Name: analysis of motility patterns of stentor during and after oral apparatus regeneration using cell tracking
Uploaded: 2021-04-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking at JoVE.com

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door Marine Biological Laboratory Whitman Early Career Fellowship (JYS). We erkennen Evan Burns, Mit Patel, Melanie Melo en Skylar Widman voor hun hulp bij een deel van de voorlopige analyse en codetests. Wij danken Mark Slabodnick voor de discussie en suggesties. WFM erkent steun van NIH-subsidie R35 GM130327.

OPMERKING: Een populatie van ongeveer honderd S. coeruleuscellen werd gekweekt in overeenstemming met een eerder gepubliceerd JoVE-protocol8.
1. Monstervoorbereiding
<ol><li>Snijd een stuk van 250 μm dik siliconen afstandsblad (Table of Materials) iets kleiner in zowel hoogte als breedte dan een microscoopglaasje. Maak met behulp van een 5/16"-perforator cirkelvormige putten. Houd er rekening mee dat u voldoende ruimte tussen naburige putten...

<ol>
	<li>Lillie, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+smallest+parts+of+stentor+capable+of+regeneration;+a+contribution+on+the+limits+of+divisibility+of+living+matter.">On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter.</a> Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+proportionate+structures+in+Stentor.">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).</li><li>Tartar, V., Kerkut, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biology of Stentor. , (1961).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+of+Stentor+coeruleus+to+certain+substances+added+to+the+medium.">Reactions of Stentor coeruleus to certain substances added to the medium.</a> Experimental Cell Research. 13 (2), 317-332 (1957).</li><li>Kelleher, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+model+for+microtubule+polymerization+during+oral+regeneration+in+Stentor+coeruleus.">A kinetic model for microtubule polymerization during oral regeneration in Stentor coeruleus.</a> Biosystems. 9 (4), 269-279 (1977).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+regulator+Mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+Stentor+morphogenesis.">The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis.</a> PLOS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).</li><li>Wan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+complex+ciliary+flows+around+regenerating+Stentor+coeruleus.">Reorganization of complex ciliary flows around regenerating Stentor coeruleus.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 375 (1792), 20190167 (2020).</li><li>Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+regeneration+in+Stentor.">Methods for the study of regeneration in Stentor.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (136), e57759 (2018).</li><li>Sood, P., McGillivary, R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+program+of+regeneration+in+the+giant+single+cell,+Stentor+coeruleus.">The transcriptional program of regeneration in the giant single cell, Stentor coeruleus.</a> bioRxiv. , 240788 (2017).</li><li>Onsbring, H., Jamy, M., Ettema, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+Stentor+cell+fragments+reveals+transcriptional+changes+during+cellular+regeneration.">RNA sequencing of Stentor cell fragments reveals transcriptional changes during cellular regeneration.</a> Current Biology. 28 (8), 1281-1288 (2018).</li></ol>

Er bestaan momenteel veel algoritmen voor het volgen van deeltjes en cellen, sommige volledig gratis. Kosten en gebruiksvriendelijkheid zijn vaak afwegingen die compromissen vereisen. Bovendien zijn veel van de bestaande celvolgprogramma's ontworpen om de langzame kruipbeweging van weefselkweekcellen te volgen, in plaats van de snelle zwembeweging van Stentor, die tijdens het zwemmen roteert en plotselinge richtingsveranderingen kan ondergaan. Na het testen van veel van deze opties, is het hier gepresenteerde pr...

Stentor coeruleus (Stentor) is een bekend modelorganisme dat is gebruikt om eencellige regeneratie te bestuderen vanwege zijn grote omvang, vermogen om verschillende microchirurgische technieken te weerstaan en het gemak van kweken in een laboratoriumomgeving 1,2,3. Vroege regeneratiestudies richtten zich op het grootste en meest morfologisch onderscheidende kenmerk in Stentor - de OA - die volledig wordt afgeworpen op chemische shock 4,5,6. De novo vervanging van een verloren artrose begint met de opkomst van een nieuwe membraanllarband - een reeks trilharen die geleidelijk naar de voorste van de cel verschuiven voordat ze een functionele artrose vormen gedurende acht morfologische stadia3. Deze stadia zijn sequentieel waargenomen, ongeacht de temperatuur, en vormen een universeel referentiepunt voor bijna alle onderzoeken5.
Mechanistische analyse van Stentor-regeneratie vereist hulpmiddelen voor het meten van de timing van regeneratie die robuust en eenvoudig genoeg zijn om op meerdere monsters te worden toegepast als onderdeel van een chemisch of moleculair scherm. De standaardmethode voor het uitvoeren van een celgebaseerde test is beeldvorming, in dit geval het in beeld brengen van de vorming van nieuwe artrose tijdens regeneratie. Dergelijke op beeldvorming gebaseerde testen zijn echter het meest effectief wanneer de regenererende structuur verschillende moleculaire componenten bevat die als markers kunnen worden gebruikt, zodat ze gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd in een fluorescentiebeeld. In het geval van de Stentor OA zijn de bekende componenten (trilharen, basale lichamen) ook aanwezig op de rest van het celoppervlak; daarom kan het erkennen van het herstel van de OA niet worden bereikt door simpelweg te zoeken naar de aan- of afwezigheid van een component.
Integendeel, een vorm van vormherkenning zou nodig zijn om een artrose te detecteren, en dit is potentieel zeer uitdagend gezien het feit dat Stentor-cellen vaak van vorm veranderen via een snel contractiel proces. Dit artikel presenteert een alternatieve test voor regeneratie die afhankelijk is van de beweeglijke activiteit van het lichaam en OA-trilharen. Naarmate de OA regenereert, ondergaan de nieuw gevormde trilharen reproduceerbare veranderingen in positie en activiteit, die op hun beurt de zwemmotiliteit van de cel beïnvloeden. Door de beweeglijkheid te analyseren, is het mogelijk om een test uit te voeren voor "functionele regeneratie" die regeneratie kwantificeert door de functie van de geregenereerde structuren te kwantificeren. Eerdere analyse van de stentoriële functie tijdens de regeneratie maakte gebruik van deeltjesbeeld velocimetrie, gecombineerd met tracerparels toegevoegd aan de externe media, om veranderingen in het stromingspatroon in verschillende stadia van regeneratie waar te nemen7; deze aanpak vereist echter een moeizame beeldvorming van individuele cellen en hun bijbehorende stroomvelden, één voor één.
Door de beweging van de cel zelf te gebruiken als een proxy voor door trilharen gegenereerde stroom, zou het mogelijk zijn om grotere aantallen cellen parallel te analyseren, met behulp van beeldvormingssystemen met lage resolutie die compatibel zijn met screeningplatforms met hoge doorvoer. Deze test kan in principe worden gebruikt om ontwikkeling en functionele regeneratie in andere zwemmende organismen te bestuderen op een schaal van honderden micron tot millimeters. Sectie 1 van het protocol beschrijft de constructie van een multiwell-monsterdia, die een high-throughput beeldvorming van een populatie cellen over maximaal een hele dag mogelijk maakt. Er worden details gegeven over hoe u kunt aanpassen voor gebruik met andere celtypen. Sectie 2 van het protocol heeft betrekking op het verzamelen van videogegevens voor deze test, die kan worden uitgevoerd op een dissectiemicroscoop met een digitale spiegelreflexcamera met één lens. Sectie 3 van het protocol biedt een overzicht van celtracking en celsnelheidsberekening met behulp van MATLAB-code (aanvullende informatie). In hoofdstuk 4 van het protocol wordt uitgelegd hoe de numerieke resultaten kunnen worden omgezet in plots zoals weergegeven in figuur 1C-F en figuur 2C voor eenvoudige interpretatie van de resultaten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25 mm-thick silicone sheet</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>CWS-S-0.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm, #1.5 coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1034527</td>
			<td>As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We used Nikon D750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas 137c WT strain</td>
			<td>Chlamydomonas Resource Center</td>
			<td>CC-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MATHWORKS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Image Processing Toolbox</td>
			<td>MATHWORKS</td>
			<td></td>
			<td>needed for TrackCells.m and CleanTraces.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox</td>
			<td>MATHWORKS</td>
			<td></td>
			<td>needed for TrackCells.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with camera port</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteurized Spring Water</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>132458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Growth Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1379801</td>
			<td>Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of motility patterns of stentor during and after oral apparatus regeneration using cell tracking

Stentor coeruleus is een bekend modelorganisme voor de studie van eencellige regeneratie. Transcriptomische analyse van individuele cellen onthulde honderden genen - veel niet geassocieerd met het orale apparaat (OA) - die differentieel gereguleerd zijn in fasen tijdens het regeneratieproces. Er werd verondersteld dat deze systemische reorganisatie en mobilisatie van cellulaire middelen naar de groei van een nieuwe artrose zal leiden tot waarneembare veranderingen in beweging en gedrag die in de tijd overeenkomen met de fasen van differentiële genexpressie. De morfologische complexiteit van S. coeruleus maakte echter de ontwikkeling van een test noodzakelijk om de statistieken en de tijdschaal vast te leggen. Een aangepast script werd gebruikt om cellen in korte video's te volgen en statistieken werden samengesteld over een grote populatie (N ~ 100). Bij verlies van de OA verliest S. coeruleus aanvankelijk het vermogen tot gerichte beweging; dan vanaf ~ 4 uur, vertoont het een aanzienlijke daling van de snelheid tot ~ 8 uur. Deze test biedt een nuttig hulpmiddel voor de screening van motiliteitsfenotypen en kan worden aangepast voor het onderzoek van andere organismen.

Het doel van deze test is om de geleidelijke verandering van bewegingspatronen en gefaseerde toename van bewegingssnelheid van cellen binnen een grote (N ~ 100) regenererende Stentorpopulatie te kwantificeren. Om de interpretatie van de resultaten te vergemakkelijken, genereert de aangepaste code in dit protocol twee soorten plots: een overlay van alle celbewegingssporen in een reeks videogegevens (figuur 1C-F en figuur S1) en een p...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking at JoVE.com

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

We presenteren een protocol voor de karakterisering van beweeglijkheid en gedrag van een populatie van honderd micron- tot millimetergrote cellen met behulp van brightfield-microscopie en celtracking. Deze test onthult dat Stentor coeruleus door vier gedragsmatig verschillende fasen gaat bij het regenereren van een verloren oraal apparaat.

Analyse van motiliteitspatronen van stentor tijdens en na orale apparaatregeneratie met behulp van celtracking

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds ...

Stentor coeruleus wordt al lang gebruikt als een modelorganisme om eencellige regeneratie te begrijpen. Hoewel de tijdlijn voor visuele morfologische regeneratie bekend is, blijft de tijdlijn voor functionele regeneratie onbekend. Deze test volgt de beweeglijkheid van de centrumpopulatie die gesynchroniseerde regeneratie ondergaat, zodat het herstel van de verliesfunctie kan worden gekwantificeerd.Het kan worden aangepast voor gebruik met andere celtypen. Het ontbreken van een veilige afdichting van de beeldkamer zal ertoe leiden dat putten in elkaar lekken of dat er luchtbellen in de putten ontstaan. Voor onderzoekers die niet bekend zijn met het gebruik van siliconen afstandhouders raden we ten zeerste aan dat PSW of een ander schoon medium in elk van de putten wordt gepipetteerd om voor gebruik op lekkage te testen.De constructie van de monsterkamers is gemakkelijker te tonen dan verbaal beschreven. Net als het proces voor het extraheren van motiliteitspatronen uit de verkregen videogegevens. Snijd om te beginnen een stuk van 250 micrometer dik siliconen afstandsblad dat iets kleiner is in zowel hoogte als breedte dan een microscoopglaasje.Gebruik een hele pons om cirkelvormige putten te maken die voldoende ruimte tussen naburige putten laten om een goede afdichting te garanderen. Start regeneratie van orale apparatuur door stentor coeruleuscellen gedurende twee minuten in 10% sucrose of 2% uria te broeden. Daarna drie keer wassen met vers medium.Pipetteer voorzichtig ongeveer 10 stentor in elke put. Zorg ervoor dat het monstervolume zo goed mogelijk wordt afgestemd op het putvolume. Sluit de putten door voorzichtig een stuk afdekglas over de putten te laten zakken vanaf één rand.Gebruik een smal en enigszins flexibel voorwerp, zoals een pipetpunt van 10 microliter om op het afdekglas te drukken waar het contact maakt met het siliconenvel om een goede afdichting te garanderen. Plaats het monster op het microscooppodium en stel de microscoop in op de laagst beschikbare vergroting, zodat er een goed in het frame past. Begin met de timelapse en verkrijg een video van tien seconden met 30 frames per seconde van elke put op elk tijdstip.Als u wilt kalibreren, krijgt u een duidelijk beeld van een kalibratiedia of een duidelijke liniaal met dezelfde vergrotingsinstellingen als de video's. Gebruik een willekeurig programma voor het weergeven van afbeeldingen om het aantal pixels te tellen tussen markeringen van een bekende fysieke afstand. Download de twee scripts, volg cellen en schone sporen naar een gemakkelijk te onthouden locatie op de computer en breng de gegevensvideo's ook over naar deze computer.Organiseer de gegevensvideo's in mappen. Eén voor elk tijdstip. Gebruik de scripttrackcellen om geautomatiseerde celtracking in de gegevensvideo's uit te voeren door trackcellen te openen en het script Kies toevoegen aan pad uit te voeren "als daarom wordt gevraagd door een pop-upvenster dat meestal alleen gebeurt wanneer het script voor de eerste keer vanuit een bepaalde map wordt uitgevoerd.Selecteer desgevraagd een of meer gegevensvideo's om tracking te starten. Navigeer naar de gegevensvideo's en eenmaal tevreden met de lijst met bestanden klikt u op openen"Om handmatig afwijkende of valse sporen te weigeren, opent u schone sporen in het MATLAB-editorvenster door op het bestand te dubbelklikken. Selecteer bij de prompt de uitvoer van gegevensmappen door trackcellen.Navigeer naar een van de gemaakte mappen en selecteer deze. Wanneer u hierom wordt gevraagd, voert u er één in om het spoor te behouden en nul om het spoor te weigeren. Druk vervolgens op enter om door te gaan naar het volgende spoor.Begin met het downloaden van het script met de titel spaghettiplots. Open en voer het script uit. Wanneer het bestandsbrowservenster verschijnt met de prompt, selecteert u de map die u wilt openen.Navigeer naar de map van een van de tijdstippen. Wat is het aantal pixels per millimeter dat desgevraagd wordt kalibratie? Typ de kalibratiewaarde en druk op enter.Pas de assen van de plot zo nodig aan door regel 55 van het script te wijzigen, die standaard is ingesteld op RR is gelijk aan vier. voor het opnemen van een straal van maximaal vier millimeter. Sla de plot op.De resultaten tonen de collectieve beweeglijkheid van de stentorcelpopulatie na twee, drie, zeven en acht uur in het regeneratieproces van het orale apparaat. Deze plots tonen zowel de verwachte toename van het aantal beweeglijke individuen als de viervoudige toename van het bereik van de meest beweeglijke cellen binnen de populatie. De snelste zwemmende cellen, indien dicht bij de rand gestart, zijn beperkt om volledig in een rechte lijn te zwemmen en hun bewegingsbereik lijkt kleiner.De tractuscellen werden ingedeeld in drie verschillende categorieën, niet-beweeglijk zonder zichtbare hold fast, niet-motiel met zichtbare hold fast en motiel. Het resultaat toonde een gestapeld histogram dat relatieve celtellingen in deze categorieën samenvatte als een functie van de onze in regeneratie. Op latere tijdstippen werd een aanzienlijk aantal cellen gevonden in kolonies met zichtbare hold-vasten die sterk suggereerden dat ze de omgeving hadden verkend en bij voorkeur in de buurt van anderen van hun soort waren gehecht.Het is belangrijk om de afmetingen van de monsterput te selecteren die goed werken voor stentor coeruleus die ongeveer een millimeter groot zijn. Dit omvat siliconen afstandhouder dikte 5/16e inch in diameter, en 10 cellen per put. Deze getallen moeten worden aangepast bij het aanpassen van dit protocol voor andere celtypen.Deze test kan worden uitgevoerd in combinatie met RNA-I om de regeneratie van verschillende stentorfenotypen te onderzoeken en te vergelijken.

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

Het beoordelen van neurale stamcellen Motiliteit Met behulp van een agarosegel-based Microfluïdische Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Visueel Mediated Geur Tracking tijdens de vlucht in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

Immunocytochemische analyse van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een Self-Made Cytospin Apparatuur

Human pluripotent stem cells (hPSCs) that include human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are exciting cell ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Kwantitatieve analyse van Random migratie van cellen met behulp van time-lapse video Microscopie

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Geoptimaliseerd kleuring en proliferatie Modeling Methoden voor de celdeling Monitoring met behulp van Cell Tracking Kleurstoffen

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Snelle Genetische analyse van epitheliale-mesenchymale signalering tijdens haar regeneratie

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Mobiele Tracking Met behulp van Photoconvertible eiwitten tijdens ontwikkeling van de zebravis

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Temporal Tracking van celcyclusprogressie behulp van flowcytometrie zonder de noodzaak voor synchronisatie

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET Imaging in Driedimensionale Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...