Name: generation of a simplified three-dimensional skin-on-a-chip model in a micromachined microfluidic platform
Uploaded: 2021-05-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform at JoVE.com

Vi takker oprigtigt Dr. Javier Rodríguez, Dr. María Luisa López, Carlos Matellán og Juan Francisco Rodríguez for meget nyttige forslag, diskussioner og / eller foreløbige data. Vi takker også venligst bidrag fra Sergio Férnandez, Pedro Herreros og Lara Stolzenburg til dette projekt. Særlig tak til Dr. Marta García for GFP-mærket hFBs og hKCs. Endelig anerkender vi guillermo Vizcaínos og Angélica Corrals fremragende tekniske bistand. Dette arbejde blev støttet af "Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid", Projekt S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Dette arbejde blev også støttet af "Programa de excelencia", Project EPUC3M03, CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.

1. Chip design og micromachining parametre
<ol><li>Design de mikrofluidiske spånlag med FreeCAD open source-designsoftware; se tabel 1 for kanalernes dimensioner. Medtag fire huller med en diameter på 2,54 mm i designet for at bruge en skræddersyet aligner til en korrekt lag superposition.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Længde (μm)</td>
			<td>Bredde (μm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nederste kammer</td>
	...

<ol>
	<li>McNamee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tiered+approach+to+the+use+of+alternatives+to+animal+testing+for+the+safety+assessment+of+cosmetics:+Eye+irritation.">A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 54 (2), 197-209 (2009).</li><li>Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+skin+models+in+drug+development.">The use of skin models in drug development.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 81-102 (2014).</li><li>Abd, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+models+for+the+testing+of+transdermal+drugs.">Skin models for the testing of transdermal drugs.</a> Clinical Pharmacology: Advances and Applications. 8, 163-176 (2016).</li><li>Flaten, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+skin+models+as+a+tool+in+optimization+of+drug+formulation.">In vitro skin models as a tool in optimization of drug formulation.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 75, 10-24 (2015).</li><li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+skin+disease+for+drug+discovery.">Animal models of skin disease for drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 8 (3), 331-355 (2014).</li><li>Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lost+in+translation:+animal+models+and+clinical+trials+in+cancer+treatment.">Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment.</a> American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).</li><li>Pronko, P. P., VanRompay, P. A., Zhang, Z., Nees, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pronko+et+al.+Reply.">Pronko et al. Reply.</a> Physical Review Letters. 86 (7-12), 1387 (2001).</li><li>H.R.2858 - Humane Cosmetics Act. 114th Congress Available from: <a target="_blank" href="https://congress.gov/bill/114th-congress/house-bill/2858">https://congress.gov/bill/114th-congress/house-bill/2858</a> (2016)</li><li>. Global in-vitro toxicology testing market report: size, share &amp; trends analysis 2014-2015 Available from: <a target="_blank" href="https://www.prnewswire.com/news-releases/global-in-vitro-toxicology-testing-market-report-size-share--trends-analysis-2014-2025-300704958.html">https://www.prnewswire.com/news-releases/global-in-vitro-toxicology-testing-market-report-size-share--trends-analysis-2014-2025-300704958.html</a> (2018)</li><li>Zhang, Z., Michniak-Kohn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineered+human+skin+equivalents.">Tissue engineered human skin equivalents.</a> Pharmaceutics. 4 (1), 26-41 (2012).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+skin+corrosion:+reconstructed+human+epidermis+(RhE)+test+method.+Test+Guideline+No.431.">In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RhE) test method. Test Guideline No.431.</a> OECD Guideline for Testing of Chemicals. , (2019).</li><li>Almeida, A., Sarmento, B., Rodrigues, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+in+vitro+models+for+safety+and+toxicity+assessment+of+cosmetic+ingredients.">Insights on in vitro models for safety and toxicity assessment of cosmetic ingredients.</a> International Journal of Pharmaceutics. 519 (1-2), 178-185 (2017).</li><li>vanden Broek, L. J., Bergers, L. I. J. C., Reijnders, C. M. A., Gibbs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+future+Prospectives+in+Skin-on-Chip+Development+with+Emphasis+on+the+use+of+Different+Cell+Types+and+Technical+Challenges.">Progress and future Prospectives in Skin-on-Chip Development with Emphasis on the use of Different Cell Types and Technical Challenges.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 13 (3), 418-429 (2017).</li><li>Ata&#231;, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+on-a-chip:+In+vitro+skin+models+versus+ex+vivo+tissue+maintenance+with+dynamic+perfusion.">Skin and hair on-a-chip: In vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion.</a> Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).</li><li>Abaci, H. E., Gledhill, K., Guo, Z., Christiano, A. M., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pumpless+microfluidic+platform+for+drug+testing+on+human+skin+equivalents.">Pumpless microfluidic platform for drug testing on human skin equivalents.</a> Lab on a Chip. 15 (3), 882-888 (2015).</li><li>Wu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-thickness+human+skin-on-chip+with+enhanced+epidermal+morphogenesis+and+barrier+function.">Full-thickness human skin-on-chip with enhanced epidermal morphogenesis and barrier function.</a> Materials Today. 21 (4), 326-340 (2017).</li><li>Materne, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multi-organ+chip+-+a+microfluidic+platform+for+long-term+multi-tissue+coculture.">The multi-organ chip - a microfluidic platform for long-term multi-tissue coculture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52526 (2015).</li><li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+of+a+full-thickness+skin+equivalent+in+a+96-well+insert+format+for+substance+permeation+studies+and+organ-on-a-chip+applications.">Bioengineering of a full-thickness skin equivalent in a 96-well insert format for substance permeation studies and organ-on-a-chip applications.</a> Bioengineering. 5 (2), 43 (2018).</li><li>Alberti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-chamber+microfluidic+platform+for+high-precision+skin+permeation+testing.">Multi-chamber microfluidic platform for high-precision skin permeation testing.</a> Lab on a Chip. 17, 1625-1634 (2017).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature BIotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li><li>Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+3D+cell+culture+to+organs-on-chips.">From 3D cell culture to organs-on-chips.</a> Trends in Cell Biology. 21 (12), 745-754 (2011).</li><li>Wufuer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-on-a-chip+model+simulating+inflammation,+edema+and+drug-based+treatment.">Skin-on-a-chip model simulating inflammation, edema and drug-based treatment.</a> Scientific Reports. 6, 37471 (2016).</li><li>Ramadana, Q., Ting, F. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micro-physiological+immune-competent+model+of+the+human+skin.">In vitro micro-physiological immune-competent model of the human skin.</a> Lab on a Chip. 16, 1899-1908 (2016).</li><li>Kim, K., Jeon, H. M., Choi, K. C., Sung, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+effectiveness+of+Curcuma+longa+leaf+extract+on+a+skin+equivalent+using+a+pumpless+skin-on-a-chip+model.">Testing the effectiveness of Curcuma longa leaf extract on a skin equivalent using a pumpless skin-on-a-chip model.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3898 (2020).</li><li>Halldorsson, S., Lucumi, E., G&#243;mez-Sj&#246;berg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices.">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li><li>Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+disease+model+of+drug+toxicity+-+induced+pulmonary+edema+in+a+lung-on-a-chip+microdevice.">A human disease model of drug toxicity - induced pulmonary edema in a lung-on-a-chip microdevice.</a> Scientific Translational Medicine. 4 (159), (2012).</li><li>Beckwitt, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+'+organ+on+a+chip+'.">Liver ' organ on a chip '.</a> Experimental Cell Research. 363 (1), 15-25 (2018).</li><li>Poceviciute, R., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-gut-microbiome+on+a+chip.">Human-gut-microbiome on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 500-501 (2019).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).</li><li>Esc&#225;mez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+optimal+virus-mediated+growth+factor+gene+delivery+for+human+cutaneous+wound+healing+enhancement.">Assessment of optimal virus-mediated growth factor gene delivery for human cutaneous wound healing enhancement.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128 (6), 1565-1575 (2008).</li><li>Llames, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+plasma+as+a+dermal+scaffold+for+the+generation+of+a+completely+autologous+bioengineered+skin.">Human plasma as a dermal scaffold for the generation of a completely autologous bioengineered skin.</a> Transplantation. 77 (3), 350-355 (2004).</li><li>Llames, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+results+of+an+autologous+engineered+skin.">Clinical results of an autologous engineered skin.</a> Cell Tissue Bank. 7 (1), 47-53 (2006).</li><li>Cubo, N., Garcia, M., del Ca&#241;izo, J. F., Velasco, D., Jorcano, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+functional+human+skin:+production+and+in+vivo+analysis.">3D bioprinting of functional human skin: production and in vivo analysis.</a> Biofabrication. 9 (1), 015006 (2016).</li><li>Mori, N., Morimoto, Y., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+integrated+with+perfusable+vascular+channels+on+a+chip.">Skin integrated with perfusable vascular channels on a chip.</a> Biomaterials. 116, 48-56 (2017).</li><li>Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+microbiome+and+mechanical+deformation+to+intestinal+bacterial+overgrowth+and+inflammation+in+a+human+gut-on-a-chip.">Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 7-15 (2016).</li><li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidics-based+in+vitro+model+of+the+gastrointestinal+human-microbe+interface.">A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface.</a> Nature Communications. 7, 11535 (2016).</li><li>Marx, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-on-a-chip'+developments:+A+translational+cuttingedge+alternative+to+systemic+safety+assessment+and+efficiency+evaluation+of+substances+in+laboratory+animals+and+man.">Human-on-a-chip' developments: A translational cuttingedge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 40 (5), 235-257 (2012).</li><li>Bein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organ-on-a-chip+models+of+human+intestine.">Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).</li><li>Bennet, D., Estlack, Z., Reid, T., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microengineered+human+corneal+epithelium-on-a-chip+for+eye+drops+mass+transport+evaluation.">A microengineered human corneal epithelium-on-a-chip for eye drops mass transport evaluation.</a> Lab on a Chip. 18, 1539-1551 (2018).</li><li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow.">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab on a chip. 12, 2165-2174 (2012).</li><li>Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut-on-a-chip+microenvironment+induces+human+intestinal+cells+to+undergo+villus+differentiation.">Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation.</a> Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).</li><li>O'Neill, A. T., Monteiro-Riviere, N. A., Walker, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microfluidic+human+epidermal+keratinocyte+culture.">Characterization of microfluidic human epidermal keratinocyte culture.</a> Cytotechnology. 56 (3), 197-207 (2008).</li><li>Ren, K., Chen, Y., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+materials+for+microfluidics+in+biology.">New materials for microfluidics in biology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 25, 78-85 (2014).</li></ol>

Motivationen til at udvikle denne metode var ønsket om at modellere hudsygdomme og studere virkningerne af nye og innovative behandlinger i en platform med høj kapacitet. Til dato producerer dette laboratorium disse dermo-epidermale ækvivalenter ved støbning-enten manuelt eller ved hjælp af 3D bioprinting teknologi-fibrin gel med fibroblaster i en celle kultur indsætte plade og såning keratinocytterne på toppen af det. Når keratinocytterne når sammenløb, er 3D-kulturen udsat for den luft-flydende grænseflade,...

For nylig er der gjort fremskridt i retning af udvikling og produktion af in vitro menneskelige hudmodeller til analyse af toksiciteten af kosmetiske og farmaceutiske produkter1. Forskere i farmaceutiske og hudpleje industrier har brugt dyr, mus er den mest almindelige, at teste deres produkter2,3,4,5. Forsøgsprodukter på dyr er imidlertid ikke altid forudsigende for reaktionen hos mennesker, hvilket ofte fører til lægemiddelsvigt eller bivirkninger hos mennesker og dermed til økonomiske tab5,6. Det Forenede Kongerige var det første land, der forbød brugen af dyr til kosmetiske forsøg i 1998. Senere, i 2013, forbød EU testning og anvendelse af kosmetik hos dyr (EU's kosmetikforordning nr. 1223/2009)7.
Dette forbud behandles også af andre lande, f.eks. Ud over etiske bekymringer gør de anatomiske forskelle mellem dyre- og menneskehud dyreforsøg tidskrævende, dyre og ofte ineffektive. Desuden forventes den globale in vitro-toksikologiske markedsstørrelse at nå OP PÅ USD 26,98 mia. Af disse grunde er der behov for at udvikle nye metoder og alternativer til disse in vitro-undersøgelser, såsom bioengineered human hud modeller, der gør det muligt at teste for sikkerhed og toksiske virkninger af kosmetik og lægemidler uden brug af dyr.
Der er to forskellige former for kommercielt tilgængelige, in vitro, menneskelige hudmodeller. Den første type består af stratificerede epidermale ækvivalenter, der indeholder flere lag af differentiere keratinocytter, der er seedet på forskellige materialer. Nogle af dem er godkendt af Organisationen for Økonomisk Samarbejde og Udvikling (OECD) og godkendt af (Det Europæiske Center for Validering af Alternative Metoder (ECVAM) til hudkorrosions- og irritationstest, såsom EpiDerm eller SkinEthic10,11,12. Den anden type er fuld hud ækvivalenter med et lag af differentiere menneskelige keratinocytter seedet på en tre-dimensionel (3D) stillads, der indeholder fibroblaster, såsom T-Skin og EpiDerm-FT. Disse modeller dyrkes dog under statiske forhold, hvilket gør dem ude af stand til præcist at repræsentere menneskelige fysiologiske forhold.
Den seneste interesse har fokuseret på at generere in vitro 3D-hudmodeller i cellekultur-insert (CCI) formater med dynamisk perfusion13,14,15,16,17,18,19. Disse systemer kan dog ikke betragtes som stricto sensu som mikrofluidiske skin-on-chips i henhold til deres klassiske definition på området. Ingbers definition for organer-on-a-chip siger, at organet skal placeres inde i de mikrofluidiske kanaler, hvilket er en betingelse, at kun få enheder opfylder20,21. Skin-on-chips har hidtil modelleret det meste simple epithelia som encellede lag og / eller dermal cellelag adskilt af en porøsmembran 22,23. Selv om der har været nogle fremskridt modellering hud i mikrofluidiske systemer16,24, der er i øjeblikket ingen litteratur, der viser et organ-on-a-chip system, der passer Ingber definition, i stand til at producere en flerlags hud in situ og herunder både epitel og stromale komponenter.
I dette arbejde præsenteres en ny, omkostningseffektiv, robust, vinylbaseret mikrofluidisk platform til hud-på-en-chip-applikationer. Denne platform blev produceret af mikro-bearbejdning, som giver mere enkelhed i fremstillingsprocessen, samt øget fleksibilitet og alsidighed i layoutet af enheden, overvinde nogle af begrænsningerne i PDMS25. En måde at indføre en forenklet hudkonstruktion gennem en parallel strømning kontrolleret med sprøjtepumper blev også designet. Parallel flow tillader to væsker med meget forskellige viskositeter (en buffer og fibrin pre-gel i dette tilfælde) at blive perfused gennem en kanal uden at blande sig med hinanden. Som et bevis på konceptet blev en dermo-epidermal konstruktion, der indeholder fibroblaster indlejret i en fibrin matrix, der efterligner dermis, introduceret i enheden, oven på hvilken en monolag af keratinocytter blev indlæst for at efterligne de udifferentierede epidermis. Dermalrumshøjden kan moduleres ved at ændre flowhastighederne. Den vigtigste nyhed i dette arbejde, sammenlignet med tidligere beskrevne modeller22,26,27,28,29, er udviklingen af en 3D-konstruktion inde i et mikrokammer ved hjælp af mikrofluidics. Selv om denne artikel præsenterer en forenklet udifferentieret hud, det langsigtede mål er at generere og karakterisere en fuldt differentieret hud konstruere til at demonstrere sin levedygtighed og funktionalitet til narkotika og kosmetiske testformål.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amchafibrin</td>
			<td>Rottafarm</td>
			<td></td>
			<td>Tranexamic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic</td>
			<td>Thermo Scientific HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape vynil</td>
			<td>ATP Adhesive Systems</td>
			<td></td>
			<td>GM 107CC, 12 &#181;m thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edge plotter</td>
			<td>Brother</td>
			<td></td>
			<td>Scanncut CM900</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Scientific HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Extracted from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-Human dermal fibroblasts</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Primary. Gift from Dr. Marta Garc&#237;a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2B-GFP-HaCaT cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta Garc&#237;a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/dead kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Merk TM</td>
			<td></td>
			<td>5 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>Sylgard 184</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>10 NIH/vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent adhesive vinyl</td>
			<td>Mactac</td>
			<td></td>
			<td>JT 8500 CG-RT, 95 &#181;m thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td></td>
			<td>Teflon, 1/16&#8221; OD, 0.020&#8221; ID</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a simplified three-dimensional skin-on-a-chip model in a micromachined microfluidic platform

Dette arbejde præsenterer en ny, omkostningseffektiv og pålidelig mikrofluidisk platform med potentiale til at generere komplekse flerlagsvæv. Som et proof of concept er en forenklet og udifferentieret menneskelig hud, der indeholder et dermalt (stromalt) og et epidermalt (epitel) rum, blevet modelleret. For at opnå dette er der udviklet en alsidig og robust, vinylbaseret enhed opdelt i to kamre, der overvinder nogle af de ulemper, der er til stede i mikrofluidiske enheder baseret på polydimethylsiloxan (PDMS) til biomedicinske applikationer, såsom brug af dyrt og specialiseret udstyr eller absorption af små hydrofobiske molekyler og proteiner. Desuden blev der udviklet en ny metode baseret på parallelstrømning, der gjorde det muligt at placere både dermale og epidermale rum. Hudkonstruktionen består af en fibrinmatrix, der indeholder menneskelige primære fibroblaster og en monolag af udødeliggjorte keratinocytter sået på toppen, som efterfølgende opretholdes under dynamiske kulturforhold. Denne nye mikrofluidiske platform åbner mulighed for at modellere menneskelige hudsygdomme og ekstrapolere metoden til at generere andre komplekse væv.

Den designede chip består af to fluidiske kamre adskilt af en 5 μm pore størrelse PC membran, der tillader vækst af cellen ved at tillade passage af vækstfremmende molekyler fra det nederste kammer. Det øverste kammer holder vævskonstruktionen, i dette tilfælde en monolag af hKCs på en fibrin hydrogel indeholdende hFBs.
Kanalernes højde bestemmes af antallet af klæbeark, der tilsættes hver kanal. Det nederste kammer består af 4 lag (380 μm) og det øverste af 10 ensidige tapelag ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform at JoVE.com

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

Her præsenterer vi en protokol til at generere en tredimensionel forenklet og udifferentieret hudmodel ved hjælp af en mikromaskineret mikrofluidisk platform. En parallel flow tilgang gør det muligt in situ deposition af et dermalt rum til såning af epitelceller på toppen, alle styres af sprøjte pumper.

Generering af en forenklet tredimensionel skin-on-a-chip-model i en mikromaskiner med mikrofluidisk platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Dette er en ny, litografi-fri protokol til modellering af en 3D hud-on-chip ved hjælp af micromachined, selvklæbende vinyl lag og en parallel-flow metode til dermal rum generation. Micromachined vinyl giver mere enkelhed i fremstillingsprocessen og alsidighed i enhedens layout og overvinder nogle af begrænsningerne i PDMS og traditionelle litografitilgange. Denne flerlags hud-on-a-chip kan bruges til narkotika og kosmetiske test tilgange, da det giver mulighed for high-throughput screening til lavere omkostninger og kan bruges til at modellere flere sygdomme.Begynd med at designe en mikrofluidisk chip ved hjælp af Brother Canvas Workspace-software. Opret et arbejdsområde på 30 gange 30 centimeter, og fyld det med designmønstrene for de forskellige lag af chippen, før du gemmer det i en svg-fil. Skær de 30 gange 30 centimeter vinylplader.Stik den til en lav-tack klæbemåtte og fjern alle luftbobler, efter behov. Ved hjælp af et USB-drev skal du uploade svg-filen til kantplotteren og indstille skæreparametrene som skæretryk på niveau nul, skæreklinge på niveau tre og niveau et for skærehastigheden. Når parametrene er indstillet, placere den klæbende måtte med vinyl i plotter og starte processen med at skære kanalen mønstre på 95-mikrometer-tyk vinyl.Saml hele enheden ved hjælp af en aligner til korrekt justering kanaler, indløb og afsætningsmuligheder. Hober sig op for vinyl lag med en tilsvarende mikromaskine design til montering af den nederste kanal, holde dækbåndet af det nederste lag for at undgå at holde sig til aligner. Skær og læg polycarbonat porøsmembranen oven på den nederste kanal uden at dække indløbene.Tilføj 10 vinyl lag med det øverste kammer design og holde en dobbelt-sidet tape sidste lag på toppen. Fjern chippen fra aligneren for at sætte den på glasrutschebanen. Placer et to millimeter tykt PDMS-ark oven på det dobbeltsidede bånd vinyllag.For at sikre, at chippen er helt vandtæt, skal du efterlade en vægt oven på chippen natten over. Den næste dag steriliseres chippen ved at skylle den med 70% ethanol i fem minutter, efterfulgt af en vask med destilleret vand. Tilslut pumpen en og pumpe to til det øverste kammer indløb en og det øverste kammer indløb to, henholdsvis.Tilslut pumpe tre til den nederste kammer indløb, derefter forbinde det øverste kammer og lavere kammer forretninger til et affaldskar. Tilslut sprøjterne til hvert indløb ved hjælp af PTFE-rør og 18-gauge rustfrit stål stik. Pump PBS med pumpe tre gennem det nederste kammer indløb ved 50 mikroliter i minuttet, og med pumpe to gennem det øverste kammer indløb to på 100 mikroliter i minuttet.Læg derefter sprøjten med fibrinogen pre-gel, læg den straks i pumpe en og kør den ved 200 mikroliter i minuttet. Når pre-gelen forlader den øverste kammerudtag, stop pumper en og to, og lad derefter chippen stå ved 37 grader Celsius i 10 minutter uden at fjerne slangen. Efter gellation, blokere det øverste kammer indløb en med en hætte, og pumpe kulturmediet gennem det øverste kammer indløb to med pumpe tre på 50 mikroliter i timen natten over.24 timer efter generationen af dermalrummet skal du kontrollere, at menneskelige primære fibroblastceller spredes i samlingen, og derefter introducere fem gange 10 til de 6 HKCs pr. milliliter gennem den øvre kanalindløb to ved 40 mikroliter i minuttet i et minut. For celletilbehør skal du placere chippen natten over ved 37 grader Celsius i en fugtighedsmættet inkubator. Begynd at pumpe frisk kulturmedium med pumpe tre kun gennem det nederste kammerindtag ved 50 mikroliter i minuttet.I den repræsentative analyse vises hydrogelens højde langs det øverste kammer på samlingen. En gennemsnitlig højde på 550 mikrometer var optimal for gelens funktion ved strømningshastighederne på henholdsvis 100 og 200 mikroliter i minuttet for offer PBS og prægelen. Manglende skylning af PBS gennem den nederste kanal førte til uoverensstemmelser mellem gelens teoretiske højde og den målte med en forskel på 40% Efter 24 timer fra indledningen af parallelstrømsprotokollen viste det sig, at de menneskelige primære fibroblaster med succes blev spredt i fibringelen i det øverste kammer på samlingen, hvorefter grønne fluorescerende protein-udtrykkende HKCs effektivt kunne sås på toppen af hydrogel.Fjernelse af slanger uden at holde systemet lukket natten over for at give HKCS til sediment resulterede i en ikke-ensartet, sammenflydende monolag af celler. 3D confocal analyse af den udifferentierede hud model i mikrofluidiske chip viste tydeligt overfladen af hydrogel adskille HKCs i toppen fra fibroblast indlejret i bunden. Den genererede hud kan udsættes for luft /væske interface for at opnå en moden og differentieret epidermis, og yderligere karakteriseres ved hjælp af flere dermale og epidermal markører.Denne teknik giver mulighed for en hurtigere og billigere enhedsfremstilling og generering af flerlags hud ved hjælp af mikrofluidics, hvilket giver en mere realistisk tilgang til narkotika- og kosmetiktest.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Planar-og tredimensionelle Udskrivning af ledende blæk

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator Ved hjælp af en Mikrofluid Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Cell Klemme som en robust, Mikrofluid Intracellulær Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

Undersøgelse af tre-dimensionelle Flow Separation induceret af en model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generation af en tre-dimensionel fuld tykkelse Skin Equivalent og Automated Anskydning

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrikation af Inverted Kolloid Crystal Poly (ethylenglycol) Stillads: En Tre-dimensionel Cell Culture Platform for levervæv Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Fremstilling af Tre-dimensionel papir-baserede mikrofluidenheder for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Mikrofluid Platform med Multiplexed Elektronisk Detection for fysisk sporing af partikler

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

En mikrofluid Platform for langsgående Imaging i Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...