Name: analysis of motility patterns of stentor during and after oral apparatus regeneration using cell tracking
Uploaded: 2021-04-26T15:00:00
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Este trabajo fue apoyado, en parte, por el Laboratorio de Biología Marina Whitman Early Career Fellowship (JYS). Reconocemos a Evan Burns, Mit Patel, Melanie Melo y Skylar Widman por ayudar con algunos de los análisis preliminares y las pruebas de código. Agradecemos a Mark Slabodnick por la discusión y las sugerencias. WFM reconoce el apoyo de la subvención R35 GM130327 de los NIH.

NOTA: Se cultivó una población de aproximadamente cien células de S. coeruleus de acuerdo con un protocolo JoVE8 publicado anteriormente.
1. Preparación de la muestra
<ol><li>Corte un trozo de lámina espaciadora de silicona de 250 μm de espesor (Tabla de materiales) ligeramente más pequeña en altura y anchura que un portaobjetos de microscopio. Usando un taladro de 5/16", cree pozos circulares. Tenga en cuenta dejar suficiente espacio...

<ol>
	<li>Lillie, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+smallest+parts+of+stentor+capable+of+regeneration;+a+contribution+on+the+limits+of+divisibility+of+living+matter.">On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter.</a> Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+proportionate+structures+in+Stentor.">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).</li><li>Tartar, V., Kerkut, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biology of Stentor. , (1961).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+of+Stentor+coeruleus+to+certain+substances+added+to+the+medium.">Reactions of Stentor coeruleus to certain substances added to the medium.</a> Experimental Cell Research. 13 (2), 317-332 (1957).</li><li>Kelleher, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+model+for+microtubule+polymerization+during+oral+regeneration+in+Stentor+coeruleus.">A kinetic model for microtubule polymerization during oral regeneration in Stentor coeruleus.</a> Biosystems. 9 (4), 269-279 (1977).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+regulator+Mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+Stentor+morphogenesis.">The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis.</a> PLOS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).</li><li>Wan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+complex+ciliary+flows+around+regenerating+Stentor+coeruleus.">Reorganization of complex ciliary flows around regenerating Stentor coeruleus.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 375 (1792), 20190167 (2020).</li><li>Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+regeneration+in+Stentor.">Methods for the study of regeneration in Stentor.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (136), e57759 (2018).</li><li>Sood, P., McGillivary, R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+program+of+regeneration+in+the+giant+single+cell,+Stentor+coeruleus.">The transcriptional program of regeneration in the giant single cell, Stentor coeruleus.</a> bioRxiv. , 240788 (2017).</li><li>Onsbring, H., Jamy, M., Ettema, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+Stentor+cell+fragments+reveals+transcriptional+changes+during+cellular+regeneration.">RNA sequencing of Stentor cell fragments reveals transcriptional changes during cellular regeneration.</a> Current Biology. 28 (8), 1281-1288 (2018).</li></ol>

Actualmente existen muchos algoritmos de seguimiento de partículas y células, algunos completamente gratuitos. El costo y la facilidad de uso a menudo son compensaciones que requieren compromiso. Además, muchos de los programas de seguimiento celular existentes están diseñados para rastrear el movimiento lento de rastreo de las células de cultivo de tejidos, en lugar del movimiento de natación rápida de Stentor, que gira mientras nada y puede sufrir cambios repentinos de dirección. Después de probar mu...

Stentor coeruleus (Stentor) es un organismo modelo bien conocido que se ha utilizado para estudiar la regeneración unicelular debido a su gran tamaño, capacidad para soportar varias técnicas microquirúrgicas y facilidad de cultivo en un entorno de laboratorio 1,2,3. Los primeros estudios de regeneración se centraron en la característica más grande y morfológicamente distinta de Stentor, la OA, que se elimina por completo tras el choque químico 4,5,6. El reemplazo de novo de una OA perdida comienza con la aparición de una nueva banda de membranalar, una serie de cilios que se desplazan gradualmente hacia la parte anterior de la célula antes de formar una OA funcional durante ocho etapas morfológicas3. Estas etapas se han observado secuencialmente, independientemente de la temperatura, y proporcionan un punto de referencia universal para casi todos los estudios5.
El análisis mecanicista de la regeneración del stentor requiere herramientas para medir el momento de la regeneración que sean lo suficientemente robustas y simples como para aplicarse a múltiples muestras como parte de una pantalla química o molecular. El método estándar para realizar un ensayo basado en células es la obtención de imágenes, en este caso, la obtención de imágenes de la formación de nueva OA durante la regeneración. Sin embargo, tales ensayos basados en imágenes son más efectivos cuando la estructura regeneradora contiene distintos componentes moleculares que se pueden usar como marcadores, de modo que se detecten fácilmente en una imagen de fluorescencia. En el caso del Stentor OA, los componentes conocidos (cilios, cuerpos basales) también están presentes en el resto de la superficie celular; por lo tanto, reconocer la restauración de la OA no puede lograrse simplemente buscando la presencia o ausencia de un componente.
Más bien, se requeriría alguna forma de reconocimiento de forma para detectar una OA, y esto es potencialmente muy desafiante dado el hecho de que las células stentor a menudo cambian de forma a través de un proceso contráctil rápido. Este artículo presenta un ensayo alternativo para la regeneración que se basa en la actividad móvil del cuerpo y los cilios de OA. A medida que la OA se regenera, los cilios recién formados experimentan cambios reproducibles en la posición y la actividad, lo que a su vez, afecta la motilidad de natación de la célula. Mediante el análisis de la motilidad, es posible realizar un ensayo de "regeneración funcional" que cuantifica la regeneración cuantificando la función de las estructuras regeneradas. El análisis previo de la función ciliar del stentor durante la regeneración utilizó la velocimetría de imagen de partículas, combinada con perlas trazadoras agregadas a los medios externos, para observar cambios en el patrón de flujo en diferentes etapas de la regeneración7; sin embargo, este enfoque requiere imágenes laboriosas de células individuales y sus campos de flujo asociados, uno a la vez.
Al utilizar el movimiento de la propia célula como un proxy para el flujo generado por los cilios, sería posible analizar un mayor número de células en paralelo, utilizando sistemas de imágenes de baja resolución compatibles con plataformas de detección de alto rendimiento. Este ensayo puede, en principio, ser utilizado para estudiar el desarrollo y la regeneración funcional en otros organismos nadadores en la escala de tamaño de cientos de micras a milímetros. La sección 1 del protocolo describe la construcción de un portaobjetos de muestra de múltiples pozos, que permite obtener imágenes de alto rendimiento de una población de células durante un día entero. Se proporcionan detalles sobre cómo ajustar para su uso con otros tipos de células. La sección 2 del protocolo cubre la adquisición de datos de video para este ensayo, que se puede lograr en un microscopio de disección con una cámara réflex digital de lente única. La sección 3 del protocolo proporciona un recorrido por el seguimiento de celdas y el cálculo de la velocidad de las celdas utilizando el código MATLAB (Información complementaria). La Sección 4 del protocolo explica cómo convertir los resultados numéricos en gráficos como se muestra en la Figura 1C-F y la Figura 2C para facilitar la interpretación de los resultados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25 mm-thick silicone sheet</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>CWS-S-0.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm, #1.5 coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1034527</td>
			<td>As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We used Nikon D750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas 137c WT strain</td>
			<td>Chlamydomonas Resource Center</td>
			<td>CC-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MATHWORKS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Image Processing Toolbox</td>
			<td>MATHWORKS</td>
			<td></td>
			<td>needed for TrackCells.m and CleanTraces.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox</td>
			<td>MATHWORKS</td>
			<td></td>
			<td>needed for TrackCells.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with camera port</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteurized Spring Water</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>132458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Growth Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1379801</td>
			<td>Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of motility patterns of stentor during and after oral apparatus regeneration using cell tracking

Stentor coeruleus es un organismo modelo bien conocido para el estudio de la regeneración unicelular. El análisis transcriptómico de células individuales reveló cientos de genes, muchos no asociados con el aparato oral (OA), que están regulados diferencialmente en fases a lo largo del proceso de regeneración. Se planteó la hipótesis de que esta reorganización sistémica y movilización de recursos celulares hacia el crecimiento de una nueva OA conducirá a cambios observables en el movimiento y el comportamiento correspondientes en el tiempo a las fases de expresión génica diferencial. Sin embargo, la complejidad morfológica de S. coeruleus requirió el desarrollo de un ensayo para capturar las estadísticas y la escala de tiempo. Se utilizó un script personalizado para rastrear celdas en videos cortos, y se compilaron estadísticas sobre una gran población (N ~ 100). Tras la pérdida de la OA, S. coeruleus inicialmente pierde la capacidad de movimiento dirigido; luego, a partir de ~ 4 h, exhibe una caída significativa en la velocidad hasta ~ 8 h. Este ensayo proporciona una herramienta útil para el cribado de fenotipos de motilidad y puede ser adaptado para la investigación de otros organismos.

El objetivo de este ensayo es cuantificar el cambio gradual de los patrones de movimiento y el aumento gradual de la velocidad de movimiento de las células dentro de una gran población de stentores regeneradores (N ~ 100). Para facilitar la interpretación de los resultados, el código personalizado incluido en este protocolo genera dos tipos de gráficos: una superposición de todos los rastros de movimiento celular en un conjunto de datos de video (Figura 1C-F<s...

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Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

Presentamos un protocolo para la caracterización de la motilidad y el comportamiento de una población de células de cien micras a milímetros utilizando microscopía de campo brillante y seguimiento celular. Este ensayo revela que Stentor coeruleus pasa por cuatro fases conductualmente distintas al regenerar un aparato oral perdido.

Análisis de los patrones de motilidad del estentor durante y después de la regeneración del aparato oral mediante el seguimiento celular

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds ...

Stentor coeruleus se ha empleado durante mucho tiempo como un organismo modelo para comprender la regeneración unicelular. Si bien se conoce la línea de tiempo para la regeneración morfológica visual, la línea de tiempo para la regeneración funcional sigue siendo desconocida. Este ensayo rastrea la motilidad de la población del centro sometida a regeneración sincronizada de tal manera que se pueda cuantificar la función de recuperación de la pérdida.Se puede adaptar para su uso con otros tipos de células. La falta de un sello seguro de la cámara de imágenes dará lugar a que los pozos se filtren entre sí o a que se formen burbujas de aire dentro de los pozos. Para los investigadores que no están familiarizados con el uso de espaciadores de silicona, recomendamos encarecidamente que PSW u otro medio limpio se canalice en cada uno de los pozos para probar si hay fugas antes de su uso.La construcción de las cámaras de muestra es más fácil de mostrar que de describir verbalmente. Como lo es el proceso para extraer patrones de motilidad de los datos de video adquiridos. Para comenzar, corte un trozo de lámina espaciadora de silicona de 250 micrómetros de espesor ligeramente más pequeña tanto en altura como en anchura que un portaobjetos de microscopio.Use un punzón entero para crear pozos circulares dejando suficiente espacio entre los pozos vecinos para garantizar un buen sellado. Iniciar la regeneración del aparato oral incubando células de stentor coeruleus en 10% sacarosa o 2%uria durante dos minutos. Luego lavar tres veces con medio fresco.Pipetee suavemente aproximadamente 10 estenadores en cada pozo. Tener cuidado de hacer coincidir el volumen de la muestra con el volumen del pozo lo más cerca posible. Cierre los pozos bajando suavemente un trozo de vidrio de cubierta sobre los pozos a partir de un borde.Use un objeto estrecho y ligeramente flexible, como una punta de pipeta de 10 microlitros para presionar hacia abajo sobre el vidrio de la cubierta donde entra en contacto con la lámina de silicona para garantizar un buen sellado. Coloque la muestra en el escenario del microscopio y ajuste el microscopio al aumento más bajo disponible para que uno quepa bien en el marco. Comience el lapso de tiempo y adquiera un video de diez segundos a 30 cuadros por segundo de cada pozo en cada punto de tiempo.Para calibrar, adquiera una imagen clara de una diapositiva de calibración o una regla clara con la misma configuración de ampliación que los vídeos. Usando cualquier programa de visualización de imágenes, cuente el número de píxeles entre marcas de una distancia física conocida. Descargue los dos scripts, rastree las celdas y limpie los rastros a una ubicación fácil de recordar en la computadora y transfiera los videos de datos a esta computadora también.Organice los videos de datos en carpetas. Uno por cada punto de tiempo. Utilice las celdas de seguimiento de script para realizar un seguimiento de celda automatizado en los vídeos de datos abriendo celdas de pista y ejecutando el script Elija agregar a ruta" si se lo solicita una ventana emergente que normalmente solo ocurrirá cuando el script se ejecute por primera vez desde una carpeta determinada.Cuando se le solicite, seleccione uno o más videos de datos para iniciar el seguimiento. Navegue hasta los vídeos de datos y, una vez satisfecho con la lista de archivos, haga clic en abrir"Para rechazar manualmente los rastros anómalos o falsos, abra los rastros limpios en la ventana del editor de MATLAB haciendo doble clic en el archivo. En el símbolo del sistema, seleccione la salida de la carpeta de datos por celdas de seguimiento.Desplácese hasta una de las carpetas creadas y selecciónela. Cuando se le solicite, escriba uno para mantener el seguimiento y cero para rechazar el seguimiento. A continuación, pulse Intro para pasar al siguiente seguimiento.Comience descargando el guión titulado diagramas de espagueti. Abra y ejecute el script. Cuando aparezca la ventana del explorador de archivos con el mensaje, seleccione la carpeta que desea abrir.Desplácese hasta la carpeta de uno de los puntos de tiempo. Cuando se solicita la calibración, ¿cuál es el número de píxeles por milímetro? Escriba el valor de calibración y pulse Intro.Ajuste los ejes de la gráfica según sea necesario cambiando la línea 55 del script, que de forma predeterminada se establece en RR igual a cuatro. para incluir un radio de hasta cuatro milímetros. Guarda la parcela.Los resultados muestran la motilidad colectiva de la población de células estentoras a las dos, tres, siete y ocho horas del proceso de regeneración del aparato oral. Estas gráficas muestran tanto el aumento esperado en el número de individuos móviles como el aumento de cuatro veces en el rango de las células más móviles dentro de la población. Las células de natación más rápidas, si se inician cerca del borde, están restringidas de nadar completamente en línea recta y su rango de movimiento parece más pequeño.Las células del tracto se clasificaron en tres categorías distintas, no móviles sin retención visible rápida, no móviles con retención visible y móviles. El resultado mostró un histograma apilado que resume los recuentos de células relativas en estas categorías en función de la nuestra en la regeneración. En épocas posteriores, se encontró un número significativo de células en colonias con ayunos visibles que sugerían fuertemente que habían explorado el medio ambiente y se habían unido preferentemente cerca de otras de su tipo.Es importante seleccionar las dimensiones del pozo de muestra que funcionan bien para el stentor coeruleus que tienen aproximadamente un milímetro de tamaño. Esto incluye el grosor del espaciador de silicona de 5/16 pulgadas de diámetro y 10 celdas por pozo. Estos números deben ajustarse al adaptar este protocolo para otros tipos de células.Este ensayo se puede realizar junto con el ARN-I para investigar y comparar la regeneración de diferentes fenotipos de estenadores.

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

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