Name: analysis of motility patterns of stentor during and after oral apparatus regeneration using cell tracking
Uploaded: 2021-04-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af Marine Biological Laboratory Whitman Early Career Fellowship (JYS). Vi anerkender Evan Burns, Mit Patel, Melanie Melo og Skylar Widman for at hjælpe med nogle af de indledende analyser og kodetest. Vi takker Mark Slabodnick for diskussion og forslag. WFM anerkender støtte fra NIH-bevilling R35 GM130327.

BEMÆRK: En population på ca. hundrede S. coeruleus-celler blev dyrket i overensstemmelse med en tidligere offentliggjort JoVE-protokol8.
1. Forberedelse af prøve
<ol><li>Skær et stykke 250 μm tykt silikone afstandsark (Table of Materials) lidt mindre i både højde og bredde end et mikroskopglas. Brug en 5/16 "hulstans til at skabe cirkulære brønde. Vær opmærksom på at efterlade tilstrækkelig plads mellem nabobrønde for at sikre e...

<ol>
	<li>Lillie, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+smallest+parts+of+stentor+capable+of+regeneration;+a+contribution+on+the+limits+of+divisibility+of+living+matter.">On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter.</a> Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+proportionate+structures+in+Stentor.">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).</li><li>Tartar, V., Kerkut, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biology of Stentor. , (1961).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+of+Stentor+coeruleus+to+certain+substances+added+to+the+medium.">Reactions of Stentor coeruleus to certain substances added to the medium.</a> Experimental Cell Research. 13 (2), 317-332 (1957).</li><li>Kelleher, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+model+for+microtubule+polymerization+during+oral+regeneration+in+Stentor+coeruleus.">A kinetic model for microtubule polymerization during oral regeneration in Stentor coeruleus.</a> Biosystems. 9 (4), 269-279 (1977).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+regulator+Mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+Stentor+morphogenesis.">The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis.</a> PLOS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).</li><li>Wan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+complex+ciliary+flows+around+regenerating+Stentor+coeruleus.">Reorganization of complex ciliary flows around regenerating Stentor coeruleus.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 375 (1792), 20190167 (2020).</li><li>Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+regeneration+in+Stentor.">Methods for the study of regeneration in Stentor.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (136), e57759 (2018).</li><li>Sood, P., McGillivary, R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+program+of+regeneration+in+the+giant+single+cell,+Stentor+coeruleus.">The transcriptional program of regeneration in the giant single cell, Stentor coeruleus.</a> bioRxiv. , 240788 (2017).</li><li>Onsbring, H., Jamy, M., Ettema, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+Stentor+cell+fragments+reveals+transcriptional+changes+during+cellular+regeneration.">RNA sequencing of Stentor cell fragments reveals transcriptional changes during cellular regeneration.</a> Current Biology. 28 (8), 1281-1288 (2018).</li></ol>

Der findes i øjeblikket mange partikel- og cellesporingsalgoritmer, nogle helt gratis. Omkostninger og brugervenlighed er ofte kompromiser, der kræver kompromis. Derudover er mange af de eksisterende cellesporingsprogrammer designet til at spore langsom kravlende bevægelse af vævskulturceller snarere end stentors hurtige svømmebevægelse, som roterer under svømning og kan gennemgå pludselige retningsændringer. Efter at have testet mange af disse muligheder er protokollen, der præsenteres her, beregnet t...

Stentor coeruleus (Stentor) er en velkendt modelorganisme, der er blevet brugt til at studere encellet regenerering på grund af dens store størrelse, evne til at modstå flere mikrokirurgiske teknikker og lette dyrkning i en laboratorieindstilling 1,2,3. Tidlige regenereringsundersøgelser fokuserede på det største og mest morfologisk forskellige træk i Stentor - OA - som kastes fuldstændigt på kemisk chok 4,5,6. De novo udskiftning af en tabt OA begynder med fremkomsten af et nyt membranellarbånd - en række cilia, der gradvist skifter mod den forreste del af cellen, før de danner en funktionel OA over otte morfologiske stadier3. Disse stadier er blevet observeret sekventielt, uanset temperatur, og giver et universelt referencepunkt for næsten alle undersøgelser5.
Mekanistisk analyse af Stentor-regenerering kræver værktøjer til måling af tidspunktet for regenerering, der er robuste og enkle nok til at blive anvendt på flere prøver som en del af en kemisk eller molekylær skærm. Standardmetoden til udførelse af et cellebaseret assay er billeddannelse, i dette tilfælde billeddannelse af dannelsen af ny OA under regenerering. Sådanne billedbaserede assays er imidlertid mest effektive, når den regenererende struktur indeholder forskellige molekylære komponenter, der kan bruges som markører, så de let kan detekteres i et fluorescensbillede. I tilfælde af Stentor OA er de kendte komponenter (cilia, basale kroppe) også til stede på resten af celleoverfladen; derfor kan anerkendelse af genoprettelsen af OA ikke opnås blot ved at lede efter tilstedeværelsen eller fraværet af en komponent.
Snarere ville en formgenkendelse være påkrævet for at detektere en OA, og dette er potentielt meget udfordrende i betragtning af det faktum, at Stentor-celler ofte ændrer form via en hurtig kontraktil proces. Dette papir præsenterer et alternativt assay til regenerering, der er afhængig af kroppens bevægelige aktivitet og OA-cilia. Når OA regenererer, gennemgår de nydannede cilier reproducerbare ændringer i position og aktivitet, hvilket igen påvirker cellens svømmemotilitet. Ved at analysere bevægelighed er det muligt at udføre et assay for "funktionel regenerering", der kvantificerer regenerering ved at kvantificere funktionen af de regenererede strukturer. Tidligere analyse af Stentor ciliary funktion under regenerering anvendte partikelbilled velocimetri kombineret med sporstofperler tilsat til det eksterne medie for at observere ændringer i strømningsmønster på forskellige stadier af regenerering7; Denne tilgang kræver imidlertid besværlig billeddannelse af individuelle celler og deres tilknyttede strømningsfelter, en ad gangen.
Ved at bruge selve cellens bevægelse som en proxy for cilia-genereret flow ville det være muligt at analysere et større antal celler parallelt ved hjælp af billeddannelsessystemer med lav opløsning, der er kompatible med screeningsplatforme med høj kapacitet. Dette assay kan i princippet bruges til at studere udvikling og funktionel regenerering i andre svømmeorganismer i hundredvis af mikrometer til millimeter størrelse skala. Afsnit 1 i protokollen beskriver konstruktionen af et multiwell-prøveglas, som muliggør billeddannelse med høj kapacitet af en population af celler over op til en hel dag. Der gives oplysninger om, hvordan du justerer til brug med andre celletyper. Afsnit 2 i protokollen dækker erhvervelse af videodata til dette assay, som kan udføres på et dissektionsmikroskop med et digitalt spejlreflekskamera med en enkelt linse. Afsnit 3 i protokollen giver en gennemgang af cellesporing og cellehastighedsberegning ved hjælp af MATLAB-kode (supplerende oplysninger). Afsnit 4 i protokollen forklarer, hvordan man omdanner de numeriske resultater til plots som vist i figur 1C-F og figur 2C for nem fortolkning af resultaterne.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25 mm-thick silicone sheet</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>CWS-S-0.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm, #1.5 coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1034527</td>
			<td>As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We used Nikon D750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas 137c WT strain</td>
			<td>Chlamydomonas Resource Center</td>
			<td>CC-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MATHWORKS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Image Processing Toolbox</td>
			<td>MATHWORKS</td>
			<td></td>
			<td>needed for TrackCells.m and CleanTraces.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox</td>
			<td>MATHWORKS</td>
			<td></td>
			<td>needed for TrackCells.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with camera port</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteurized Spring Water</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>132458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Growth Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1379801</td>
			<td>Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of motility patterns of stentor during and after oral apparatus regeneration using cell tracking

Stentor coeruleus er en velkendt modelorganisme til undersøgelse af encellet regenerering. Transkriptomisk analyse af individuelle celler afslørede hundredvis af gener - mange ikke forbundet med det orale apparat (OA) - der er differentieret reguleret i faser gennem regenereringsprocessen. Det blev antaget, at denne systemiske omorganisering og mobilisering af cellulære ressourcer mod vækst af en ny OA vil føre til observerbare ændringer i bevægelse og adfærd svarende i tid til faserne af differentiel genekspression. Den morfologiske kompleksitet af S. coeruleus nødvendiggjorde imidlertid udviklingen af et assay for at fange statistikken og tidsskalaen. Et brugerdefineret script blev brugt til at spore celler i korte videoer, og statistikker blev udarbejdet over en stor befolkning (N ~ 100). Ved tab af OA mister S. coeruleus oprindeligt evnen til rettet bevægelse; derefter starter ved ~ 4 timer, udviser det et betydeligt fald i hastighed indtil ~ 8 timer. Dette assay giver et nyttigt værktøj til screening af motilitetsfænotyper og kan tilpasses til undersøgelse af andre organismer.

Målet med dette assay er at kvantificere den gradvise ændring af bevægelsesmønstre og gradvis stigning i bevægelseshastighed fra celler inden for en stor (N ~ 100) regenererende Stentor-population. For at hjælpe med fortolkningen af resultaterne genererer den brugerdefinerede kode, der er inkluderet i denne protokol, to typer plots: en overlejring af alle cellebevægelsesspor i et sæt videodata (figur 1C-F og figur S1) og et ...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking at JoVE.com

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

Vi præsenterer en protokol til karakterisering af bevægelighed og opførsel af en population på hundrede mikron- til millimeterstore celler ved hjælp af brightfieldmikroskopi og cellesporing. Dette assay afslører, at Stentor coeruleus overgår gennem fire adfærdsmæssigt forskellige faser, når man regenererer et tabt oralt apparat.

Analyse af stentors motilitetsmønstre under og efter oral apparatregenerering ved hjælp af cellesporing

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds ...

Stentor coeruleus har længe været anvendt som en modelorganisme til at forstå encellet regenerering. Mens tidslinjen for visuel morfologisk regenerering er kendt, forbliver tidslinjen for funktionel regenerering ukendt. Dette assay sporer motiliteten af centerpopulationen, der gennemgår synkroniseret regenerering, således at genopretningen af tabsfunktionen kan kvantificeres.Det kan tilpasses til brug med andre celletyper. Manglen på en sikker tætning af billedkammeret vil resultere i, at brønde lækker ind i hinanden eller luftbobler dannes inde i brøndene. For forskere, der ikke er bekendt med brugen af silikone afstandsstykker, anbefaler vi kraftigt, at PSW eller andet rent medium pipetteres i hver af brøndene for at teste for lækage før brug.Konstruktionen af prøvekamrene er lettere vist end verbalt beskrevet. Ligesom processen til udvinding af motilitetsmønstre fra de erhvervede videodata. Til at begynde med skal du skære et stykke 250 mikrometer tykt silikoneafstandsark lidt mindre i både højde og bredde end et mikroskopglas.Brug en hel stans til at skabe cirkulære brønde, der efterlader tilstrækkelig plads mellem nabobrønde for at sikre en god tætning. Initier regenerering af oralt apparatur ved at inkubere stentor coeruleusceller i 10% saccharose eller 2% uria i to minutter. Vask derefter tre gange med frisk medium.Pipetter forsigtigt ca. 10 stentor i hver brønd. Sørg for at matche prøvevolumenet til brøndvolumenet så tæt som muligt. Luk brøndene ved forsigtigt at sænke et stykke dækglas over brøndene startende fra den ene kant.Brug en smal og let fleksibel genstand, såsom en 10 mikroliter pipettespids til at trykke ned på dækglasset, hvor det kommer i kontakt med silikonepladen for at sikre en god tætning. Placer prøven på mikroskopstadiet og indstil mikroskopet til den laveste tilgængelige forstørrelse, så man passer godt ind i rammen. Begynd tidsforløbet, og få en ti sekunders video med 30 billeder i sekundet af hver brønd på hvert tidspunkt.For at kalibrere skal du få et klart billede af et kalibreringsdias eller en klar lineal med de samme forstørrelsesindstillinger som videoerne. Brug et hvilket som helst billedvisningsprogram til at tælle antallet af pixels mellem mærker med en kendt fysisk afstand. Download de to scripts, spor celler og rengør spor til en let at huske placering på computeren, og overfør også datavideoerne til denne computer.Organiser datavideoerne i mapper. En for hvert tidspunkt. Brug scriptsporcellerne til at udføre automatiseret cellesporing i datavideoerne ved at åbne sporceller og køre scriptet Vælg tilføj til sti "hvis du bliver bedt om det af et popup-vindue, hvilket typisk kun sker, når scriptet køres for første gang fra en given mappe.Når du bliver bedt om det, skal du vælge en eller flere datavideoer for at starte sporing. Naviger til datavideoerne, og når du er tilfreds med listen over filer, skal du klikke på åben"For manuelt at afvise uregelmæssige eller falske spor skal du åbne rene spor i MATLAB-editorvinduet ved at dobbeltklikke på filen. Ved prompten skal du vælge datamappeoutput med sporceller.Naviger til en af de oprettede mapper, og vælg den. Når du bliver bedt om det, skal du indtaste en for at beholde sporingen og nul for at afvise sporingen. Tryk derefter på enter for at gå videre til den næste sporing.Begynd med at downloade scriptet med titlen spaghetti plots. Åbn og kør scriptet. Når filbrowservinduet vises med prompten, skal du vælge mappe, der skal åbnes.Naviger til mappen på et af tidspunkterne. Når du bliver bedt om kalibrering, hvad er antallet af pixels pr. Millimeter? Indtast kalibreringsværdien, og tryk på enter.Juster plotets akser efter behov ved at ændre linje 55 i scriptet, som som standard er indstillet til RR er lig med fire. for at inkludere en radius på op til fire millimeter. Gem plottet.Resultaterne viser den kollektive bevægelighed af stentorcellepopulationen ved to, tre, syv og otte timer i den orale apparatregenereringsproces. Disse plot viser både den forventede stigning i antallet af bevægelige individer og den firedobbelte stigning i rækken af de mest bevægelige celler i befolkningen. De hurtigste svømmeceller, hvis de startes tæt på kanten, er begrænset fra at svømme helt i en lige linje, og deres bevægelsesområde ser mindre ud.Kanalcellerne blev klassificeret i tre forskellige kategorier, ikke-bevægelige uden synligt hold fast, ikke-bevægelige med synlige hold fast og bevægelige. Resultatet viste et stablet histogram, der opsummerede relative celletal på tværs af disse kategorier som en funktion af vores til regenerering. På senere tidspunkter blev der fundet et betydeligt antal celler i kolonier med synlige faste, der stærkt tyder på, at de havde udforsket miljøet og fortrinsvis knyttet sig til andre af deres art.Det er vigtigt at vælge prøvebrønddimensionerne, der fungerer godt for stentor coeruleus, som er cirka en millimeter i størrelse. Dette inkluderer silikoneafstandstykkelse 5/16 tommer i diameter og 10 celler pr. Brønd. Disse tal skal justeres, når denne protokol tilpasses til andre celletyper.Dette assay kan udføres sammen med RNA-I for at undersøge og sammenligne regenerering af forskellige stentorfænotyper.

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

Human pluripotent stem cells (hPSCs) that include human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are exciting cell ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Kvantitativ analyse af Random migration af celler Brug af Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimeret farvning og spredning modelleringsmetoder for celledeling Overvågning ved hjælp cellesporing Farvestoffer

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hurtig genetisk analyse af Epithelial-mesenkyme Signaling Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Cellesporing hjælp Photoconvertible proteiner under zebrafisk Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Temporal Sporing af cellecyklusprogression anvendelse af flowcytometri uden behov for synkronisering

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET Imaging i Tre-dimensionelle Hydrogeler

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...