Name: analysis of motility patterns of stentor during and after oral apparatus regeneration using cell tracking
Uploaded: 2021-04-26T15:00:00
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这项工作得到了海洋生物实验室惠特曼早期职业奖学金（JYS）的部分支持。我们感谢埃文·伯恩斯、米特·帕特尔、梅兰妮·梅洛和斯凯拉·威德曼帮助进行了一些初步分析和代码测试。我们感谢马克·斯拉博德尼克的讨论和建议。WFM感谢NIH拨款R35 GM130327的支持。

注意：根据先前发表的JoVE方案8培养了大约100个科鲁勒斯链球菌细胞。
1. 样品制备
<ol><li>切割一块250μm厚的硅胶间隔片（材料表），其高度和宽度都比显微镜载玻片略小。使用 5/16“ 打孔机，创建圆形孔。注意在相邻的井之间留出足够的空间，以确保良好的密封性。 注：发现相邻井之间3毫米的空间就足够了。通过练习，可以将十口孔...

<ol>
	<li>Lillie, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+smallest+parts+of+stentor+capable+of+regeneration;+a+contribution+on+the+limits+of+divisibility+of+living+matter.">On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter.</a> Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+proportionate+structures+in+Stentor.">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).</li><li>Tartar, V., Kerkut, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biology of Stentor. , (1961).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+of+Stentor+coeruleus+to+certain+substances+added+to+the+medium.">Reactions of Stentor coeruleus to certain substances added to the medium.</a> Experimental Cell Research. 13 (2), 317-332 (1957).</li><li>Kelleher, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+model+for+microtubule+polymerization+during+oral+regeneration+in+Stentor+coeruleus.">A kinetic model for microtubule polymerization during oral regeneration in Stentor coeruleus.</a> Biosystems. 9 (4), 269-279 (1977).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+regulator+Mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+Stentor+morphogenesis.">The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis.</a> PLOS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).</li><li>Wan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+complex+ciliary+flows+around+regenerating+Stentor+coeruleus.">Reorganization of complex ciliary flows around regenerating Stentor coeruleus.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 375 (1792), 20190167 (2020).</li><li>Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+regeneration+in+Stentor.">Methods for the study of regeneration in Stentor.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (136), e57759 (2018).</li><li>Sood, P., McGillivary, R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+program+of+regeneration+in+the+giant+single+cell,+Stentor+coeruleus.">The transcriptional program of regeneration in the giant single cell, Stentor coeruleus.</a> bioRxiv. , 240788 (2017).</li><li>Onsbring, H., Jamy, M., Ettema, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+Stentor+cell+fragments+reveals+transcriptional+changes+during+cellular+regeneration.">RNA sequencing of Stentor cell fragments reveals transcriptional changes during cellular regeneration.</a> Current Biology. 28 (8), 1281-1288 (2018).</li></ol>

目前存在许多粒子和细胞跟踪算法，其中一些是完全免费的。成本和用户友好性通常是需要妥协的权衡。此外，许多现有的细胞跟踪程序被设计为跟踪组织培养细胞的缓慢爬行运动，而不是Stentor的快速游泳运动， Stentor在游泳时旋转并可能经历突然的方向变化。在测试了许多这些选项之后，这里介绍的协议旨在成为一站式解决方案，仅使用低成本设备和单个科学软件包（材料表</strong...

Stentor coeruleus （Stentor）是一种众所周知的模式生物，由于其体积大，能够承受多种显微外科技术并且易于在实验室环境中培养，因此已被用于研究单细胞再生1，2，3。早期的再生研究集中在 Stentor中最大和形态上最独特的特征 - OA - 它在化学休克4，5，6时完全脱落。从 头 替换丢失的OA始于新膜束带的出现 - 一组纤毛，在八个形态阶段形成功能性OA之前逐渐向细胞前部移动3。无论温度如何，这些阶段都是按顺序观察到的，并为几乎所有研究提供了通用参考点5。
Stentor再生的机械分析需要用于测量再生时间的工具，这些工具足够坚固且简单，可以作为化学或分子筛选的一部分应用于多个样品。进行基于细胞的测定的标准方法是成像，在这种情况下，在再生过程中成像新OA的形成。然而，当再生结构包含可用作标记物的不同分子组分时，这种基于成像的测定是最有效的，因此它们很容易在荧光图像中检测到。在Stentor OA的情况下，已知的成分（纤毛，基底体）也存在于细胞表面的其余部分;因此，识别OA的恢复不能仅仅通过寻找组件的存在与否来实现。
相反，需要某种形式的形状识别来检测OA，鉴于 Stentor 细胞经常通过快速收缩过程改变形状，这可能非常具有挑战性。本文提出了一种依赖于身体和OA纤毛的运动活性的再生替代测定方法。随着OA的再生，新形成的纤毛在位置和活性上经历可重复的变化，这反过来又会影响细胞的游动性。通过分析运动性，可以进行“功能再生”的测定，通过量化再生结构的功能来量化再生。先前对再生过程中 Stentor 纤毛功能的分析使用粒子图像测速法，结合添加到外部介质中的示踪剂珠，以观察再生不同阶段流动模式的变化7;然而，这种方法需要对单个细胞及其相关的流场进行费力的成像，一次一个。
通过使用细胞本身的运动作为纤毛生成流动的代理，可以使用与高通量筛选平台兼容的低分辨率成像系统并行分析大量细胞。原则上，该测定可用于研究其他游泳生物体在数百微米至毫米大小的规模的发育和功能再生。该协议的第1部分描述了多孔样品载玻片的构造，该载玻片允许在长达一整天的时间内对细胞群进行高通量成像。提供了有关如何调整以用于其他细胞类型的详细信息。该协议的第2部分涵盖了该测定的视频数据的采集，这可以在带有数字单镜头反光相机的解剖显微镜上完成。该协议的第3部分提供了使用MATLAB代码（补充信息）进行细胞跟踪和细胞速度计算的演练。该协议的第4部分解释了如何将数字结果转换为图1C-F和图2C所示的图，以便于解释结果。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25 mm-thick silicone sheet</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>CWS-S-0.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm, #1.5 coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1034527</td>
			<td>As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We used Nikon D750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas 137c WT strain</td>
			<td>Chlamydomonas Resource Center</td>
			<td>CC-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MATHWORKS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Image Processing Toolbox</td>
			<td>MATHWORKS</td>
			<td></td>
			<td>needed for TrackCells.m and CleanTraces.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox</td>
			<td>MATHWORKS</td>
			<td></td>
			<td>needed for TrackCells.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with camera port</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteurized Spring Water</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>132458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Growth Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1379801</td>
			<td>Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of motility patterns of stentor during and after oral apparatus regeneration using cell tracking

鞘翅目 是一种著名的单细胞再生研究模式生物。单个细胞的转录组学分析揭示了数百个基因 - 许多与口腔器官（OA）无关 - 这些基因在整个再生过程中的各个阶段受到差异调节。据推测，这种系统性重组和细胞资源向新OA生长的动员将导致运动和行为的可观察到的变化，这些变化与差异基因表达的各个阶段相对应。然而， Coeruleus 的形态复杂性使得有必要开发一种测定方法来捕获统计数据和时间尺度。使用自定义脚本在短视频中跟踪细胞，并在大量群体（N ~100）上编译统计数据。在OA丧失后， 科鲁勒斯链球菌 最初失去定向运动的能力;然后从~4小时开始，它表现出速度的显着下降，直到〜8小时。该测定法为筛选运动表型提供了有用的工具，并且可以适用于其他生物体的研究。

该测定的目的是量化运动模式的逐渐变化和大型（N〜100）再生Stentor群体中细胞运动速度的逐步增加。为了帮助解释结果，该协议中包含的自定义代码生成两种类型的图：一组视频数据中所有细胞运动迹线的叠加（图1C-F和图S1），以及自再生开始以来按小时划分的游泳速度图（图2C）。正常再生的Stentor</em...

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Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

我们提出了一种方案，用于使用明场显微镜和细胞跟踪来表征数百微米至毫米级细胞群的运动性和行为。该测定表明，在再生丢失的口腔器械时， Stentor coeruleus 通过四个行为上不同的阶段过渡。

使用细胞追踪分析口腔器械再生期间和之后的张力模式

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds ...

长期以来，桫椤一直被用作了解单细胞再生的模式生物。虽然视觉形态再生的时间表是已知的，但功能再生的时间表仍然未知。该测定跟踪经历同步再生的中心群体的运动，以便可以量化损失函数的恢复。它可以适应与其他细胞类型一起使用。成像室缺乏安全密封将导致孔相互泄漏或在孔内形成气泡。对于不熟悉使用硅胶垫片的研究人员，我们强烈建议在使用前将PSW或其他清洁介质移液到每个孔中以测试泄漏。样品室的结构比口头描述更容易显示。从采集的视频数据中提取运动模式的过程也是如此。首先，切一块250微米厚的硅胶间隔片，其高度和宽度都比显微镜载玻片略小。使用整个冲头来创建圆形井，在相邻的井之间留出足够的空间，以确保良好的密封性。通过将弯曲体细胞在10%蔗糖或2%尿中孵育两分钟来启动口腔设备的再生。然后用新鲜培养基洗涤三次。轻轻移液约10个扩口器到每个孔中。注意使样品体积与孔体积尽可能匹配。从一个边缘开始，轻轻地将一块盖板玻璃放在孔上，关闭孔。使用狭窄且略微柔韧的物体，例如10微升移液器吸头，将其压在与硅胶片接触的盖玻片上，以确保良好的密封性。将样品放在显微镜载物台上，并将显微镜设置为最低的可用放大倍率，以便一个很好地适合框架。开始延时拍摄，并在每个时间点以每秒30帧的速度获取10秒的视频。要进行校准，请以与视频相同的放大倍率设置获取校准载玻片的清晰图像或清晰的标尺。使用任何图像查看程序，计算已知物理距离的标记之间的像素数。下载两个脚本，跟踪单元格和清理跟踪到计算机上易于记忆的位置，并将数据视频传输到此计算机。将数据视频组织到文件夹中。每个时间点一个。使用脚本跟踪单元格在数据视频中执行自动单元格跟踪，方法是打开跟踪单元格并运行脚本 选择添加到路径“如果弹出窗口提示，这通常仅在脚本首次从给定文件夹运行时发生。出现提示时，选择一个或多个数据视频以启动跟踪。导航到数据视频，一旦对文件列表感到满意，请单击“打开”“要手动拒绝异常或虚假跟踪，请在MATLAB编辑器窗口中双击文件以打开干净的跟踪。在提示符下，选择跟踪单元格输出的数据文件夹。导航到其中一个创建的文件夹并选择它。出现提示时，输入 1 以保留跟踪，输入零以拒绝跟踪。然后按 Enter 键继续执行下一个跟踪。首先下载标题为意大利面条情节的脚本。打开并运行脚本。当文件浏览器窗口弹出提示时，选择要打开的文件夹。导航到其中一个时间点的文件夹。出现提示时，校准，每毫米的像素数是多少？输入校准值并按回车键。根据需要通过更改脚本的第 55 行来调整绘图的轴，默认情况下，该行设置为 RR 等于 4。包括半径最大为四毫米。保存绘图。结果显示了在进入口腔器官再生过程的2、3、7和8小时时，stentor细胞群的集体运动性。这些图显示了运动个体数量的预期增加和群体中运动性最强的细胞范围的四倍增加。最快的游泳细胞，如果开始靠近边缘，则被限制完全在一条直线上游泳，并且它们的运动范围看起来更小。将支路细胞分为三个不同的类别，非运动性，无可见保持快速，非运动性，可见保持快速和运动。结果显示了一个堆叠直方图，总结了这些类别中的相对细胞计数，作为我们再生的函数。在后来的时间里，在具有可见的禁食的菌落中发现了大量细胞，强烈表明它们已经探索了环境并优先附着在同类中的其他细胞附近。重要的是要选择适合直径约1毫米的试样孔尺寸。这包括直径为5/16英寸的硅胶垫片厚度，以及每孔10个细胞。在将此方案适用于其他细胞类型时，应调整这些数字。该测定可以与RNA-I一起进行，以研究和比较不同张子表型的再生。

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

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科研

生物学

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