studera morfologi stoppades schizonterna vid olika stadier av utgång med användning av förening två i E-64-hämmare. I närvaro av förening två var gränsen mellan de parasitofora membranen och det omgivande hemoglobinet i värdens röda blodkroppar väldefinierad.Den intakta parasitofora vakuolen, eller PV, var packad med merozoiter i ett enda kluster av hemozoinkristaller. När förening två synkroniserade schizonter tvättades i E-64 sprack PV-membranet och merozoiterna spreds ut inom RBC. Ett typiskt exempel på god cellfördelning på ett kopparnät visar stora röda blodkroppar med en väldefinierad periferi och ett intakt vakuolmembran.Inom en delvis kollapsad värd röd blodcell visualiserades de enskilda merozoiterna som små cellkluster. Varje schizont hade en svart fläck i mitten som indikerar hemozoinkristallernas position. Efter fräsning laddades gallren in i TEM för att identifiera lamellernas positioner och hitta lämpliga områden att rikta in sig på med tomografi.I provmikrografen kan en RBC som nyligen invaderats av en merozoit ses. Merozoiten omgiven av värdcell-härledda membranet kunde ses inom gränsen för RBC. Vid den apikala änden av merozoiten var de två membranen som omger cellen och fyra membran staplade i toppen av merozoiten associerad med en elektrontät svampformad egenskap tydligt synliga.Inom cytoplasman hos merozoiten identifierades en fusionshändelse mellan merozoitplasmamembranet och en flerskiktad vesikel. I en ytterligare TEM-analys av en 230 nanometer tjock lamell observerades den typiska morfologin hos en mogen merozoit behandlad med E-64. Inom det röda blodkroppsmembranet kan merozoitplasmamembranet ses med organeller som det inre membrankomplexet, polära ringar, mikronemer, rhoptries och kärnhöljet.Den viktigaste delen av denna teknik är att optimera gallren för att möjliggöra reproducerbar och effektiv produktion av tunna lameller. Vidareutveckling av denna teknik kommer att göra det möjligt för forskare att visualisera enproteinmolekyler inom malariala parasiter och bestämma deras roll i malarial utgång.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Användning av elektron paramagnetiska resonans i biologiska prover vid omgivningstemperatur och 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Snabb gallerförberedelse för tidsupp lös Cryo-Electron mikroskopi

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Förberedelse och Kryo-FIB mikromachining av Saccharomyces cerevisiae för Cryo-Electron Tomography

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Single Particle Cryo-Electron Mikroskopi: Från prov till struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Mikropapper transmission elektronmikroskopinät till direkt cellpositionering inom arbetsflöden för hela cell cryo-elektrontomografi

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Ett robust arbetsflöde för bearbetning av kryo-elektronmikroskopi med en partikel (kryo-EM) med kryoSPARC, RELION och Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Beredning av nukleosomkärnpartiklar komplexerade med DNA-reparationsfaktorer för kryoelektronmikroskopi Strukturell bestämning

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Extrahera modifierade mikrotubuli från däggdjursceller för att studera mikrotubuli-proteinkomplex med kryoelektronmikroskopi

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Tillämpning av monolagergrafen på kryoelektronmikroskopinät för högupplöst strukturbestämning

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...