Name: generation of a simplified three-dimensional skin-on-a-chip model in a micromachined microfluidic platform
Uploaded: 2021-05-17T14:30:00
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하비에르 로드리게스 박사, 마리아 루이사 로페즈 박사, 카를로스 마텔란, 후안 프란시스코 로드리게스에게 매우 유용한 제안, 토론 및/또는 예비 데이터에 진심으로 감사드립니다. 또한 세르지오 페른란데스, 페드로 헤레로스, 라라 스톨젠부르크의 공헌에 감사드립니다. GFP 라벨hF와 hKC에 대한 박사 마르타 가르시아에 특별한 감사. 마지막으로, 기예르모 비즈카이노와 앙겔리카 코랄의 뛰어난 기술 적 지원을 인정합니다. 이 작품은 "Programa de Actividades de I+D 엔트레 그루포스 드 Investigación de la Comunidad de Madrid", Project S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM에 의해 지원되었습니다. 이 작품은 또한 "Programa de excelencia", 프로젝트 EPUC3M03, CAM에 의해 지원되었습니다. 콘세예리아 드 EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.

1. 칩 설계 및 마이크로 머시닝 매개 변수
<ol><li>FreeCAD 오픈 소스 설계 소프트웨어로 미세 유체 칩 레이어를 설계합니다. 채널의 치수에 대한 표 1을 참조하십시오. 올바른 레이어 중첩을 위해 사용자 정의 제작 된 정렬기를 사용하는 설계에 직경 4개의 구멍을 포함합니다.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>길이(μm)</td>
		...

<ol>
	<li>McNamee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tiered+approach+to+the+use+of+alternatives+to+animal+testing+for+the+safety+assessment+of+cosmetics:+Eye+irritation.">A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 54 (2), 197-209 (2009).</li><li>Mathes, S. 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이 방법을 개발하는 동기는 피부 질환을 모델링하고 높은 처리량 플랫폼에서 새롭고 혁신적인 치료법의 효과를 연구하려는 욕구였습니다. 현재까지 이 실험실은 수동적으로 또는 3D 바이오 프린팅 기술의 도움으로 이러한 진모 표피 등가물을 생성합니다- 섬유아세포가 있는 피브린 젤은 세포 배양 삽입 플레이트에 삽입하고 그 위에 각질 세포를 파종합니다. 각질 세포가 합류하면 3D 배양은 각질 ...

최근에는 화장품 및 의약품의 독성 분석을 위한 체외 인체 피부 모델의 개발 및 생산을 향한 발전이 이루어지고있다. 제약 및 스킨 케어 산업의 연구원은 동물을 사용하고있다, 마우스가 가장 일반적인되고, 자신의 제품을 테스트하기 위해2,3,4,5. 그러나, 동물에 대한 제품을 테스트하는 것은 인간에서 항상 반응을 예측하는 것은 아니며, 이는 종종 인간에서 약물 실패 또는 부작용으로 이어지며 결과적으로 경제적 손실5,6. 영국은 1998년에 화장품 검사를 위해 동물을 사용하는 것을 금지한 최초의 국가였습니다. 이후 2013년 EU는 동물 화장품 의 검사 및 승인을 금지했다(EU 화장품 규정 제1223호/2009)7.
이 금지는 미국8의'휴먼 화장품 법'과 같은 다른 국가에서도 고려되고 있습니다. 윤리적 관심사 외에도 동물과 인간의 피부 사이의 해부학적 차이는 동물 실험을 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들고 종종 비효율적입니다. 또한, 2025년9년까지전 세계 체외 독성 검사 시장 규모는 2698억 달러에 이를 것으로 예상됩니다. 이러한 이유로, 동물을 사용하지 않고 화장품과 약물의 안전성과 독성 효과에 대한 테스트를 가능하게 하는 생체 공학 인간 피부 모델과 같은 체외 연구를 위한 새로운 방법과 대안을 개발할 필요가 있습니다.
시험관, 인간 피부 모델에서 두 가지 종류의 시판이 가능합니다. 첫 번째 유형은 서로 다른 재료에 시드되는 각질 세포의 여러 층을 포함하는 계층화된 표피 등가물로 구성됩니다. 이들 중 일부는 경제협력개발기구(OECD)의 승인을 받았으며, EpiDerm 또는 SkinEthic10,11,12와같은 피부 부식 및 자극 테스트를 위한 대안방법 검증을 위한 유럽 센터(ECVAM)에 의해 검증되었다. 두 번째 유형은 T-Skin 및 EpiDerm-FT와 같은 섬유아세포가 함유된 3차원(3D) 비계에 시드된 인간 각질 세포를 분화하는 층이 있는 전체 피부 등가물입니다. 그러나, 이 모형은 정확하게 인간적인 생리적인 조건을 나타낼 수 없는 정적인 조건하에서 배양됩니다.
최근 관심은 동적 관류13,14,15,16,17,18,19를가진 세포 배양 삽입 (CCI) 형식으로 체외 3D 피부 모델을 생성하는 데 초점을 맞추고있다. 그러나 이러한 시스템은 현장에서의 고전적인 정의에 따라 미세 유체 피부 온 칩으로 엄격하다고 간주 할 수 없습니다. 장기에 칩에 대한 Ingber의 정의는 장기가 미세 유체 채널 내부에 배치되어야한다고 명시, 이는 단지 몇 장치가20을충족하는 조건입니다20,21. 스킨 온 칩은 지금까지 다공성 멤브레인22,23로분리된 단세포 층 및/또는 진피 세포 층으로서 대부분 간단한 상피를 모델링하였다. 미세 유체 시스템16,24에서피부를 모델링하는 몇 가지 발전이 있었지만, 현재 잉버의 정의에 맞는 장기 온 - 어 칩 시스템을 보여주는 문헌이 없다, 장소에서 다층 피부를 생성 할 수 및 상피 및 기질 구성 요소를 모두 포함.
이 작품에서는 스킨 온-어칩 애플리케이션을 위한 새롭고 비용 효율적이고 견고한 비닐 기반 의 미세 유체 플랫폼이 제공됩니다. 이 플랫폼은 PDMS25의일부 한계를 극복하면서 제조 공정에서 보다 단순하고 장치 레이아웃의 유연성과 다기능성을 높이는 마이크로 가공에 의해 생산되었습니다. 주사기 펌프로 제어되는 병렬 흐름을 통해 단순화된 피부 구조를 도입하는 방법도 설계되었습니다. 병렬 흐름은 매우 다른 점도 (이 경우 버퍼 및 피브린 프리 젤)를 가진 두 유체가 서로 혼합하지 않고 채널을 통해 침투 할 수 있게합니다. 개념의 증거로서, 진피를 모방한 피브린 매트릭스에 내장된 섬유아세포를 함유한 진피 분체 구조가 장치에 도입되었으며, 그 위에 각질 세포의 단층이 장화되어 미분화 표피를 모방하였다. 진피 구획 높이는 유량을 수정하여 변조될 수 있다. 이 작품의 주요 참신함은, 이전에 설명된모델(22,26,27,28,29)에비해 미세유체제를 통해 마이크로챔버 내부의 3D 구조의 개발이다. 이 문서는 단순화 된 미분화 피부를 제공하지만, 장기적인 목표는 생성하고 약물 및 화장품 테스트 목적으로 의 생존력과 기능을 보여주기 위해 완전히 차별화 된 피부 구조를 특성화하는 것입니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Amchafibrin</td>
			<td>Rottafarm</td>
			<td></td>
			<td>Tranexamic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic</td>
			<td>Thermo Scientific HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape vynil</td>
			<td>ATP Adhesive Systems</td>
			<td></td>
			<td>GM 107CC, 12 &#181;m thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edge plotter</td>
			<td>Brother</td>
			<td></td>
			<td>Scanncut CM900</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Scientific HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Extracted from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-Human dermal fibroblasts</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Primary. Gift from Dr. Marta Garc&#237;a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2B-GFP-HaCaT cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta Garc&#237;a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/dead kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Merk TM</td>
			<td></td>
			<td>5 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>Sylgard 184</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>10 NIH/vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent adhesive vinyl</td>
			<td>Mactac</td>
			<td></td>
			<td>JT 8500 CG-RT, 95 &#181;m thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td></td>
			<td>Teflon, 1/16&#8221; OD, 0.020&#8221; ID</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a simplified three-dimensional skin-on-a-chip model in a micromachined microfluidic platform

이 작품은 복잡한 다층 조직을 생성 할 수있는 잠재력을 가진 새롭고 비용 효율적이며 신뢰할 수있는 미세 유체 플랫폼을 제공합니다. 개념의 증거로, 진피 (기질)와 표피 (상피) 구획을 포함하는 단순화되고 미분화되지 않은 인간 피부를 모델링했습니다. 이를 위해, 2개의 챔버로 나뉘어진 다목적이고 견고한 비닐 계열 장치가 개발되어 고가의 특수 장비의 사용 또는 소형 소수성 분자 및 단백질의 흡수와 같은 생물 의학 응용을 위한 다디메틸실록산(PDMS)을 기반으로 한 미세 유체 장치에 존재하는 몇 가지 단점을 극복했습니다. 더욱이, 병렬 흐름을 기반으로 하는 새로운 방법이 개발되어 진피 및 표피 구획모두의 시상증을 가능하게 하였다. 피부 구조는 인간 1 차 섬유아세포와 위에 시드된 불멸의 각질 세포의 단층이 포함된 피브린 매트릭스로 이루어져 있으며, 이는 이후 동적 배양 조건하에서 유지됩니다. 이 새로운 미세 유체 플랫폼은 인간의 피부 질환을 모델링하고 다른 복잡한 조직을 생성하는 방법을 추정 할 수있는 가능성을 엽니 다.

설계 된 칩은 하부 챔버에서 성장 촉진 분자의 통과를 허용하여 세포의 성장을 허용하여 세포의 성장을 허용하는 5 μm 모공 크기의 PC 멤브레인에 의해 분리 된 두 개의 유체 챔버로 구성되어 있습니다. 상부 챔버는 조직 구조를 보유하고, 이 경우, hFB를 포함하는 피브린 하이드로 겔에 hKC의 단층.
채널의 높이는 각 채널에 추가된 접착제 시트 수에 따라 결정됩니다. 하부 챔버?...

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Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

여기서는 마이크로머신 마이크로유체 플랫폼을 사용하여 3차원 단순화 및 미분화 피부 모델을 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 병렬 흐름 접근법은 주사기 펌프에 의해 제어되는 상피 세포의 파종을 위해 진피 구획의 시상 증착을 허용합니다.

마이크로머신 마이크로유체 플랫폼의 간소화된 3차원 스킨 온-어칩 모델 생성

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

이것은 마이크로 머신, 접착제 비닐 레이어 및 진피 구획 생성을위한 병렬 흐름 방법론을 사용하여 3D 스킨 온 칩을 모델링하기위한 새로운 리소그래피프리 프로토콜입니다. 마이크로머신드 비닐은 PDMS 및 기존 리소그래피 접근법의 몇 가지 한계를 극복하면서 장치의 레이아웃에서 제조 공정과 다기능성을 보다 단순하게 제공합니다. 이 다층 스킨 온 -a-칩은 낮은 비용으로 높은 처리량 스크리닝을 허용하고 여러 질병을 모델링하는 데 사용할 수 있기 때문에 약물 및 화장품 테스트 접근 방식에 사용할 수 있습니다.먼저 캔버스 형제 의 작업 공간 소프트웨어를 사용하여 미세 유체 칩을 설계하십시오. 30-30센티미터 작업 공간을 만들고 칩의 다른 레이어에 대한 설계 패턴으로 채운 다음 svg 파일에 저장합니다. 30~30cm 의 비닐 시트를 잘라냅니다.저압 접착제 매트에 붙이고 필요에 따라 모든 기포를 제거하십시오. USB 드라이브를 사용하여 svg 파일을 가장자리 플로터에 업로드하고 절삭 매개변수를 레벨 0에서 절삭 압력, 레벨 3에서 블레이드 절단 및 절삭 속도에 대한 레벨 1로 설정합니다. 매개 변수가 설정되면 접착제 매트를 비닐로 플로터에 넣고 95 마이크로미터 두께의 비닐에서 채널 패턴을 절단하는 과정을 시작합니다.적절한 조정 채널, 입구 및 콘센트에 대한 정렬기를 사용하여 전체 장치를 조립합니다. 하부 채널을 조립하기 위한 해당 마이크로머신 설계로 비닐 레이어를 쌓아 서, 하단 레이어의 커버 테이프를 유지하여 정렬기에 달라붙지 않도록 합니다. 잘라 내어 입구를 덮지 않고 하부 채널 위에 폴리카보네이트 다공성 멤브레인을 놓습니다.상부 챔버 디자인으로 10 개의 비닐 레이어를 추가하고 양면 테이프 최종 레이어를 위에 고정시하십시오. 유리 슬라이드에 붙이기 위해 정렬기에서 칩을 제거합니다. 양면 테이프 비닐 레이어 위에 2mm 두께의 PDMS 시트를 놓습니다.칩이 완전히 방수되었는지 확인하려면 밤새 칩 위에 무게를 둡니다. 다음 날, 5 분 동안 70 %에탄올로 세척하여 칩을 살균한 다음 증류수로 세척합니다. 펌프 1개를 연결하고 2개를 상부 챔버 입구 에 각각 연결및 상부 챔버 입구 2개에 각각 연결한다.펌프 3을 하부 챔버 입구에 연결한 다음 상부 챔버 및 하부 챔버 콘센트를 폐수 욕조에 연결합니다. PTFE 튜브와 18게이지 스테인리스 스틸 커넥터를 사용하여 각 인렛에 주사기를 연결합니다. 분당 50 마이크로리터에서 하부 챔버 입구를 통해 3 개의 펌프 PBS를 펌프하고, 분당 100 마이크로 리터에서 상부 챔버 입구 2 개를 통해 펌프 2를 펌핑합니다.그런 다음, 피브리노겐 프리 젤로 주사기를 적재하고 즉시 펌프 하나에 넣고 분당 200 마이크로리터로 실행합니다. 사전 젤이 상부 챔버 콘센트를 종료하면, 튜브를 제거하지 않고, 1 과 2 펌프를 중지, 10 분 동안 섭씨 37도에서 젤링을 허용칩을 둡니다. 겔화 후, 상부 챔버 입구를 캡으로 하나씩 차단하고, 상층실 입구를 통해 배양 배지를 펌핑하여 2개의 상부 챔버 입구를 통해 펌프 3개로 밤새 시간당 50 마이크로리터에서 펌프를 펌핑한다.진피 구획의 생성 후 24시간, 인간 1차 섬유아세포 세포가 어셈블리에 퍼지는지 확인한 다음, 1분 동안 분당 40 마이크로리터에서 2개의 상부 채널 입구를 통해 밀리리터당 6개의 HKC에 5회 10을 도입한다. 세포 부착의 경우, 습도 포화 인큐베이터에 섭씨 37도에 칩을 하룻밤 누를 수 있습니다. 분당 50 마이크로리터에서 하부 챔버 입구를 통해서만 3개의 펌프로 신선한 배양 배지를 펌핑하십시오.대표적인 분석에서, 어셈블리의 상부 챔버를 따라 하이드로겔의 높이가 표시됩니다. 550 마이크로미터의 평균 높이는 희생 PBS 및 프리 젤에 대해 분당 100 및 200 마이크로리터의 유량으로 젤의 작동을 위해 각각 최적이었습니다. 하부 채널을 통해 PBS를 플러시하지 못하면 겔의 이론적 높이와 측정된 1개 사이의 불일치로 이어졌으며, 병렬 유동 프로토콜의 개시로부터 24시간 후 40%의 차이로, 인간 1차 섬유아세포는 어셈블리의 상부 챔버에서 피브린 젤에 성공적으로 퍼지는 것으로 밝혀졌다. 그 다음에, 녹색 형광 단백질 표현 HKC는 하이드로겔의 위에 효과적으로 종자될 수 있었습니다.HKCS가 퇴적물을 할 수 있도록 하룻밤 동안 시스템을 닫지 않고 튜브를 제거하면 균일하지 않은 셀 의 단일 레이어가 발생했습니다. 미세 유체 칩에서 미분화 된 피부 모델의 3D 공초점 분석은 명확하게 하단에 내장 된 섬유 아세포에서 상단에 있는 HKC를 분리 하는 하이드로겔의 표면을 보여주었다. 생성된 피부는 성숙하고 분화된 표피를 얻기 위해 공기/액체 인터페이스에 노출될 수 있으며, 여러 진피 및 표피 마커를 사용하여 더욱 특징지어질 수 있다.이 기술은 더 빠르고 저렴한 장치 제조를 허용하고, 마이크로 유체를 사용하여 다층 피부의 생성을 허용하여 약물 및 화장품 테스트에 보다 현실적인 접근 방식을 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

입체 광학 해상도 Photoacoustic 현미경

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

연구

생체공학

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

전도성 잉크의 평면 및 3 차원 인쇄

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

마이크로 유체 플랫폼을 사용하여 높은 처리량 단백질 표현 생성기

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

강력한, 미세 유체 세포 내 전달 플랫폼으로 휴대 뒤쪽에서

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

모델 보컬 폴드 폴립에 의해 유도된 3차원 유동 분리 조사

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

3 차원 전체 두께 피부의 세대 동등한 및 자동화 부상

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

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반전 콜로이드 결정체 폴리 (에틸렌 글리콜) 비계의 제작 : 간 조직 공학을위한 삼차원 세포 배양 플랫폼

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

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Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

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입자의 공간 추적을위한 멀티 플렉스 전자 감지와 미세 유체 플랫폼

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

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꼬마 선 충 에 경도 이미징을 위한 미세 플랫폼

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...