Name: generation of a simplified three-dimensional skin-on-a-chip model in a micromachined microfluidic platform
Uploaded: 2021-05-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform at JoVE.com

We bedanken Dr. Javier Rodríguez, Dr. María Luisa López, Carlos Matellán en Juan Francisco Rodríguez oprecht voor zeer nuttige suggesties, discussies en/of voorlopige gegevens. We bedanken ook de bijdragen van Sergio Férnandez, Pedro Herreros en Lara Stolzenburg aan dit project. Speciale dank gaat uit naar Dr. Marta García voor GFP-gelabelde hFBs en hKCs. Tot slot erkennen we de uitstekende technische assistentie van Guillermo Vizcaíno en Angélica Corral. Dit werk werd ondersteund door het "Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid", Project S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Dit werk werd ook ondersteund door het "Programa de excelencia", Project EPUC3M03, CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.

1. Chipontwerp en microbewerkingsparameters
<ol><li>Ontwerp de microfluïdische chiplagen met FreeCAD open-source ontwerpsoftware; zie tabel 1 voor de afmetingen van de kanalen. Neem vier gaten met een diameter van 2,54 mm op in het ontwerp om een op maat gemaakte aligner te gebruiken voor een juiste laagsuperpositie.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Lengte (μm)</td>
			<td>Breedte (μm)</td>
		</tr>
<tr>
...

<ol>
	<li>McNamee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tiered+approach+to+the+use+of+alternatives+to+animal+testing+for+the+safety+assessment+of+cosmetics:+Eye+irritation.">A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 54 (2), 197-209 (2009).</li><li>Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+skin+models+in+drug+development.">The use of skin models in drug development.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 81-102 (2014).</li><li>Abd, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+models+for+the+testing+of+transdermal+drugs.">Skin models for the testing of transdermal drugs.</a> Clinical Pharmacology: Advances and Applications. 8, 163-176 (2016).</li><li>Flaten, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+skin+models+as+a+tool+in+optimization+of+drug+formulation.">In vitro skin models as a tool in optimization of drug formulation.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 75, 10-24 (2015).</li><li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+skin+disease+for+drug+discovery.">Animal models of skin disease for drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 8 (3), 331-355 (2014).</li><li>Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lost+in+translation:+animal+models+and+clinical+trials+in+cancer+treatment.">Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment.</a> American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).</li><li>Pronko, P. P., VanRompay, P. A., Zhang, Z., Nees, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pronko+et+al.+Reply.">Pronko et al. Reply.</a> Physical Review Letters. 86 (7-12), 1387 (2001).</li><li>H.R.2858 - Humane Cosmetics Act. 114th Congress Available from: <a target="_blank" href="https://congress.gov/bill/114th-congress/house-bill/2858">https://congress.gov/bill/114th-congress/house-bill/2858</a> (2016)</li><li>. Global in-vitro toxicology testing market report: size, share &amp; trends analysis 2014-2015 Available from: <a target="_blank" href="https://www.prnewswire.com/news-releases/global-in-vitro-toxicology-testing-market-report-size-share--trends-analysis-2014-2025-300704958.html">https://www.prnewswire.com/news-releases/global-in-vitro-toxicology-testing-market-report-size-share--trends-analysis-2014-2025-300704958.html</a> (2018)</li><li>Zhang, Z., Michniak-Kohn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineered+human+skin+equivalents.">Tissue engineered human skin equivalents.</a> Pharmaceutics. 4 (1), 26-41 (2012).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+skin+corrosion:+reconstructed+human+epidermis+(RhE)+test+method.+Test+Guideline+No.431.">In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RhE) test method. Test Guideline No.431.</a> OECD Guideline for Testing of Chemicals. , (2019).</li><li>Almeida, A., Sarmento, B., Rodrigues, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+in+vitro+models+for+safety+and+toxicity+assessment+of+cosmetic+ingredients.">Insights on in vitro models for safety and toxicity assessment of cosmetic ingredients.</a> International Journal of Pharmaceutics. 519 (1-2), 178-185 (2017).</li><li>vanden Broek, L. J., Bergers, L. I. J. C., Reijnders, C. M. A., Gibbs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+future+Prospectives+in+Skin-on-Chip+Development+with+Emphasis+on+the+use+of+Different+Cell+Types+and+Technical+Challenges.">Progress and future Prospectives in Skin-on-Chip Development with Emphasis on the use of Different Cell Types and Technical Challenges.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 13 (3), 418-429 (2017).</li><li>Ata&#231;, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+on-a-chip:+In+vitro+skin+models+versus+ex+vivo+tissue+maintenance+with+dynamic+perfusion.">Skin and hair on-a-chip: In vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion.</a> Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).</li><li>Abaci, H. E., Gledhill, K., Guo, Z., Christiano, A. M., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pumpless+microfluidic+platform+for+drug+testing+on+human+skin+equivalents.">Pumpless microfluidic platform for drug testing on human skin equivalents.</a> Lab on a Chip. 15 (3), 882-888 (2015).</li><li>Wu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-thickness+human+skin-on-chip+with+enhanced+epidermal+morphogenesis+and+barrier+function.">Full-thickness human skin-on-chip with enhanced epidermal morphogenesis and barrier function.</a> Materials Today. 21 (4), 326-340 (2017).</li><li>Materne, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multi-organ+chip+-+a+microfluidic+platform+for+long-term+multi-tissue+coculture.">The multi-organ chip - a microfluidic platform for long-term multi-tissue coculture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52526 (2015).</li><li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+of+a+full-thickness+skin+equivalent+in+a+96-well+insert+format+for+substance+permeation+studies+and+organ-on-a-chip+applications.">Bioengineering of a full-thickness skin equivalent in a 96-well insert format for substance permeation studies and organ-on-a-chip applications.</a> Bioengineering. 5 (2), 43 (2018).</li><li>Alberti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-chamber+microfluidic+platform+for+high-precision+skin+permeation+testing.">Multi-chamber microfluidic platform for high-precision skin permeation testing.</a> Lab on a Chip. 17, 1625-1634 (2017).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature BIotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li><li>Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+3D+cell+culture+to+organs-on-chips.">From 3D cell culture to organs-on-chips.</a> Trends in Cell Biology. 21 (12), 745-754 (2011).</li><li>Wufuer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-on-a-chip+model+simulating+inflammation,+edema+and+drug-based+treatment.">Skin-on-a-chip model simulating inflammation, edema and drug-based treatment.</a> Scientific Reports. 6, 37471 (2016).</li><li>Ramadana, Q., Ting, F. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micro-physiological+immune-competent+model+of+the+human+skin.">In vitro micro-physiological immune-competent model of the human skin.</a> Lab on a Chip. 16, 1899-1908 (2016).</li><li>Kim, K., Jeon, H. M., Choi, K. C., Sung, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+effectiveness+of+Curcuma+longa+leaf+extract+on+a+skin+equivalent+using+a+pumpless+skin-on-a-chip+model.">Testing the effectiveness of Curcuma longa leaf extract on a skin equivalent using a pumpless skin-on-a-chip model.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3898 (2020).</li><li>Halldorsson, S., Lucumi, E., G&#243;mez-Sj&#246;berg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices.">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li><li>Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+disease+model+of+drug+toxicity+-+induced+pulmonary+edema+in+a+lung-on-a-chip+microdevice.">A human disease model of drug toxicity - induced pulmonary edema in a lung-on-a-chip microdevice.</a> Scientific Translational Medicine. 4 (159), (2012).</li><li>Beckwitt, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+'+organ+on+a+chip+'.">Liver ' organ on a chip '.</a> Experimental Cell Research. 363 (1), 15-25 (2018).</li><li>Poceviciute, R., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-gut-microbiome+on+a+chip.">Human-gut-microbiome on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 500-501 (2019).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).</li><li>Esc&#225;mez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+optimal+virus-mediated+growth+factor+gene+delivery+for+human+cutaneous+wound+healing+enhancement.">Assessment of optimal virus-mediated growth factor gene delivery for human cutaneous wound healing enhancement.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128 (6), 1565-1575 (2008).</li><li>Llames, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+plasma+as+a+dermal+scaffold+for+the+generation+of+a+completely+autologous+bioengineered+skin.">Human plasma as a dermal scaffold for the generation of a completely autologous bioengineered skin.</a> Transplantation. 77 (3), 350-355 (2004).</li><li>Llames, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+results+of+an+autologous+engineered+skin.">Clinical results of an autologous engineered skin.</a> Cell Tissue Bank. 7 (1), 47-53 (2006).</li><li>Cubo, N., Garcia, M., del Ca&#241;izo, J. F., Velasco, D., Jorcano, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+functional+human+skin:+production+and+in+vivo+analysis.">3D bioprinting of functional human skin: production and in vivo analysis.</a> Biofabrication. 9 (1), 015006 (2016).</li><li>Mori, N., Morimoto, Y., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+integrated+with+perfusable+vascular+channels+on+a+chip.">Skin integrated with perfusable vascular channels on a chip.</a> Biomaterials. 116, 48-56 (2017).</li><li>Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+microbiome+and+mechanical+deformation+to+intestinal+bacterial+overgrowth+and+inflammation+in+a+human+gut-on-a-chip.">Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 7-15 (2016).</li><li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidics-based+in+vitro+model+of+the+gastrointestinal+human-microbe+interface.">A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface.</a> Nature Communications. 7, 11535 (2016).</li><li>Marx, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-on-a-chip'+developments:+A+translational+cuttingedge+alternative+to+systemic+safety+assessment+and+efficiency+evaluation+of+substances+in+laboratory+animals+and+man.">Human-on-a-chip' developments: A translational cuttingedge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 40 (5), 235-257 (2012).</li><li>Bein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organ-on-a-chip+models+of+human+intestine.">Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).</li><li>Bennet, D., Estlack, Z., Reid, T., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microengineered+human+corneal+epithelium-on-a-chip+for+eye+drops+mass+transport+evaluation.">A microengineered human corneal epithelium-on-a-chip for eye drops mass transport evaluation.</a> Lab on a Chip. 18, 1539-1551 (2018).</li><li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow.">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab on a chip. 12, 2165-2174 (2012).</li><li>Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut-on-a-chip+microenvironment+induces+human+intestinal+cells+to+undergo+villus+differentiation.">Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation.</a> Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).</li><li>O'Neill, A. T., Monteiro-Riviere, N. A., Walker, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microfluidic+human+epidermal+keratinocyte+culture.">Characterization of microfluidic human epidermal keratinocyte culture.</a> Cytotechnology. 56 (3), 197-207 (2008).</li><li>Ren, K., Chen, Y., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+materials+for+microfluidics+in+biology.">New materials for microfluidics in biology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 25, 78-85 (2014).</li></ol>

De motivatie om deze methode te ontwikkelen was de wens om huidziekten te modelleren en de effecten van nieuwe en innovatieve therapieën te bestuderen in een high-throughput platform. Tot op heden produceert dit laboratorium deze dermo-epidermale equivalenten door handmatig of met behulp van de 3D-bioprinttechnologie de fibrinegel met fibroblasten in een celkweekinbrengplaat te gieten en de keratinocyten er bovenop te zaaien. Zodra de keratinocyten samenvloeiing bereiken, wordt de 3D-cultuur blootgesteld aan de lucht-vl...

Onlangs is vooruitgang geboekt in de richting van de ontwikkeling en productie van in vitro menselijke huidmodellen voor de analyse van de toxiciteit van cosmetische en farmaceutische producten1. Onderzoekers in de farmaceutische en huidverzorgingsindustrie hebben dieren gebruikt, muizen zijn de meest voorkomende, om hun producten te testen2,3,4,5. Het testen van producten op dieren is echter niet altijd voorspellend voor de respons bij mensen, wat vaak leidt tot falen van geneesmiddelen of nadelige effecten bij mensen en bijgevolg tot economische verliezen5,6. Het Verenigd Koninkrijk was in 1998 het eerste land dat het gebruik van dieren voor cosmetische tests verbood. Later, in 2013, verbood de EU het testen en toe-laten van cosmetica bij dieren (EU Cosmetics Regulation No. 1223/2009)7.
Dit verbod wordt ook door andere landen overwogen, zoals in 'The Humane Cosmetics Act' in de VS8. Naast ethische overwegingen maken de anatomische verschillen tussen dierlijke en menselijke huid dierproeven tijdrovend, duur en vaak ineffectief. Bovendien wordt verwacht dat de wereldwijde markt voor in vitro toxicologietests tegen 2025 USD 26,98 miljard zal bereiken9. Om deze redenen is het nodig om nieuwe methoden en alternatieven te ontwikkelen voor die in vitro studies, zoals bio-technische menselijke huidmodellen, die het testen op veiligheid en toxische effecten van cosmetica en geneesmiddelen mogelijk maken zonder het gebruik van dieren.
Er zijn twee verschillende soorten commercieel verkrijgbare, in vitro, menselijke huidmodellen. Het eerste type bestaat uit gestratificeerde epidermale equivalenten die meerdere lagen differentiërende keratinocyten bevatten die op verschillende materialen zijn gezaaid. Sommigen van hen zijn goedgekeurd door de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling (OESO) en gevalideerd door het (European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) voor huidcorrosie- en irritatietests, zoals EpiDerm of SkinEthic10,11,12. Het tweede type zijn volledige huidequivalenten met een laag differentiërende menselijke keratinocyten gezaaid op een driedimensionale (3D) steiger die fibroblasten bevat, zoals T-Skin en EpiDerm-FT. Deze modellen worden echter gekweekt onder statische omstandigheden, waardoor ze niet in staat zijn om de menselijke fysiologische omstandigheden nauwkeurig weer te geven.
Recente interesse heeft zich gericht op het genereren van in vitro 3D-huidmodellen in celkweek-insert (CCI) formaten met dynamische perfusie13,14,15,16,17,18,19. Deze systemen kunnen echter niet worden beschouwd als stricto sensu als microfluïdische skin-on-chips volgens hun klassieke definitie in het veld. Ingber's definitie voor organen-op-een-chip stelt dat het orgaan in de microfluïdische kanalen moet worden geplaatst, wat een voorwaarde is dat slechts enkele apparaten voldoen aan20,21. Skin-on-chips hebben tot nu toe meestal eenvoudige epithelia gemodelleerd als eencellige lagen en / of dermale cellagen gescheiden door een poreusmembraan 22,23. Hoewel er enige vooruitgang is geboekt bij het modelleren van huid in microfluïdische systemen16,24, is er momenteel geen literatuur die een orgaan-op-een-chip-systeem laat zien dat voldoet aan de definitie van Ingber, in staat om een meerlagige huid in situ te produceren en zowel epitheliale als stromale componenten te bevatten.
In dit werk wordt een nieuw, kosteneffectief, robuust, op vinyl gebaseerd microfluïdisch platform voor skin-on-a-chip-toepassingen gepresenteerd. Dit platform werd geproduceerd door microbewerking, wat meer eenvoud in het fabricageproces biedt, evenals meer flexibiliteit en veelzijdigheid in de lay-out van het apparaat, waardoor enkele van de beperkingen van PDMS25worden overwonnen . Er werd ook een manier ontworpen om een vereenvoudigde huidconstructie te introduceren door middel van een parallelle stroom die wordt geregeld met spuitpompen. Parallelle stroming maakt het mogelijk om twee vloeistoffen met zeer verschillende viscositeiten (een buffer en fibrine pre-gel in dit geval) door een kanaal te laten doordringen zonder met elkaar te mengen. Als proof of concept werd een dermo-epidermaal construct met fibroblasten ingebed in een fibrinematrix die de dermis nabootst in het apparaat geïntroduceerd, waarop een monolaag van keratinocyten werd geladen om de ongedifferentieerde epidermis na te bootsen. De hoogte van het dermale compartiment kan worden gemoduleerd door de stroomsnelheden aan te passen. De belangrijkste nieuwigheid van dit werk, vergeleken met eerder beschreven modellen22,26,27,28,29,is de ontwikkeling van een 3D-constructie in een microkamer door middel van microfluïdica. Hoewel dit artikel een vereenvoudigde ongedifferentieerde huid presenteert, is het langetermijndoel om een volledig gedifferentieerd huidconstruct te genereren en te karakteriseren om de levensvatbaarheid en functionaliteit ervan voor medicijn- en cosmetische testdoeleinden aan te tonen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amchafibrin</td>
			<td>Rottafarm</td>
			<td></td>
			<td>Tranexamic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic</td>
			<td>Thermo Scientific HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape vynil</td>
			<td>ATP Adhesive Systems</td>
			<td></td>
			<td>GM 107CC, 12 &#181;m thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edge plotter</td>
			<td>Brother</td>
			<td></td>
			<td>Scanncut CM900</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Scientific HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Extracted from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-Human dermal fibroblasts</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Primary. Gift from Dr. Marta Garc&#237;a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2B-GFP-HaCaT cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta Garc&#237;a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/dead kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Merk TM</td>
			<td></td>
			<td>5 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>Sylgard 184</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>10 NIH/vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent adhesive vinyl</td>
			<td>Mactac</td>
			<td></td>
			<td>JT 8500 CG-RT, 95 &#181;m thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td></td>
			<td>Teflon, 1/16&#8221; OD, 0.020&#8221; ID</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a simplified three-dimensional skin-on-a-chip model in a micromachined microfluidic platform

Dit werk presenteert een nieuw, kosteneffectief en betrouwbaar microfluïdisch platform met het potentieel om complexe meerlagige weefsels te genereren. Als proof of concept is een vereenvoudigde en ongedifferentieerde menselijke huid gemodelleerd met een dermale (stromale) en een epidermale (epitheliale) compartiment. Om dit te bereiken, is een veelzijdig en robuust, op vinyl gebaseerd apparaat ontwikkeld, verdeeld in twee kamers, waarbij enkele van de nadelen van microfluïdische apparaten op basis van polydimethylsiloxaan (PDMS) voor biomedische toepassingen, zoals het gebruik van dure en gespecialiseerde apparatuur of de absorptie van kleine, hydrofobe moleculen en eiwitten, worden overwonnen. Bovendien werd een nieuwe methode ontwikkeld op basis van parallelle stroming, die de in situ depositie van zowel de huid- als epidermale compartimenten mogelijk maakt. Het huidconstruct bestaat uit een fibrinematrix met menselijke primaire fibroblasten en een monolaag van onsterfelijke keratinocyten die bovenop zijn gezaaid, die vervolgens wordt onderhouden onder dynamische kweekomstandigheden. Dit nieuwe microfluïdische platform opent de mogelijkheid om menselijke huidziekten te modelleren en de methode te extrapoleren om andere complexe weefsels te genereren.

De ontworpen chip bestaat uit twee vloeibare kamers gescheiden door een 5 μm poriegrootte PC-membraan dat de groei van de cel mogelijk maakt door de doorgang van groeibevorderende moleculen uit de onderste kamer mogelijk te maken. De bovenste kamer bevat het weefselconstruct, in dit geval een monolaag van hKCs op een fibrinehydrogel die hFBs bevat.
De hoogte van de kanalen wordt bepaald door het aantal lijmplaten dat aan elk kanaal wordt toegevoegd. De onderste kamer bestaat uit 4 lagen (380 ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform at JoVE.com

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

Hier presenteren we een protocol om een driedimensionaal vereenvoudigd en ongedifferentieerd huidmodel te genereren met behulp van een microgemachineerd microfluïdisch platform. Een parallelle stromingsbenadering maakt de in situ afzetting van een dermale compartiment mogelijk voor het zaaien van epitheelcellen bovenop, allemaal geregeld door spuitpompen.

Generatie van een vereenvoudigd driedimensionaal huid-op-een-chip-model in een microgemachineerd microfluïdisch platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Dit is een nieuw, lithografievrij protocol voor het modelleren van een 3D-skin-on-chip met behulp van microgemachineerde, zelfklevende vinyllagen en een parallelstroommethodologie voor het genereren van dermale compartimenten. Micromachined vinyl biedt meer eenvoud in het fabricageproces en veelzijdigheid in de lay-out van het apparaat, waarbij enkele van de beperkingen van PDMS en traditionele lithografiebenaderingen worden overwonnen. Deze meerlagige skin-on-a-chip kan worden gebruikt voor medicijn- en cosmetische testbenaderingen, omdat het screening met hoge doorvoer tegen lagere kosten mogelijk maakt en kan worden gebruikt om verschillende ziekten te modelleren.Begin met het ontwerpen van een microfluïdische chip met behulp van Brother Canvas Workspace-software. Maak een werkruimte van 30 bij 30 centimeter en vul deze met de ontwerppatronen voor de verschillende lagen van de chip voordat u deze opslaat in een svg-bestand. Snijd de vinylplaten van 30 bij 30 centimeter.Plak het op een kleefmat met een lage kleefkracht en verwijder indien nodig alle luchtbellen. Upload met behulp van een USB-station het svg-bestand naar de randplotter en stel de snijparameters in als snijdruk op niveau nul, snijmes op niveau drie en niveau één voor de snijsnelheid. Wanneer de parameters zijn ingesteld, plaatst u de lijmmat met het vinyl in de plotter en begint u met het snijden van de kanaalpatronen op 95 micrometer dik vinyl.Monteer het hele apparaat met behulp van een aligner voor de juiste afstelkanalen, inlaten en uitgangen. Stapel op voor vinyllagen met een bijbehorend micromachineontwerp voor het monteren van het onderste kanaal, waarbij de afdektape van de onderste laag behouden blijft om te voorkomen dat deze aan de aligner blijft plakken. Snijd en plaats het polycarbonaat poreuze membraan bovenop het onderste kanaal zonder de inlaten te bedekken.Voeg 10 vinyllagen toe met het ontwerp van de bovenste kamer en plak er een dubbelzijdige tape-laatste laag op. Verwijder de chip uit de aligner om deze op de glasplaat te plakken. Leg een twee millimeter dik PDMS-vel bovenop de dubbelzijdige tape vinyllaag.Om ervoor te zorgen dat de chip volledig waterdicht is, laat u een gewicht een nacht op de chip liggen. Steriliseer de chip de volgende dag door deze vijf minuten te spoelen met 70% ethanol, gevolgd door een wasbeurt met gedestilleerd water. Sluit pomp één en pomp twee aan op respectievelijk de inlaat van de bovenste kamer en de inlaat van de bovenste kamer twee.Sluit pomp drie aan op de inlaat van de onderste kamer en sluit vervolgens de uitlaatopeningen van de bovenste kamer en de onderste kamer aan op een afvalkuip. Sluit de spuiten aan op elke inlaat met behulp van PTFE-buizen en roestvrijstalen connectoren van 18 gauge. Pomp PBS met pomp drie door de inlaat van de onderste kamer met 50 microliter per minuut en met pomp twee door de inlaat van de bovenste kamer twee met 100 microliter per minuut.Laad vervolgens de spuit met de fibrinogeen pre-gel, plaats deze onmiddellijk in pomp één en laat hem met 200 microliter per minuut draaien. Zodra de pre-gel de uitlaat van de bovenste kamer verlaat, stopt u de pomp één en twee en laat u vervolgens, zonder de slang te verwijderen, de chip gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius in stand. Na gelatie blokkeert u de inlaat van de bovenste kamer met een dop en pompt u het kweekmedium door de inlaat van de bovenste kamer twee met pomp drie met 50 microliter per uur gedurende de nacht.Controleer 24 uur na het genereren van het dermale compartiment of menselijke primaire fibroblastcellen in de assemblage zijn verspreid en introduceer vervolgens vijf keer 10 tot de 6 HKCs per milliliter door de bovenste kanaalinlaat twee met 40 microliter per minuut gedurende één minuut. Voor celbevestiging plaatst u de chip 's nachts op 37 graden Celsius in een met vochtigheid verzadigde incubator. Begin met het pompen van vers kweekmedium met pomp drie alleen door de inlaat van de onderste kamer met 50 microliter per minuut.In de representatieve analyse wordt de hoogte van de hydrogel langs de bovenste kamer van de assemblage weergegeven. Een gemiddelde hoogte van 550 micrometer was optimaal voor de werking van de gel bij de stroomsnelheden van respectievelijk 100 en 200 microliter per minuut voor de opofferende PBS en de pre-gel. Het niet doorspoelen van PBS door het onderste kanaal leidde tot discrepanties tussen de theoretische hoogte van de gel en de gemeten, met een verschil van 40%Na 24 uur na de start van het parallelstroomprotocol bleken de menselijke primaire fibroblasten met succes te worden verspreid in de fibrinegel in de bovenste kamer van de assemblage, waarna groene fluorescerende eiwit-tot expressie brengende HKCs effectief bovenop de hydrogel kunnen worden gezaaid.Verwijdering van buizen zonder het systeem 's nachts gesloten te houden om de HKCS in staat te stellen te sedimenteren, resulteerde in een niet-uniforme, confluente monolaag van cellen. 3D confocale analyse van het ongedifferentieerde huidmodel in de microfluïdische chip toonde duidelijk het oppervlak van de hydrogel die HKCs aan de bovenkant scheidt van de fibroblast die aan de onderkant is ingebed. De gegenereerde huid kan worden blootgesteld aan de lucht / vloeistof-interface om een rijpe en gedifferentieerde epidermis te verkrijgen en verder worden gekarakteriseerd met behulp van verschillende dermale en epidermale markers.Deze techniek zorgt voor een snellere en goedkopere fabricage van apparaten en het genereren van meerlagige huid met behulp van microfluïdica, wat een meer realistische benadering biedt voor het testen van geneesmiddelen en cosmetica.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Drie-dimensionale Optische resolutie Fotoakoestisch Microscopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Vlakke en Three-Dimensional Printing van geleidende inkten

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput eiwit expressie Generator Met behulp van een Microfluïdische Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Cel Knijpen als een robuuste, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

Onderzoek naar de driedimensionale stroomscheiding geïnduceerd door een model vocal fold poliep

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Genereren van een drie-dimensionale volledige dikte huidequivalent en Automated Verwonden

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabricage van Inverted Colloïdaal Crystal Poly (ethyleen glycol) Steiger: Een drie-dimensionale Cultuur van de Cel Platform for Liver Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Fabricage van Driedimensionale Paper-based microfluïdische apparaten voor een immunoassay

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluïdische Platform met multiplexverzending elektronische detectie voor ruimtelijke Tracking van Deeltjes

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

Een Microfluidic Platform voor het longitudinale beeldvorming in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...