Name: analysis of motility patterns of stentor during and after oral apparatus regeneration using cell tracking
Uploaded: 2021-04-26T15:00:00
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Questo lavoro è stato supportato, in parte, dal Marine Biological Laboratory Whitman Early Career Fellowship (JYS). Riconosciamo Evan Burns, Mit Patel, Melanie Melo e Skylar Widman per aver aiutato con alcune delle analisi preliminari e dei test del codice. Ringraziamo Mark Slabodnick per la discussione e i suggerimenti. WFM riconosce il supporto della sovvenzione NIH R35 GM130327.

NOTA: Una popolazione di circa cento cellule di S. coeruleus è stata coltivata in conformità con un protocollo JoVE8 precedentemente pubblicato.
1. Preparazione del campione
<ol><li>Tagliare un pezzo di foglio distanziatore in silicone spesso 250 μm (Table of Materials) leggermente più piccolo sia in altezza che in larghezza rispetto a un vetrino per microscopio. Utilizzando un foro da 5/16", creare pozzetti circolari. Fai attenzione a no...

<ol>
	<li>Lillie, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+smallest+parts+of+stentor+capable+of+regeneration;+a+contribution+on+the+limits+of+divisibility+of+living+matter.">On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter.</a> Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+proportionate+structures+in+Stentor.">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).</li><li>Tartar, V., Kerkut, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biology of Stentor. , (1961).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+of+Stentor+coeruleus+to+certain+substances+added+to+the+medium.">Reactions of Stentor coeruleus to certain substances added to the medium.</a> Experimental Cell Research. 13 (2), 317-332 (1957).</li><li>Kelleher, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+model+for+microtubule+polymerization+during+oral+regeneration+in+Stentor+coeruleus.">A kinetic model for microtubule polymerization during oral regeneration in Stentor coeruleus.</a> Biosystems. 9 (4), 269-279 (1977).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+regulator+Mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+Stentor+morphogenesis.">The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis.</a> PLOS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).</li><li>Wan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+complex+ciliary+flows+around+regenerating+Stentor+coeruleus.">Reorganization of complex ciliary flows around regenerating Stentor coeruleus.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 375 (1792), 20190167 (2020).</li><li>Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+regeneration+in+Stentor.">Methods for the study of regeneration in Stentor.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (136), e57759 (2018).</li><li>Sood, P., McGillivary, R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+program+of+regeneration+in+the+giant+single+cell,+Stentor+coeruleus.">The transcriptional program of regeneration in the giant single cell, Stentor coeruleus.</a> bioRxiv. , 240788 (2017).</li><li>Onsbring, H., Jamy, M., Ettema, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+Stentor+cell+fragments+reveals+transcriptional+changes+during+cellular+regeneration.">RNA sequencing of Stentor cell fragments reveals transcriptional changes during cellular regeneration.</a> Current Biology. 28 (8), 1281-1288 (2018).</li></ol>

Attualmente esistono molti algoritmi di tracciamento di particelle e cellule, alcuni completamente gratuiti. Il costo e la facilità d'uso sono spesso compromessi che richiedono un compromesso. Inoltre, molti dei programmi di tracciamento cellulare esistenti sono progettati per tracciare il movimento lento di strisciamento delle cellule di coltura tissutale, piuttosto che il movimento di nuoto veloce di Stentor, che ruota durante il nuoto e può subire improvvisi cambiamenti di direzione. Dopo aver testato molte...

Stentor coeruleus (Stentor) è un noto organismo modello che è stato utilizzato per studiare la rigenerazione unicellulare grazie alle sue grandi dimensioni, alla capacità di resistere a diverse tecniche microchirurgiche e alla facilità di coltura in un ambiente di laboratorio 1,2,3. I primi studi di rigenerazione si sono concentrati sulla caratteristica più grande e morfologicamente distinta di Stentor, l'OA, che viene completamente eliminata dallo shock chimico 4,5,6. La sostituzione de novo di un OA perso inizia con l'emergere di una nuova banda membranare, una serie di ciglia che si spostano gradualmente verso la parte anteriore della cellula prima di formare un OA funzionale su otto stadi morfologici3. Questi stadi sono stati osservati in sequenza, indipendentemente dalla temperatura, e forniscono un punto di riferimento universale per quasi tutti gli studi5.
L'analisi meccanicistica della rigenerazione dello stentor richiede strumenti per misurare i tempi di rigenerazione che siano robusti e abbastanza semplici da essere applicati a più campioni come parte di uno schermo chimico o molecolare. Il metodo standard per eseguire un test basato su cellule è l'imaging, in questo caso, l'imaging della formazione di nuova OA durante la rigenerazione. Tuttavia, tali saggi basati sull'imaging sono più efficaci quando la struttura rigenerante contiene componenti molecolari distinti che possono essere utilizzati come marcatori, in modo che siano facilmente rilevati in un'immagine di fluorescenza. Nel caso dello Stentor OA, i componenti noti (ciglia, corpi basali) sono presenti anche sul resto della superficie cellulare; pertanto, riconoscere il ripristino dell'OA non può essere raggiunto semplicemente cercando la presenza o l'assenza di un componente.
Piuttosto, sarebbe necessaria una qualche forma di riconoscimento della forma per rilevare un OA, e questo è potenzialmente molto impegnativo dato il fatto che le cellule Stentor spesso cambiano forma attraverso un rapido processo contrattile. Questo documento presenta un test alternativo per la rigenerazione che si basa sull'attività mobile del corpo e sulle ciglia OA. Mentre l'OA si rigenera, le ciglia appena formate subiscono cambiamenti riproducibili nella posizione e nell'attività, che a loro volta influenzano la motilità di nuoto della cellula. Analizzando la motilità, è possibile eseguire un test per la "rigenerazione funzionale" che quantifica la rigenerazione quantificando la funzione delle strutture rigenerate. La precedente analisi della funzione ciliare di Stentor durante la rigenerazione ha utilizzato la velocimetria dell'immagine delle particelle, combinata con perline traccianti aggiunte al mezzo esterno, per osservare i cambiamenti nel modello di flusso in diversi stadi di rigenerazione7; tuttavia, questo approccio richiede l'imaging laborioso delle singole cellule e dei loro campi di flusso associati, uno alla volta.
Utilizzando il movimento della cella stessa come proxy per il flusso generato dalle ciglia, sarebbe possibile analizzare un numero maggiore di celle in parallelo, utilizzando sistemi di imaging a bassa risoluzione compatibili con piattaforme di screening ad alto rendimento. Questo test può, in linea di principio, essere utilizzato per studiare lo sviluppo e la rigenerazione funzionale in altri organismi nuotatori nella scala da centinaia di micron a millimetri. La sezione 1 del protocollo descrive la costruzione di un vetrino campione multiwell, che consente l'imaging ad alto rendimento di una popolazione di cellule per un massimo di un giorno intero. Vengono forniti dettagli su come regolare l'uso con altri tipi di celle. La sezione 2 del protocollo copre l'acquisizione di dati video per questo test, che può essere eseguita su un microscopio a dissezione con una fotocamera reflex digitale a obiettivo singolo. La sezione 3 del protocollo fornisce una procedura dettagliata del tracciamento delle celle e del calcolo della velocità delle celle utilizzando il codice MATLAB (Informazioni supplementari). La sezione 4 del protocollo spiega come trasformare i risultati numerici in grafici come mostrato nella Figura 1C-F e nella Figura 2C per una facile interpretazione dei risultati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25 mm-thick silicone sheet</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>CWS-S-0.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm, #1.5 coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1034527</td>
			<td>As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We used Nikon D750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas 137c WT strain</td>
			<td>Chlamydomonas Resource Center</td>
			<td>CC-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MATHWORKS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Image Processing Toolbox</td>
			<td>MATHWORKS</td>
			<td></td>
			<td>needed for TrackCells.m and CleanTraces.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox</td>
			<td>MATHWORKS</td>
			<td></td>
			<td>needed for TrackCells.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with camera port</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteurized Spring Water</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>132458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Growth Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1379801</td>
			<td>Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of motility patterns of stentor during and after oral apparatus regeneration using cell tracking

Stentor coeruleus è un noto organismo modello per lo studio della rigenerazione unicellulare. L'analisi trascrittomica delle singole cellule ha rivelato centinaia di geni, molti dei quali non associati all'apparato orale (OA), che sono regolati in modo differenziale in fasi durante tutto il processo di rigenerazione. È stato ipotizzato che questa riorganizzazione sistemica e mobilizzazione delle risorse cellulari verso la crescita di una nuova OA porterà a cambiamenti osservabili nel movimento e nel comportamento corrispondenti nel tempo alle fasi di espressione genica differenziale. Tuttavia, la complessità morfologica di S. coeruleus ha reso necessario lo sviluppo di un test per catturare le statistiche e la scala temporale. Uno script personalizzato è stato utilizzato per tracciare le celle in brevi video e le statistiche sono state compilate su una vasta popolazione (N ~ 100). Dopo la perdita dell'OA, S. coeruleus inizialmente perde la capacità di movimento diretto; quindi a partire da ~ 4 h, mostra un calo significativo della velocità fino a ~ 8 h. Questo saggio fornisce uno strumento utile per lo screening dei fenotipi di motilità e può essere adattato per lo studio di altri organismi.

L'obiettivo di questo test è quantificare il graduale cambiamento dei modelli di movimento e l'aumento graduale della velocità di movimento dalle cellule all'interno di una grande (N ~ 100) popolazione di Stentor rigenerante. Per facilitare l'interpretazione dei risultati, il codice personalizzato incluso in questo protocollo genera due tipi di grafici: una sovrapposizione di tutte le tracce di movimento cellulare in una serie di dati video (Figura 1C-F</s...

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Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

Presentiamo un protocollo per la caratterizzazione della motilità e del comportamento di una popolazione di cellule da cento micron a millimetri utilizzando la microscopia a campo luminoso e il tracciamento cellulare. Questo test rivela che Stentor coeruleus passa attraverso quattro fasi comportamentalmente distinte quando si rigenera un apparato orale perso.

Analisi dei modelli di motilità dello stentor durante e dopo la rigenerazione dell'apparato orale utilizzando il monitoraggio cellulare

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds ...

Stentor coeruleus è stato a lungo impiegato come organismo modello per comprendere la rigenerazione unicellulare. Mentre la linea temporale per la rigenerazione morfologica visiva è nota, la linea temporale per la rigenerazione funzionale rimane sconosciuta. Questo test traccia la motilità della popolazione centrale sottoposta a rigenerazione sincronizzata in modo tale da poter quantificare il recupero della funzione di perdita.Può essere adattato per l'uso con altri tipi di cellule. La mancanza di una tenuta sicura della camera di imaging comporterà la fuoriuscita di pozzi l'uno nell'altro o la formazione di bolle d'aria all'interno dei pozzi. Per i ricercatori che non hanno familiarità con l'uso di distanziatori in silicone, raccomandiamo vivamente che PSW o altro mezzo pulito sia pipettato in ciascuno dei pozzetti per testare le perdite prima dell'uso.La costruzione delle camere campione è più facile da mostrare che descritta verbalmente. Così come il processo per estrarre i modelli di motilità dai dati video acquisiti. Per iniziare, tagliare un pezzo di foglio distanziatore in silicone di 250 micrometri di spessore leggermente più piccolo sia in altezza che in larghezza rispetto a un vetrino per microscopio.Usa un pugno intero per creare pozzi circolari lasciando spazio sufficiente tra i pozzi vicini per garantire una buona tenuta. Iniziare la rigenerazione dell'apparato orale incubando le cellule dello stentor coeruleus nel 10% di saccarosio o nel 2% di uria per due minuti. Quindi lavare tre volte con mezzo fresco.Pipettare delicatamente circa 10 stentor in ciascun pozzetto. Avendo cura di abbinare il volume del campione al volume del pozzo il più vicino possibile. Chiudere i pozzetti abbassando delicatamente un pezzo di vetro di copertura sui pozzetti partendo da un bordo.Utilizzare un oggetto stretto e leggermente flessibile, come una punta della pipetta da 10 microlitri per premere verso il basso sul vetro di copertura dove contatta il foglio di silicone per garantire una buona tenuta. Posizionare il campione sul palco del microscopio e impostare il microscopio sul più basso ingrandimento disponibile in modo che uno si adatti bene alla cornice. Inizia il time lapse e acquisisci un video di dieci secondi a 30 fotogrammi al secondo di ogni pozzo in ogni punto temporale.Per calibrare, acquisisci un'immagine chiara di una diapositiva di calibrazione o di un righello chiaro con le stesse impostazioni di ingrandimento dei video. Utilizzando qualsiasi programma di visualizzazione delle immagini, contare il numero di pixel tra i segni di una distanza fisica nota. Scarica i due script, traccia le celle e pulisci le tracce in una posizione facile da ricordare sul computer e trasferisci anche i video dei dati su questo computer.Organizza i video dei dati in cartelle. Uno per ogni punto temporale. Utilizzare le celle di traccia dello script per eseguire il rilevamento automatico delle celle nei video dei dati aprendo le celle di traccia ed eseguendo lo script Scegli aggiungi al percorso"se richiesto da una finestra popup che in genere si verifica solo quando lo script viene eseguito per la prima volta da una determinata cartella.Quando richiesto, seleziona uno o più video di dati per avviare il monitoraggio. Passare ai video dei dati e una volta soddisfatti dell'elenco dei file fare clic su apri"Per rifiutare manualmente tracce anomale o false, aprire le tracce pulite nella finestra dell'editor MATLAB facendo doppio clic sul file. Al prompt selezionare l'output della cartella dati in base alle celle di traccia.Passare a una delle cartelle create e selezionarla. Quando richiesto, immettere uno per mantenere la traccia e zero per rifiutare la traccia. Quindi premere INVIO per passare alla traccia successiva.Inizia scaricando lo script intitolato spaghetti plots. Aprire ed eseguire lo script. Quando viene visualizzata la finestra del browser dei file con il prompt, selezionare la cartella da aprire.Passare alla cartella di uno dei punti temporali. Quando viene richiesto, calibrazione, qual è il numero di pixel per millimetro? Digitare il valore di calibrazione e premere invio.Regolate gli assi del plottaggio in base alle esigenze modificando la riga 55 dello script, che per impostazione predefinita è impostata su RR uguale a quattro. per includere un raggio fino a quattro millimetri. Salva la trama.I risultati mostrano la motilità collettiva della popolazione di cellule stentor a due, tre, sette e otto ore nel processo di rigenerazione dell'apparato orale. Questi grafici mostrano sia l'aumento previsto del numero di individui mobili sia l'aumento quadruplicato della gamma delle cellule più mobili all'interno della popolazione. Le cellule di nuoto più veloci, se avviate vicino al bordo, sono limitate dal nuoto interamente in linea retta e la loro gamma di movimento appare più piccola.Le cellule del tratto sono state classificate in tre categorie distinte, non mobili senza tenuta visibile, non mobili con tenuta visibile e mobili. Il risultato ha mostrato un istogramma impilato che riassume i conteggi cellulari relativi in queste categorie in funzione della nostra rigenerazione. In tempi successivi, un numero significativo di cellule sono state trovate in colonie con fermi visibili suggerendo fortemente che avevano esplorato l'ambiente e preferenzialmente attaccato vicino ad altri del loro genere.È importante selezionare le dimensioni del pozzo del campione che funzionano bene per lo stentor coeruleus che hanno una dimensione di circa un millimetro. Ciò include lo spessore del distanziatore in silicone di 5/16 pollici di diametro e 10 celle per pozzetto. Questi numeri dovrebbero essere regolati quando si adatta questo protocollo ad altri tipi di cellule.Questo test può essere eseguito in combinazione con RNA-I per studiare e confrontare la rigenerazione di diversi fenotipi di stentor.

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

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