Name: analysis of motility patterns of stentor during and after oral apparatus regeneration using cell tracking
Uploaded: 2021-04-26T15:00:00
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この研究は、海洋生物学研究所ホイットマン・アーリーキャリア・フェローシップ(JYS)によって部分的に支援されました。Evan Burns、Mit Patel、Melanie Melo、Skylar Widmanが予備的な分析とコードテストの一部を支援してくれたことに感謝します。マーク・スラボドニックの議論と提案に感謝します。WFMは、NIH助成金R35 GM130327からの支援を認めています。

注:約100の S. coeruleus 細胞の集団を、以前に公開されたJoVEプロトコル8に従って培養した。
1. サンプル調製
<ol><li>厚さ250μmのシリコーンスペーサーシート(材料表)を顕微鏡スライドよりも高さと幅の両方でわずかに小さく切ります。5/16インチの穴を開けて、円形の井戸を作ります。良好なシールを確保するために、隣接する井戸の間?...

<ol>
	<li>Lillie, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+smallest+parts+of+stentor+capable+of+regeneration;+a+contribution+on+the+limits+of+divisibility+of+living+matter.">On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter.</a> Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+proportionate+structures+in+Stentor.">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).</li><li>Tartar, V., Kerkut, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biology of Stentor. , (1961).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+of+Stentor+coeruleus+to+certain+substances+added+to+the+medium.">Reactions of Stentor coeruleus to certain substances added to the medium.</a> Experimental Cell Research. 13 (2), 317-332 (1957).</li><li>Kelleher, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+model+for+microtubule+polymerization+during+oral+regeneration+in+Stentor+coeruleus.">A kinetic model for microtubule polymerization during oral regeneration in Stentor coeruleus.</a> Biosystems. 9 (4), 269-279 (1977).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+regulator+Mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+Stentor+morphogenesis.">The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis.</a> PLOS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).</li><li>Wan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+complex+ciliary+flows+around+regenerating+Stentor+coeruleus.">Reorganization of complex ciliary flows around regenerating Stentor coeruleus.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 375 (1792), 20190167 (2020).</li><li>Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+regeneration+in+Stentor.">Methods for the study of regeneration in Stentor.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (136), e57759 (2018).</li><li>Sood, P., McGillivary, R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+program+of+regeneration+in+the+giant+single+cell,+Stentor+coeruleus.">The transcriptional program of regeneration in the giant single cell, Stentor coeruleus.</a> bioRxiv. , 240788 (2017).</li><li>Onsbring, H., Jamy, M., Ettema, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+Stentor+cell+fragments+reveals+transcriptional+changes+during+cellular+regeneration.">RNA sequencing of Stentor cell fragments reveals transcriptional changes during cellular regeneration.</a> Current Biology. 28 (8), 1281-1288 (2018).</li></ol>

現在、多くの粒子および細胞追跡アルゴリズムが存在し、一部は完全に無料です。コストと使いやすさは、多くの場合、妥協を必要とするトレードオフです。さらに、既存の細胞追跡プログラムの多くは、水泳中に回転し、突然の方向転換を受ける可能性がある Stentorの高速水泳運動ではなく、組織培養細胞のゆっくりとした這う動きを追跡するように設計されています。これらのオ?...

Stentor coeruleus(Stentor)は、その大きなサイズ、いくつかの顕微外科的技術に耐える能力、および実験室環境での培養の容易さのために単細胞再生を研究するために使用されているよく知られているモデル生物である1,2,3。初期の再生研究は、Stentorの最大かつ最も形態学的に異なる特徴であるOAに焦点を当てており、これは化学ショック4,5,6で完全に放出される。失われたOAのDe novo置換は、新しい膜帯(8つの形態学的段階にわたって機能的なOAを形成する前に細胞の前部に向かって徐々にシフトする繊毛の配列)の出現から始まる3。これらの段階は、温度に関係なく順次観察されており、ほぼすべての研究に普遍的な基準点を提供しています5。
ステンター再生の機構的分析には、再生のタイミングを測定するためのツールが必要であり、化学的または分子的スクリーンの一部として複数のサンプルに適用するのに十分堅牢で簡単です。細胞ベースのアッセイを行うための標準的な方法は、イメージングであり、この場合、再生中の新しいOAの形成をイメージングする。しかし、このようなイメージングベースのアッセイは、再生構造がマーカーとして使用できる別個の分子成分を含む場合に最も効果的であり、蛍光画像で容易に検出される。ステンターOAの場合、既知の成分(繊毛、基底体)も細胞表面の残りの部分に存在する。したがって、OA の復元を認識することは、コンポーネントの有無を探すだけでは達成できません。
むしろ、OAを検出するには何らかの形の形状認識が必要であり、 ステンター 細胞がしばしば急速な収縮プロセスを介して形状を変化させるという事実を考えると、これは潜在的に非常に困難である。この論文は、身体およびOA繊毛の運動活性に依存する再生のための代替アッセイを提示する。OAが再生するにつれて、新たに形成された繊毛は位置および活動において再現可能な変化を受け、これは次に、細胞の遊泳運動性に影響を及ぼす。運動性を解析することにより、再生構造の機能を定量化して再生を定量化する「機能再生」のアッセイを行うことができる。再生中の ステンター 毛様体機能の以前の解析では、粒子画像速度測定を外部媒体に添加したトレーサービーズと組み合わせて、再生のさまざまな段階での流れパターンの変化を観察しました7。しかし、このアプローチでは、個々の細胞とそれに関連する流れ場を一度に1つずつ手間のかかるイメージングが必要です。
細胞自体の動きを繊毛生成フローのプロキシとして使用することで、ハイスループットスクリーニングプラットフォームと互換性のある低解像度イメージングシステムを使用して、より多くの細胞を並行して解析することが可能になります。このアッセイは、原理的には、数百ミクロンからミリメートルのサイズのスケールで他の遊泳生物の発達および機能的再生を研究するために使用することができる。プロトコルのセクション1は、マルチウェルサンプルスライドの構築について説明しており、これにより、最大1日にわたる細胞集団のハイスループットイメージングが可能になります。他の細胞型で使用するために調整する方法の詳細が提供されています。プロトコルのセクション2は、このアッセイのためのビデオデータの取得をカバーしており、これはデジタル一眼レフカメラを備えた解剖顕微鏡上で達成することができる。プロトコルのセクション 3 では、MATLAB コード (補足情報) を使用したセル追跡とセル速度計算のチュートリアルを提供します。プロトコルのセクション4では、結果を簡単に解釈できるように、図1C-Fおよび図2Cに示すように、数値結果をプロットに変換する方法について説明します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25 mm-thick silicone sheet</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>CWS-S-0.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm, #1.5 coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1034527</td>
			<td>As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We used Nikon D750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas 137c WT strain</td>
			<td>Chlamydomonas Resource Center</td>
			<td>CC-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MATHWORKS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Image Processing Toolbox</td>
			<td>MATHWORKS</td>
			<td></td>
			<td>needed for TrackCells.m and CleanTraces.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox</td>
			<td>MATHWORKS</td>
			<td></td>
			<td>needed for TrackCells.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with camera port</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteurized Spring Water</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>132458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Growth Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1379801</td>
			<td>Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of motility patterns of stentor during and after oral apparatus regeneration using cell tracking

Stentor coeruleus は、単細胞再生の研究のためのよく知られているモデル生物である。個々の細胞のトランスクリプトーム解析により、再生プロセス全体を通して段階的に差次的に調節される何百もの遺伝子(多くは口腔装置(OA)と関連していない)が明らかになった。新しいOAの成長に向けた細胞資源のこの全身的な再編成と動員は、異なる遺伝子発現の段階に対応する動きと行動の観察可能な変化をもたらすという仮説が立てられた。しかし、 S. coeruleus の形態学的複雑さは、統計と時間スケールを捉えるためのアッセイの開発を必要とした。カスタムスクリプトを使用して短いビデオのセルを追跡し、統計は大規模な人口(N〜100)にわたってコンパイルされました。OAが失われると、 S. coeruleus は最初に指向性運動の能力を失う。その後、〜4時間から始まり、〜8時間まで速度の大幅な低下を示す。このアッセイは、運動性表現型のスクリーニングに有用なツールを提供し、他の生物の調査に適合させることができる。

このアッセイの目的は、大きな(N〜100)再生ステンター集団内の細胞からの移動パターンの漸進的な変化および移動速度の段階的増加を定量化することである。結果の解釈を支援するために、このプロトコルに含まれるカスタムコードは、ビデオデータのセット内のすべての細胞移動トレースのオーバーレイ(図1C-Fおよび図S1)と、再生開始からの時?...

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Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

我々は、明視野顕微鏡法および細胞追跡を用いて、百ミクロンからミリメートルサイズの細胞集団の運動性および挙動の特性評価のためのプロトコルを提示する。このアッセイは、 ステンター・コエルルスが 失われた口腔装置を再生する際に、4つの行動的に異なる段階を経て遷移することを明らかにする。

細胞追跡を用いた口腔装置再生中および再生後の ステント の運動性パターンの解析

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds ...

ステンター・コエルルスは、単細胞再生を理解するためのモデル生物として長い間用いられてきた。視覚形態学的再生のタイムラインは知られているが、機能的再生のタイムラインは不明のままである。このアッセイは、損失機能の回復を定量化できるように、同期再生を受けている中心集団の運動性を追跡する。これは、他の細胞型との使用に適合させることができる。イメージングチャンバの安全なシールの欠如は、ウェルが互いに漏れたり、ウェルの内部に気泡が形成されたりする結果となる。シリコーンスペーサーの使用に慣れていない研究者のために、PSWまたは他のクリーン培地を各ウェルにピペットで固定して、使用前に漏れをテストすることを強くお勧めします。サンプルチャンバーの構造は、口頭で説明するよりも簡単に示されます。取得した映像データから運動パターンを抽出する処理も同様です。まず、顕微鏡スライドよりも高さと幅の両方でわずかに小さい厚さ250マイクロメートルのシリコーンスペーサーシートをカットします。パンチ全体を使用して円形の井戸を作成し、隣接する井戸の間に十分なスペースを残して、良好なシールを確保します。ステンターコエルラス細胞を10%スクロースまたは2%尿症で2分間インキュベートすることによって、経口装置の再生を開始する。その後、新鮮な培地で3回洗う。各ウェルに約10個のステンターを静かにピペットで入れる。サンプル量をできるだけウェル量に近づけるように注意してください。片方の端からウェルの上にカバーガラスを静かに下げて、ウェルを閉じます。10マイクロリットルのピペットチップなど、狭くてわずかに柔軟なものを使用して、カバーガラスを押し下げてシリコーンシートに接触させ、良好なシールを確保します。サンプルを顕微鏡ステージに置き、顕微鏡を利用可能な最低倍率に設定して、フレームに収まるようにします。タイムラプスを開始し、各時点で各ウェルの毎秒30フレームで10秒のビデオを取得します。キャリブレーションするには、キャリブレーションスライドまたはクリアルーラーの鮮明な画像をビデオと同じ倍率設定で取得します。任意の画像表示プログラムを使用して、既知の物理的距離のマーク間のピクセル数を数えます。2つのスクリプトをダウンロードし、セルを追跡し、トレースをコンピュータ上の覚えやすい場所にきれいにし、データビデオをこのコンピュータに転送します。データビデオをフォルダに整理します。各タイム ポイントに 1 つずつ。スクリプトトラックセルを使用して、トラックセルを開き、スクリプトを実行することによって、データビデオの自動セルトラッキングを実行します パスに追加を選択します ポップアップウィンドウでプロンプトが表示された場合、通常はスクリプトが特定のフォルダから初めて実行されるときにのみ発生します。プロンプトが表示されたら、1つ以上のデータビデオを選択して追跡を開始します。データビデオに移動し、ファイルのリストに満足したら、開くをクリックします異常または偽のトレースを手動で拒否するには、ファイルをダブルクリックしてMATLABエディタウィンドウでクリーントレースを開きます。プロンプトで、トラックセル別に出力されるデータフォルダを選択します。作成したフォルダの1つに移動して選択します。プロンプトが出されたら、トレースを保持するには 1 を入力し、トレースを拒否するにはゼロを入力します。次に、Enter キーを押して次のトレースに進みます。まず、スパゲッティプロットというタイトルのスクリプトをダウンロードします。スクリプトを開いて実行します。ファイルブラウザウィンドウがプロンプトとともにポップアップしたら、開くフォルダを選択します。いずれかの時点のフォルダーに移動します。キャリブレーションのプロンプトが表示されたら、ミリメートルあたりのピクセル数は何ですか?キャリブレーション値を入力し、Enter キーを押します。スクリプトの55行目(デフォルトではRRが4に等しい)を変更して、必要に応じてプロットの軸を調整します。最大4ミリメートルの半径を含むため。プロットを保存します。結果は、口腔装置再生プロセスの2時間、3時間、7時間、および8時間におけるステンター細胞集団の集団運動性を示す。これらのプロットは、運動性個体数の予想される増加と、集団内の最も運動性細胞の範囲における4倍の増加の両方を示す。最速の遊泳セルは、端の近くで開始された場合、完全に直線で泳ぐことが制限され、その移動範囲は小さく見えます。管細胞は、目に見えるホールドファストを有する非運動性、可視ホールドファストを有する非運動性、および可動性を有する3つの異なるカテゴリーに分類された。その結果、これらのカテゴリにわたる相対的なセル数を、再生への関数として要約した積み重ねられたヒストグラムが示されました。後に、目に見えるホールド断食を持つコロニーでかなりの数の細胞が発見され、彼らが環境を探索し、その種の他のものの近くに優先的に付着したことを強く示唆した。約1ミリメートルのサイズであるステンターコエルルスによく働くサンプルウェル寸法を選択することが重要です。これには、直径5/16インチのシリコーンスペーサーの厚さ、およびウェルあたり10セルが含まれます。これらの数値は、このプロトコルを他の細胞型に適応させるときに調整する必要があります。このアッセイは、RNA-Iと組み合わせて実施して、異なるステンター表現型の再生を調査および比較することができる。

Research

JoVE Journal

Biology

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細胞追跡を用いた口腔装置再生中および再生後の ステント の運動性パターンの解析

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