Name: generation of a simplified three-dimensional skin-on-a-chip model in a micromachined microfluidic platform
Uploaded: 2021-05-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform at JoVE.com

ハビエル・ロドリゲス博士、マリア・ルイサ・ロペス博士、カルロス・マテラン、フアン・フランシスコ・ロドリゲスの皆様に、ご意見、ご意見、ご意見、予備データをお願い申し上げます。また、セルヒオ・フェルランデス、ペドロ・エレーロス、ララ・ストルツェンブルクの貢献に感謝します。GFPラベル付きhFPとhKUについては、マルタ・ガルシア博士に感謝します。最後に、ギレルモ・ヴィズカイノとアンジェリカ・コラルの優れた技術支援を認めています。この作品は「プログラム・デ・アクティビダーデス・デ・I+Dアントル・グルポス・デ・インベスティガシオン・デ・ラ・コムニダード・デ・マドリード」、プロジェクトS2018/BAA-4480、バイオピエルテック-CMによって支えられた。この研究は、"プログラム・デ・エクセレンシア"、プロジェクトEPUC3M03、CAMによってもサポートされました。コンセヘリア・デ・エドゥカシオン・エ・インベスティガシオン

1. チップ設計とマイクロマシニングパラメータ
<ol><li>FreeCADオープンソース設計ソフトウェアを使用してマイクロ流体チップ層を設計します。チャネルの寸法については 、表 1 を参照してください。設計に直径2.54mmの穴を4つ含めて、正しいレイヤーの重ね合わせにカスタムメイドのアライナを使用します。</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="alw...

<ol>
	<li>McNamee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tiered+approach+to+the+use+of+alternatives+to+animal+testing+for+the+safety+assessment+of+cosmetics:+Eye+irritation.">A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 54 (2), 197-209 (2009).</li><li>Mathes, S. 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J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow.">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab on a chip. 12, 2165-2174 (2012).</li><li>Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut-on-a-chip+microenvironment+induces+human+intestinal+cells+to+undergo+villus+differentiation.">Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation.</a> Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).</li><li>O'Neill, A. T., Monteiro-Riviere, N. A., Walker, G. 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この方法を開発する動機は、皮膚疾患をモデル化し、ハイスループットプラットフォームで新しい革新的な治療法の効果を研究したいという願望でした。現在までに、この研究室は、手動で、または3Dバイオプリンティング技術の助けを借りて、繊維芽細胞を含むフィブリンゲルを細胞培養インサートプレートに播種し、その上に角化細胞を播種することによって、これらの皮膚表皮等価物?...

近年、化粧品および医薬品1の毒性分析のためのヒト皮膚モデルの開発・生産に向けた進歩が見られている。医薬品およびスキンケア産業の研究者は、動物を使用してきました, マウスは最も一般的です, 自社製品をテストするために2,3,4,5.しかし、動物の試験製品は、ヒトにおける反応を予測するとは限らず、しばしばヒトにおける薬物不全または副作用を引き起こし、その結果経済的損失5,6に至る。英国は、1998年に化粧品検査のための動物の使用を禁止した最初の国でした。その後、2013年に、EUは動物の化粧品の試験と承認を禁止しました (EU化粧品規則第1223/2009)7.
この禁止は、米国の「人道的化粧品法」など他の国々でも検討されています。倫理的な懸念に加えて、動物と人間の皮膚の解剖学的な違いは、動物のテストに時間がかかり、高価で、しばしば効果がありません。さらに、世界 のインビトロ 毒物学の検査市場規模は、20259年までに269億8000万米ドルに達すると予想されています。これらの理由から、動物を使用せずに化粧品や薬物の安全性と毒性効果のテストを可能にする、バイオエンジニアリングされたヒト皮膚モデルなどの インビトロ 研究のための新しい方法と代替案を開発する必要があります。
市販の2種類、インビトロ、ヒトの皮膚モデルがあります。第1のタイプは、異なる材料に播種された分化角化細胞の複数の層を含む層状表皮等価物で構成される。そのうちのいくつかは経済協力開発機構(OECD)によって承認され、エピダームやSkinEthic10、11、12などの皮膚腐食および刺激試験のための(欧州代替方法検証センター(ECVAM)によって検証されています。第2のタイプは、T-SkinやEpiDerm-FTなどの線維芽細胞を含む3次元(3D)足場に播種されたヒトケラチノサイトの層を持つフルスキン同等物である。しかし、これらのモデルは静的な条件下で培養されるため、ヒトの生理学的状態を正確に表すことができません。
最近の関心は、動的灌流13、14、15、16、17、18、19の細胞培養挿入(CCI)フォーマットでin vitro 3Dスキンモデルを生成することに焦点を当てています。しかし、これらのシステムは、現場での古典的な定義に従って、マイクロ流体スキンオンチップとして厳密な感覚とは考えられません。Ingberの臓器オンチップの定義は、器官がマイクロ流体チャネルの中に配置されなければならないと述べています。スキンオンチップは、これまでのところ、多孔質膜22、23によって分離された単一細胞層および/または真皮細胞層として、ほとんどが単純な上皮をモデル化してきた。マイクロ流体系16,24では皮膚をモデル化する進歩がいくつかあったが、現在のところ、Ingberの定義に合った臓器オンチップシステムを示す文献はなく、その場で多層皮膚を産生することができ、上皮成分と間質成分の両方を含む。
この研究では、スキンオンチップアプリケーション用の新しい、費用対効果の高い、堅牢な、ビニールベースのマイクロ流体プラットフォームが発表されています。このプラットフォームは、PDMS25の制限の一部を克服し、デバイスのレイアウトにおける柔軟性と汎用性の向上と同様に、製造プロセスにおいてよりシンプルさを提供するマイクロ加工によって製造された。シリンジポンプで制御された平行流を通して簡単な皮膚構造を導入する方法も設計されました。平行流は非常に異なった粘着性を持つ2つの液体(この場合は緩衝液およびフィブリンプレゲル)が互いに混合されることなくチャネルを通して浸透することを可能にする。概念実証として、真皮を模したフィブリンマトリックスに埋め込まれた線維芽細胞を含む真皮構造をデバイスに導入し、その上にケラチノサイトの単層をロードして未分化表皮をエミュレートした。真皮コンパートメントの高さは流量を変更することによって変調することができる。この研究の主な目新しさは、前に説明したモデル22、26、27、28、29と比較して、マイクロ流体によるマイクロチャンバー内の3D構造の開発である。この記事では、未分化肌を単純化したものの、長期目標は、完全に差別化された皮膚構造を生成し、特徴付け、薬物および化粧品検査目的の生存率と機能性を実証することです。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amchafibrin</td>
			<td>Rottafarm</td>
			<td></td>
			<td>Tranexamic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic</td>
			<td>Thermo Scientific HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape vynil</td>
			<td>ATP Adhesive Systems</td>
			<td></td>
			<td>GM 107CC, 12 &#181;m thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edge plotter</td>
			<td>Brother</td>
			<td></td>
			<td>Scanncut CM900</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Scientific HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Extracted from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-Human dermal fibroblasts</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Primary. Gift from Dr. Marta Garc&#237;a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2B-GFP-HaCaT cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta Garc&#237;a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/dead kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Merk TM</td>
			<td></td>
			<td>5 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>Sylgard 184</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>10 NIH/vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent adhesive vinyl</td>
			<td>Mactac</td>
			<td></td>
			<td>JT 8500 CG-RT, 95 &#181;m thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td></td>
			<td>Teflon, 1/16&#8221; OD, 0.020&#8221; ID</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a simplified three-dimensional skin-on-a-chip model in a micromachined microfluidic platform

この研究は、複雑な多層組織を生成する可能性を持つ新しい、費用対効果の高い、信頼性の高いマイクロ流体プラットフォームを提示します。概念実証として、真皮(間質)および表皮(上皮)コンパートメントを含む、簡素で未分化のヒト皮膚がモデル化されている。これを達成するために、2つのチャンバーに分かれた汎用性と堅牢なビニール系デバイスが開発され、高価で特殊な機器の使用や、小型の疎水性分子およびタンパク質の吸収など、生物医学の用途に適したポリジメチルシロキサン(PDMS)に基づくマイクロ流体デバイスに存在する欠点の一部を克服しました。さらに、平行流に基づく新しい方法が開発され、真皮および表皮コンパートメントの両方の イン・ザ・ポジション 堆積が可能となる。皮膚構築物は、ヒト原発性線維芽細胞を含むフィブリンマトリックスと、上に播種された不死化角化ケラチノサイトの単層から構成され、その後、動的培養条件下で維持される。この新しいマイクロ流体プラットフォームは、ヒトの皮膚疾患をモデル化し、他の複雑な組織を生成する方法を推定する可能性を開きます。

設計されたチップは、下のチャンバからの成長促進分子の通過を可能にすることによって細胞の成長を可能にする5μmの細孔サイズPC膜によって分離された2つの流体室から構成される。上のチャンバは組織構築物を保持し、この場合、hFBを含むフィブリンヒドロゲル上のhKCsの単層である。
チャネルの高さは、各チャンネルに追加される粘着シートの数によって決まります...

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Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

ここでは、マイクロマシンマイクロ流体プラットフォームを用いて、3次元の簡易および未分化皮膚モデルを生成するプロトコルを提示する。平行流アプローチは上の上の上皮細胞の播種のための真皮のコンパートメントの その場の 堆積を可能にし、すべてシリンジポンプによって制御される。

マイクロマシンマイクロ流体プラットフォームにおける簡単な3次元スキンオンチップモデルの生成

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

マイクロマシン加工された接着ビニール層と真皮コンパートメント生成のための平行流方法論を使用して3Dスキンオンチップをモデリングするための新しいリソグラフィーフリープロトコルです。マイクロマシンドビニールは、PDMSおよび従来のリソグラフィアプローチの制限の一部を克服し、デバイスのレイアウトにおける製造プロセスと汎用性においてよりシンプルさを提供します。この多層スキンオンチップは、低コストでハイスループットスクリーニングを可能にし、いくつかの疾患をモデル化するために使用できるため、薬物および化粧品の検査アプローチに使用できます。ブラザーキャンバスワークスペースソフトウェアを使用してマイクロ流体チップを設計することで始めます。30×30センチメートルのワークスペースを作成し、それをsvgファイルに保存する前に、チップの異なる層の設計パターンで埋めます。30センチメートルのビニールシートを切ります。低タックの粘着マットに貼り付け、必要に応じてすべての気泡を除去します。USB ドライブを使用して、svg ファイルをエッジ プロッタにアップロードし、切断パラメータをレベル 0 のカット圧力、レベル 3 の切断ブレード、切断速度のレベル 1 として設定します。パラメータを設定したら、ビニールを持つ粘着マットをプロッタに配置し、95マイクロメートルの厚さのビニールでチャネルパターンを切断するプロセスを開始します。適切な調整チャネル、入口、およびコンセント用のアライナを使用してデバイス全体を組み立てます。下部のチャネルを組み立てるための対応するマイクロマシンの設計でビニール層のために積み重ね、アライナに付着しないように底層のカバーテープを保持します。入口を覆うことなく、ポリカーボネート多孔膜を下チャンネルの上にカットして配置します。上部室のデザインで10個のビニール層を追加し、上に両面テープの最終層を貼り付けます。チップをアライナーから取り外し、ガラススライドに貼り付けます。厚さ2ミリメートルのPDMSシートを両面テープビニール層の上に置きます。チップが完全に水密であることを確認するには、チップの上に一晩重量を残します。翌日、チップを70%エタノールで5分間洗い流し、続いて蒸留水で洗浄して殺菌します。ポンプ1とポンプ2を上部室入口1と上部室入口2にそれぞれ接続します。ポンプ3を下室入口に接続し、上部チャンバーと下部室の出口を廃槽に接続します。PTFEチューブと18ゲージのステンレス鋼コネクタを使用して、各インレットに注射器を接続します。ポンプ3でポンプ3分毎分50マイクロリットルで下室入口を通して、そして毎分100マイクロリットルで上の部屋の入口2を通してポンプ2を備える。次に、フィブリノーゲンプレゲルをシリンジに積み込み、すぐにポンプ1に入れ、毎分200マイクロリットルで動かします。プレゲルが上層室出口から出たら、ポンプ1と2を止め、チューブを取り外さずにチップを残して37°Cで10分間ゲル化を可能にする。ゲレーション後、上部チャンバーの入口1をキャップでブロックし、一晩50マイクロリットルでポンプ3で上チャンバー入口2を通して培養培地をポンプで送る。真皮コンパートメントの生成から24時間後、ヒト原発性線維芽細胞がアセンブリ内に広がっていることを確認し、1分間40マイクロリットルで上チャネル入口2を通して1ミリリットル当たり10倍から6 HKCsを導入する。細胞の取り付けについては、湿度飽和インキュベーターに37°Cでチップを一晩置きます。1分間に50マイクロリットルで下室の入口を通してポンプ3で新鮮な培養培地をポンピングし始める。代表的な分析では、アセンブリの上部チャンバーに沿ったヒドロゲルの高さが表示される。平均高さ550マイクロメートルは、犠牲PBSとプレゲルの1分あたりの流量100と200マイクロリットルでゲルの機能に最適でした。下層チャネルを通してPBSをフラッシュできなかった場合、ゲルの理論高さと測定されたものとの間の不一致が生じ、並列流プロトコルの開始から24時間後に40%の差を付け、ヒトの原発線維芽細胞がアセンブリの上部チャンバーのフィブリンゲルに正常に広がることを発見し、 その後、緑色蛍光タンパク質発現性HKCをヒドロゲルの上に効果的に播種することができる。HKCSが沈着するようにシステムを一晩閉じ込めずにチューブを除去すると、細胞の不均一でコンフルエントな単層が生じた。マイクロ流体チップにおける未分化皮膚モデルの3D共焦点解析は、下部に埋め込まれた線維芽細胞から上方のHKCsを分離するヒドロゲルの表面を明確に示した。生成された皮膚は、成熟した区別された表皮を得るために空気/液体界面に露出することができ、さらにいくつかの真皮および表皮マーカーを使用して特徴付けることができる。この技術は、より速く、より安価なデバイスの製造、およびマイクロ流体を使用して多層皮膚の生成を可能にし、薬物および化粧品のテストのためのより現実的なアプローチを提供する。

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