Name: analysis of motility patterns of stentor during and after oral apparatus regeneration using cell tracking
Uploaded: 2021-04-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis støttet av Marine Biological Laboratory Whitman Early Career Fellowship (JYS). Vi anerkjenner Evan Burns, Mit Patel, Melanie Melo og Skylar Widman for å ha hjulpet med noen av de foreløpige analysene og kodetestingene. Vi takker Slabodnick for diskusjon og forslag. WFM anerkjenner støtte fra NIH grant R35 GM130327.

MERK: En populasjon på omtrent hundre S. coeruleus-celler ble dyrket i samsvar med en tidligere publisert JoVE-protokoll8.
1. Forberedelse av prøver
<ol><li>Klipp et stykke 250 μm tykt silikonavstandsark (Table of Materials) litt mindre i både høyde og bredde enn et mikroskopglass. Bruk en 5/16 "hullstans, lag sirkulære brønner. Vær oppmerksom på å forlate tilstrekkelig plass mellom nærliggende brønner for å sikre en god tetning....

<ol>
	<li>Lillie, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+smallest+parts+of+stentor+capable+of+regeneration;+a+contribution+on+the+limits+of+divisibility+of+living+matter.">On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter.</a> Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+proportionate+structures+in+Stentor.">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).</li><li>Tartar, V., Kerkut, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biology of Stentor. , (1961).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+of+Stentor+coeruleus+to+certain+substances+added+to+the+medium.">Reactions of Stentor coeruleus to certain substances added to the medium.</a> Experimental Cell Research. 13 (2), 317-332 (1957).</li><li>Kelleher, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+model+for+microtubule+polymerization+during+oral+regeneration+in+Stentor+coeruleus.">A kinetic model for microtubule polymerization during oral regeneration in Stentor coeruleus.</a> Biosystems. 9 (4), 269-279 (1977).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+regulator+Mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+Stentor+morphogenesis.">The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis.</a> PLOS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).</li><li>Wan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+complex+ciliary+flows+around+regenerating+Stentor+coeruleus.">Reorganization of complex ciliary flows around regenerating Stentor coeruleus.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 375 (1792), 20190167 (2020).</li><li>Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+regeneration+in+Stentor.">Methods for the study of regeneration in Stentor.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (136), e57759 (2018).</li><li>Sood, P., McGillivary, R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+program+of+regeneration+in+the+giant+single+cell,+Stentor+coeruleus.">The transcriptional program of regeneration in the giant single cell, Stentor coeruleus.</a> bioRxiv. , 240788 (2017).</li><li>Onsbring, H., Jamy, M., Ettema, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+Stentor+cell+fragments+reveals+transcriptional+changes+during+cellular+regeneration.">RNA sequencing of Stentor cell fragments reveals transcriptional changes during cellular regeneration.</a> Current Biology. 28 (8), 1281-1288 (2018).</li></ol>

Mange partikkel- og cellesporingsalgoritmer eksisterer for tiden, noen helt gratis. Kostnader og brukervennlighet er ofte kompromisser som krever kompromisser. I tillegg er mange av de eksisterende cellesporingsprogrammene designet for å spore langsom krypende bevegelse av vevskulturceller, i stedet for Stentors raske svømmebevegelse, som roterer mens du svømmer og kan gjennomgå plutselige retningsendringer. Etter å ha testet mange av disse alternativene, er protokollen som presenteres her ment å være en ...

Stentor coeruleus (Stentor) er en velkjent modellorganisme som har blitt brukt til å studere encellet regenerering på grunn av sin store størrelse, evne til å motstå flere mikrokirurgiske teknikker og enkel dyrking i en laboratorieinnstilling 1,2,3. Tidlige regenereringsstudier fokuserte på den største og mest morfologisk distinkte egenskapen i Stentor-OA-som kastes helt på kjemisk sjokk 4,5,6. De novo erstatning av en tapt OA begynner med fremveksten av et nytt membranellarbånd - en rekke cilia som gradvis skifter mot fremre av cellen før de danner en funksjonell OA over åtte morfologiske stadier3. Disse stadiene er observert sekvensielt, uavhengig av temperatur, og gir et universelt referansepunkt for nesten alle studier5.
Mekanistisk analyse av stentorregenerering krever verktøy for å måle tidspunktet for regenerering som er robuste og enkle nok til å brukes på flere prøver som en del av en kjemisk eller molekylær skjerm. Standardmetoden for å utføre en cellebasert analyse er avbildning, i dette tilfellet avbildning av dannelsen av ny OA under regenerering. Imidlertid er slike bildebaserte analyser mest effektive når den regenererende strukturen inneholder forskjellige molekylære komponenter som kan brukes som markører, slik at de lett kan oppdages i et fluorescensbilde. Når det gjelder Stentor OA, er de kjente komponentene (cilia, basallegemer) også tilstede på resten av celleoverflaten; Derfor kan anerkjennelse av restaureringen av OA ikke oppnås bare ved å lete etter tilstedeværelse eller fravær av en komponent.
Snarere vil det være nødvendig med en form for formgjenkjenning for å oppdage en OA, og dette er potensielt svært utfordrende gitt det faktum at Stentor-celler ofte endrer form via en rask kontraktil prosess. Dette papiret presenterer en alternativ analyse for regenerering som er avhengig av kroppens motile aktivitet og OA-cilia. Når OA regenererer, gjennomgår de nydannede cilia reproduserbare endringer i posisjon og aktivitet, noe som igjen påvirker cellens svømmemotilitet. Ved å analysere motilitet er det mulig å utføre en analyse for "funksjonell regenerering" som kvantifiserer regenerering ved å kvantifisere funksjonen til de regenererte strukturer. Tidligere analyse av Stentor ciliary funksjon under regenerering brukte partikkelbilde velocimetry, kombinert med tracer perler lagt til eksterne medier, for å observere endringer i strømningsmønster på ulike stadier av regenerering7; Denne tilnærmingen krever imidlertid møysommelig avbildning av individuelle celler og deres tilhørende strømningsfelt, en om gangen.
Ved å bruke bevegelsen av selve cellen som en proxy for cilia-generert strømning, ville det være mulig å analysere større antall celler parallelt, ved hjelp av lavoppløselige bildesystemer som er kompatible med høy gjennomstrømningsscreeningsplattformer. Denne analysen kan i prinsippet brukes til å studere utvikling og funksjonell regenerering i andre svømmende organismer i hundrevis av mikron til millimeter størrelse skala. Seksjon 1 i protokollen beskriver konstruksjonen av et multiwell prøveglass, som muliggjør høy gjennomstrømningsavbildning av en populasjon av celler over opptil en hel dag. Detaljer er gitt for hvordan du justerer for bruk med andre celletyper. Seksjon 2 i protokollen dekker innsamling av videodata for denne analysen, som kan oppnås på et disseksjonsmikroskop med et digitalt speilreflekskamera. Seksjon 3 i protokollen gir en gjennomgang av cellesporing og beregning av cellehastighet ved bruk av MATLAB-kode (Tilleggsinformasjon). Del 4 i protokollen forklarer hvordan man gjør de numeriske resultatene om til plott som vist i figur 1C-F og figur 2C for enkel tolkning av resultatene.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25 mm-thick silicone sheet</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>CWS-S-0.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm, #1.5 coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1034527</td>
			<td>As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We used Nikon D750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas 137c WT strain</td>
			<td>Chlamydomonas Resource Center</td>
			<td>CC-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MATHWORKS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Image Processing Toolbox</td>
			<td>MATHWORKS</td>
			<td></td>
			<td>needed for TrackCells.m and CleanTraces.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox</td>
			<td>MATHWORKS</td>
			<td></td>
			<td>needed for TrackCells.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with camera port</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteurized Spring Water</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>132458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Growth Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1379801</td>
			<td>Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of motility patterns of stentor during and after oral apparatus regeneration using cell tracking

Stentor coeruleus er en velkjent modellorganisme for studiet av encellet regenerering. Transkriptomisk analyse av individuelle celler avslørte hundrevis av gener - mange ikke assosiert med det orale apparatet (OA) - som er differensielt regulert i faser gjennom regenereringsprosessen. Det ble antatt at denne systemiske omorganiseringen og mobiliseringen av cellulære ressurser mot vekst av en ny OA vil føre til observerbare endringer i bevegelse og oppførsel som tilsvarer i tid til fasene av differensiell genuttrykk. Imidlertid nødvendiggjorde den morfologiske kompleksiteten til S. coeruleus utviklingen av en analyse for å fange statistikken og tidsskalaen. Et tilpasset skript ble brukt til å spore celler i korte videoer, og statistikk ble samlet over en stor befolkning (N ~ 100). Ved tap av OA mister S. coeruleus i utgangspunktet evnen til rettet bevegelse; deretter starter på ~ 4 h, viser den en betydelig hastighetsfall til ~ 8 timer. Denne analysen gir et nyttig verktøy for screening av motilitetsfenotyper og kan tilpasses for undersøkelse av andre organismer.

Målet med denne analysen er å kvantifisere den gradvise endringen av bevegelsesmønstre og faset økning i bevegelseshastighet fra celler i en stor (N ~ 100) regenererende stentorpopulasjon. For å hjelpe tolkningen av resultatene genererer den tilpassede koden som er inkludert i denne protokollen to typer plott: et overlegg av alle cellebevegelsesspor i et sett med videodata (figur 1C-F og figur S1), og et plott av svømmehastigh...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking at JoVE.com

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

Vi presenterer en protokoll for karakterisering av motilitet og oppførsel av en populasjon på hundre mikron- til millimeterstørrelsesceller ved hjelp av lysfeltmikroskopi og cellesporing. Denne analysen avslører at Stentor coeruleus overgår gjennom fire atferdsmessig forskjellige faser når man regenererer et tapt oralt apparat.

Analyse av motilitetsmønstre av stentor under og etter oral apparatregenerering ved bruk av cellesporing

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds ...

Stentor coeruleus har lenge vært brukt som en modellorganisme for å forstå encellet regenerering. Mens tidslinjen for visuell morfologisk regenerering er kjent, er tidslinjen for funksjonell regenerering fortsatt ukjent. Denne analysen sporer motiliteten til senterpopulasjonen som gjennomgår synkronisert regenerering slik at gjenoppretting av tapsfunksjonen kan kvantifiseres.Den kan tilpasses for bruk med andre celletyper. Mangelen på en sikker forsegling av avbildningskammeret vil føre til at brønner lekker inn i hverandre eller luftbobler dannes inne i brønnene. For forskere som ikke er kjent med bruken av silikonavstandsstykker, anbefaler vi på det sterkeste at PSW eller annet rent medium pipetteres inn i hver av brønnene for å teste for lekkasje før bruk.Konstruksjonen av prøvekamrene er lettere vist enn muntlig beskrevet. Det samme er prosessen for å trekke ut motilitetsmønstre fra de oppkjøpte videodataene. For å begynne, kutt et stykke 250 mikrometer tykt silikonavstandsark litt mindre i både høyde og bredde enn et mikroskopglass.Bruk et helt slag for å lage sirkulære brønner som gir tilstrekkelig plass mellom nærliggende brønner for å sikre en god tetning. Initier regenerering av orale apparater ved å inkubere stentor coeruleus celler i 10% sukrose eller 2% uria i to minutter. Vask deretter tre ganger med ferskt medium.Pipetter forsiktig ca. 10 stentorer inn i hver brønn. Pass på å tilpasse prøvevolumet til brønnvolumet så nært som mulig. Lukk brønnene ved å senke et stykke dekkglass forsiktig over brønnene fra den ene kanten.Bruk en smal og litt fleksibel gjenstand, for eksempel en 10 mikroliter pipettespiss for å trykke ned på dekselglasset der det kommer i kontakt med silikonplaten for å sikre en god forsegling. Plasser prøven på mikroskopstadiet og sett mikroskopet til laveste tilgjengelige forstørrelse slik at man passer godt inn i rammen. Begynn tidsforløpet og skaff deg en ti sekunders video med 30 bilder per sekund av hver brønn på hvert tidspunkt.For å kalibrere, få et klart bilde av et kalibreringslysbilde eller en klar linjal med samme forstørrelsesinnstillinger som videoene. Bruk et hvilket som helst bildevisningsprogram til å telle antall piksler mellom merker på en kjent fysisk avstand. Last ned de to skriptene, sporceller og rengjør spor til et lett å huske sted på datamaskinen, og overfør datavideoene til denne datamaskinen også.Organiser datavideoene i mapper. En for hvert tidspunkt. Bruk skriptsporcellene til å utføre automatisert cellesporing i datavideoene ved å åpne sporceller og kjøre skriptet Velg legg til bane "hvis du blir bedt om det i et popup-vindu som vanligvis bare vil skje når skriptet kjøres for første gang fra en gitt mappe.Når du blir bedt om det, velger du en eller flere datavideoer for å starte sporing. Naviger til datavideoene og når du er fornøyd med listen over filer, klikk på åpen"For å manuelt avvise uregelmessige eller falske spor, åpne rene spor i MATLAB-redigeringsvinduet ved å dobbeltklikke på filen. Ved ledeteksten velger du datamappeutgang etter sporceller.Naviger til en av de opprettede mappene og velg den. Når du blir bedt om det, skriv inn en for å beholde sporet og null for å avvise sporet. Trykk deretter enter for å gå videre til neste spor.Begynn med å laste ned skriptet med tittelen spaghetti plott. Åpne og kjør skriptet. Når filleservinduet dukker opp med ledeteksten, velger du mappen du vil åpne.Naviger til mappen til ett av tidspunktene. Når du blir bedt om det, kalibrering, hva er antall piksler per millimeter? Skriv inn kalibreringsverdien og trykk enter.Juster aksene til plottet etter behov ved å endre linje 55 i skriptet, som som standard er satt til RR er lik fire. for å inkludere en radius på opptil fire millimeter. Lagre plottet.Resultatene viser den kollektive motiliteten til stentorcellepopulasjonen ved to, tre, syv og åtte timer inn i den orale apparatregenereringsprosessen. Disse plottene viser både den forventede økningen i antall motile individer og den firedoble økningen i rekkevidden av de mest bevegelige cellene i befolkningen. De raskeste svømmecellene, hvis de startes nær kanten, er begrenset fra å svømme helt i en rett linje, og deres bevegelsesområde virker mindre.Kanalcellene ble klassifisert i tre forskjellige kategorier, ikke-bevegelige uten synlig hold fast, ikke-bevegelige med synlig hold raskt og motile. Resultatet viste et stablet histogram som oppsummerer relative celletall på tvers av disse kategoriene som en funksjon av oss i regenerering. Senere ble det funnet et betydelig antall celler i kolonier med synlige holdfaster som sterkt antydet at de hadde utforsket miljøet og fortrinnsvis festet seg i nærheten av andre av sitt slag.Det er viktig å velge prøvebrønndimensjonene som fungerer godt for stentor coeruleus som er omtrent en millimeter i størrelse. Dette inkluderer silikon avstandsstykke tykkelse 5/16th inches i diameter, og 10 celler per brønn. Disse tallene bør justeres når du tilpasser denne protokollen for andre celletyper.Denne analysen kan utføres i forbindelse med RNA-I for å undersøke og sammenligne regenerering av forskjellige stentorfenotyper.

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

Human pluripotent stem cells (hPSCs) that include human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are exciting cell ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Kvantitativ analyse av Random migrasjon av celler ved hjelp av Time-lapse video Mikroskopi

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimalisert flekker og spredning modellering Metoder for Celledeling Overvåking hjelp Cell Tracking Fargestoffer

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Rapid Genetic Analysis of epitelial-mesenchymale signaleringsprotokoll Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Cell sporing ved hjelp av Photoconvertible Proteiner Under Sebrafisk Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Temporal Sporing av cellecyklusprogresjonen Bruke flowcytometrisystemer uten behov for synkronisering

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET Imaging i Tredimensjonal Hydrogeler

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...