Name: generation of a simplified three-dimensional skin-on-a-chip model in a micromachined microfluidic platform
Uploaded: 2021-05-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform at JoVE.com

Nous remercions sincèrement le Dr Javier Rodríguez, le Dr María Luisa López, Carlos Matellán et Juan Francisco Rodríguez pour leurs suggestions, discussions et/ou données préliminaires très utiles. Nous remercions également les contributions de Sergio Férnandez, Pedro Herreros et Lara Stolzenburg à ce projet. Nous remercions tout particulièrement la Dre Marta García pour les hFB et les hKC étiquetés GFP. Enfin, nous reconnaissons l’excellente assistance technique de Guillermo Vizcaíno et Angélica Corral. Ce travail a été soutenu par le « Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid », Projet S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Ce travail a également été soutenu par le « Programa de excelencia », Projet EPUC3M03, CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.

1. Paramètres de conception de la puce et de micro-usinage
<ol><li>Concevoir les couches de puces microfluidiques avec le logiciel de conception open source FreeCAD; reportez-vous au tableau 1 pour connaître les dimensions des canaux. Inclure quatre trous de 2,54 mm de diamètre dans la conception pour utiliser un aligneur sur mesure pour une superposition de couche correcte.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			...

<ol>
	<li>McNamee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tiered+approach+to+the+use+of+alternatives+to+animal+testing+for+the+safety+assessment+of+cosmetics:+Eye+irritation.">A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 54 (2), 197-209 (2009).</li><li>Mathes, S. 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La motivation pour développer cette méthode était le désir de modéliser les maladies de la peau et d’étudier les effets de thérapies nouvelles et innovantes dans une plate-forme à haut débit. À ce jour, ce laboratoire produit ces équivalents dermo-épidermiques en coulant - manuellement ou à l’aide de la technologie de bio-impression 3D - le gel de fibrine avec des fibroblastes dans une plaque d’insertion de culture cellulaire et en ensemençant les kératinocytes dessus. Une fois que les kératinocytes...

Récemment, des progrès ont été réalisés dans le développement et la production de modèles de peau humaine in vitro pour l’analyse de la toxicité des produits cosmétiques et pharmaceutiques1. Les chercheurs des industries pharmaceutiques et des soins de la peau ont utilisé des animaux, les souris étant les plus courantes, pour tester leurs produits2,3,4,5. Cependant, tester des produits sur des animaux n’est pas toujours prédictif de la réponse chez l’homme, ce qui conduit fréquemment à une défaillance du médicament ou à des effets indésirables chez l’homme et, parconséquent,à des pertes économiques5,6. Le Royaume-Uni a été le premier pays à interdire l’utilisation d’animaux pour les tests cosmétiques en 1998. Plus tard, en 2013, l’UE a interdit les tests et l’approbation des cosmétiques chez les animaux (Règlement cosmétique de l’UE n° 1223/2009)7.
Cette interdiction est également envisagée par d’autres pays, comme dans le « Humane Cosmetics Act » aux États-Unis8. En plus des préoccupations éthiques, les différences anatomiques entre la peau animale et humaine rendent les tests sur les animaux longs, coûteux et souvent inefficaces. En outre, la taille du marché mondial des tests toxicologiques in vitro devrait atteindre 26,98 milliards USD d’ici 20259. Pour ces raisons, il est nécessaire de développer de nouvelles méthodes et alternatives pour ces études in vitro, telles que les modèles de peau humaine issus de la bioingénierie, qui permettent de tester la sécurité et les effets toxiques des cosmétiques et des médicaments sans l’utilisation d’animaux.
Il existe deux types différents de modèles de peau humaine disponibles dans le commerce, in vitro. Le premier type consiste en des équivalents épidermiques stratifiés contenant plusieurs couches de kératinocytes différenciants qui sont ensemencés sur différents matériaux. Certains d’entre eux ont été approuvés par l’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) et validés par le Centre européen pour la validation des méthodes alternatives (ECVAM) pour les essais de corrosion et d’irritation de la peau, tels que EpiDerm ou SkinEthic10,11,12. Le deuxième type sont des équivalents à peau entière avec une couche de kératinocytes humains différenciants ensemencés sur un échafaudage tridimensionnel (3D) contenant des fibroblastes, tels que T-Skin et EpiDerm-FT. Cependant, ces modèles sont cultivés dans des conditions statiques, ce qui les rend incapables de représenter avec précision les conditions physiologiques humaines.
L’intérêt récent s’est concentré sur la génération de modèles de peau 3D in vitro dans des formats d’insertion de culture cellulaire (CCI) avec perfusion dynamique13,14,15,16,17,18,19. Cependant, ces systèmes ne peuvent pas être considérés comme stricto sensu comme des skin-on-chips microfluidiques selon leur définition classique dans le domaine. La définition d’Ingber pour les organes sur puce stipule que l’organe doit être placé à l’intérieur des canaux microfluidiques, ce qui est une condition que seuls quelques dispositifs remplissent20,21. Jusqu’à présent, les peaux sur puce ont modélisé principalement des épithéliums simples sous forme de couches unicellulaires et/ou de couches cellulaires dermiques séparées par une membrane poreuse22,23. Bien qu’il y ait eu quelques avancées dans la modélisation de la peau dans les systèmes microfluidiques16,24, il n’existe actuellement aucune littérature montrant un système d’organe sur puce qui correspond à la définition d’Ingber, capable de produire une peau multicouche in situ et comprenant à la fois des composants épithéliaux et stromaux.
Dans ce travail, une nouvelle plate-forme microfluidique à base de vinyle, rentable et robuste pour les applications de peau sur puce est présentée. Cette plate-forme a été produite par micro-usinage, ce qui offre plus de simplicité dans le processus de fabrication, ainsi qu’une flexibilité et une polyvalence accrues dans la disposition de l’appareil, surmontant certaines des limitations de PDMS25. Un moyen d’introduire une construction de peau simplifiée grâce à un débit parallèle contrôlé par des pompes à seringues a également été conçu. L’écoulement parallèle permet à deux fluides de viscosités très différentes (un tampon et un pré-gel de fibrine dans ce cas) d’être perfusés à travers un canal sans se mélanger l’un à l’autre. Comme preuve de concept, une construction dermo-épidermique contenant des fibroblastes incorporés dans une matrice de fibrine imitant le derme a été introduite dans le dispositif, au-dessus de laquelle une monocouche de kératinocytes a été chargée pour émuler l’épiderme indifférencié. La hauteur du compartiment dermique peut être modulée en modifiant les débits. La principale nouveauté de ce travail, par rapport aux modèles précédemment décrits22,26,27,28,29, est le développement d’une construction 3D à l’intérieur d’une microchambre au moyen de la microfluidique. Bien que cet article présente une peau simplifiée indifférenciée, l’objectif à long terme est de générer et de caractériser une construction cutanée entièrement différenciée pour démontrer sa viabilité et sa fonctionnalité à des fins de tests médicamenteux et cosmétiques.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amchafibrin</td>
			<td>Rottafarm</td>
			<td></td>
			<td>Tranexamic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic</td>
			<td>Thermo Scientific HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape vynil</td>
			<td>ATP Adhesive Systems</td>
			<td></td>
			<td>GM 107CC, 12 &#181;m thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edge plotter</td>
			<td>Brother</td>
			<td></td>
			<td>Scanncut CM900</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Scientific HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Extracted from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-Human dermal fibroblasts</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Primary. Gift from Dr. Marta Garc&#237;a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2B-GFP-HaCaT cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta Garc&#237;a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/dead kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Merk TM</td>
			<td></td>
			<td>5 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>Sylgard 184</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>10 NIH/vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent adhesive vinyl</td>
			<td>Mactac</td>
			<td></td>
			<td>JT 8500 CG-RT, 95 &#181;m thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td></td>
			<td>Teflon, 1/16&#8221; OD, 0.020&#8221; ID</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a simplified three-dimensional skin-on-a-chip model in a micromachined microfluidic platform

Ce travail présente une nouvelle plate-forme microfluidique rentable et fiable avec le potentiel de générer des tissus multicouches complexes. Comme preuve de concept, une peau humaine simplifiée et indifférenciée contenant un compartiment dermique (stromale) et un compartiment épidermique (épithélial) a été modélisée. Pour ce faire, un dispositif polyvalent et robuste à base de vinyle divisé en deux chambres a été développé, surmontant certains des inconvénients présents dans les dispositifs microfluidiques à base de polydiméthylsiloxane (PDMS) pour des applications biomédicales, tels que l’utilisation d’équipements coûteux et spécialisés ou l’absorption de petites molécules et protéines hydrophobes. De plus, une nouvelle méthode basée sur l’écoulement parallèle a été développée, permettant le dépôt in situ des compartiments dermique et épidermique. La construction de la peau se compose d’une matrice de fibrine contenant des fibroblastes primaires humains et d’une monocouche de kératinocytes immortalisés ensemencés sur le dessus, qui est ensuite maintenue dans des conditions de culture dynamique. Cette nouvelle plateforme microfluidique ouvre la possibilité de modéliser les maladies de la peau humaine et d’extrapoler la méthode pour générer d’autres tissus complexes.

La puce conçue est composée de deux chambres fluidiques séparées par une membrane PC de 5 μm de taille de pore qui permet la croissance de la cellule en permettant le passage de molécules favorisant la croissance de la chambre inférieure. La chambre supérieure contient la construction tissulaire, dans ce cas, une monocouche de hBC sur un hydrogel de fibrine contenant des hFB.
La hauteur des canaux est déterminée par le nombre de feuilles adhésives ajoutées à chaque canal. La chamb...

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Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

Ici, nous présentons un protocole pour générer un modèle de peau tridimensionnel simplifié et indifférencié à l’aide d’une plate-forme microfluidique micro-usinée. Une approche à flux parallèle permet le dépôt in situ d’un compartiment dermique pour l’ensemencement de cellules épithéliales sur le dessus, le tout contrôlé par des pompes à seringues.

Génération d’un modèle tridimensionnel simplifié de peau sur puce dans une plate-forme microfluidique micro-usinée

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Il s’agit d’un nouveau protocole sans lithographie pour la modélisation d’une peau sur puce 3D à l’aide de couches de vinyle adhésives micro-usinées et d’une méthodologie à flux parallèle pour la génération de compartiments dermiques. Le vinyle micro-usiné offre plus de simplicité dans le processus de fabrication et de polyvalence dans la disposition de l’appareil, surmontant certaines des limites du PDMS et des approches lithographiques traditionnelles. Cette peau sur puce multicouche peut être utilisée pour des approches de test de médicaments et de cosmétiques, car elle permet un dépistage à haut débit à moindre coût et pourrait être utilisée pour modéliser plusieurs maladies.Commencez par concevoir une puce microfluidique à l’aide du logiciel Brother Canvas Workspace. Créez un espace de travail de 30 par 30 centimètres et remplissez-le avec les motifs de conception des différentes couches de la puce avant de le stocker dans un fichier svg. Découpez les feuilles de vinyle de 30 par 30 centimètres.Collez-le sur un tapis adhésif à faible adhérence et éliminez toutes les bulles d’air, si nécessaire. À l’aide d’une clé USB, téléchargez le fichier svg sur le traceur de bord et définissez les paramètres de coupe comme la pression de coupe au niveau zéro, la lame de coupe au niveau trois et le niveau un pour la vitesse de coupe. Lorsque les paramètres sont définis, placez le tapis adhésif avec le vinyle dans le traceur et commencez le processus de découpe des motifs de canaux sur du vinyle de 95 micromètres d’épaisseur.Assemblez l’ensemble de l’appareil à l’aide d’un aligneur pour obtenir des canaux de réglage, des entrées et des sorties appropriés. Empilez pour les couches de vinyle avec une conception de micromachine correspondante pour assembler le canal inférieur, en gardant le ruban de couverture de la couche inférieure pour éviter de coller à l’aligneur. Coupez et placez la membrane poreuse en polycarbonate sur le dessus du canal inférieur sans recouvrir les entrées.Ajoutez 10 couches de vinyle avec la conception de la chambre supérieure et collez une couche finale de ruban adhésif double face sur le dessus. Retirez la puce de l’aligneur pour la coller sur la glissière en verre. Placez une feuille PDMS de deux millimètres d’épaisseur sur la couche de vinyle de ruban adhésif double face.Pour vous assurer que la puce est complètement étanche, laissez un poids sur le dessus de la puce pendant la nuit. Le lendemain, stérilisez la puce en la rinçant avec de l’éthanol à 70% pendant cinq minutes, suivie d’un lavage à l’eau distillée. Connectez la pompe un et la pompe deux à l’entrée de la chambre supérieure un et à l’entrée de la chambre supérieure deux, respectivement.Connectez la pompe trois à l’entrée de la chambre inférieure, puis connectez les sorties de la chambre supérieure et de la chambre inférieure à une cuve à déchets. Connectez les seringues à chaque entrée à l’aide de tubes en PTFE et de connecteurs en acier inoxydable de calibre 18. Pompe PBS avec pompe trois à travers l’entrée de la chambre inférieure à 50 microlitres par minute, et avec la pompe deux à travers l’entrée de la chambre supérieure deux à 100 microlitres par minute.Ensuite, chargez la seringue avec le pré-gel de fibrinogène, placez-la immédiatement dans la première pompe et faites-la fonctionner à 200 microlitres par minute. Une fois que le pré-gel sort de la sortie de la chambre supérieure, arrêtez les pompes une et deux, puis, sans retirer le tuyau, laissez la puce pour permettre la gélification à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après la gélification, bloquez l’entrée de la chambre supérieure avec un bouchon et pompez le milieu de culture à travers l’entrée de la chambre supérieure deux avec la pompe trois à 50 microlitres par heure pendant la nuit.24 heures après la génération du compartiment dermique, vérifiez que les cellules fibroblastiques primaires humaines sont réparties dans l’assemblage, puis introduisez cinq fois 10 aux 6 HKC par millilitre par l’entrée du canal supérieur deux à 40 microlitres par minute pendant une minute. Pour la fixation des cellules, placez la puce pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur saturé d’humidité. Commencez à pomper le milieu de culture frais avec la pompe trois uniquement par l’entrée de la chambre inférieure à 50 microlitres par minute.Dans l’analyse représentative, la hauteur de l’hydrogel le long de la chambre supérieure de l’assemblage est affichée. Une hauteur moyenne de 550 micromètres était optimale pour le fonctionnement du gel à des débits de 100 et 200 microlitres par minute pour le PBS sacrificiel et le pré-gel, respectivement. L’échec du rinçage du PBS par le canal inférieur a entraîné des écarts entre la hauteur théorique du gel et celle mesurée, avec une différence de 40%Après 24 heures à compter du début du protocole à flux parallèle, les fibroblastes primaires humains se sont répandus avec succès dans le gel de fibrine dans la chambre supérieure de l’assemblage, après quoi, les HKC exprimant les protéines fluorescentes vertes pourraient être efficacement ensemencés sur l’hydrogel.L’enlèvement des tubes sans garder le système fermé pendant la nuit pour permettre au HKCS de sédimenter a entraîné une monocouche de cellules non uniforme et confluente. L’analyse confocale 3D du modèle de peau indifférencié dans la puce microfluidique a clairement montré la surface de l’hydrogel séparant les HKC en haut du fibroblaste incorporé en bas. La peau générée pourrait être exposée à l’interface air/liquide pour obtenir un épiderme mature et différencié, et être caractérisée à l’aide de plusieurs marqueurs dermiques et épidermiques.Cette technique permet une fabrication de dispositif plus rapide et moins chère, et la génération de peau multicouche à l’aide de la microfluidique, offrant une approche plus réaliste pour les tests de médicaments et de cosmétiques.

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