Name: generation of a simplified three-dimensional skin-on-a-chip model in a micromachined microfluidic platform
Uploaded: 2021-05-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform at JoVE.com

Vi takker oppriktig Dr. Javier Rodríguez, Dr. María Luisa López, Carlos Matellán og Juan Francisco Rodríguez for svært nyttige forslag, diskusjoner og / eller foreløpige data. Vi takker også bidragene fra Sergio Férnandez, Pedro Herreros og Lara Stolzenburg til dette prosjektet. Spesiell takk gå til Dr. Marta García for GFP-merket hFB og hKCs. Til slutt anerkjenner vi den utmerkede tekniske hjelpen til Guillermo Vizcaíno og Angélica Corral. Dette arbeidet ble støttet av "Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid", Project S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Dette arbeidet ble også støttet av "Programa de excelencia", Project EPUC3M03, CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.

1. Chip design og mikromaskinering parametere
<ol><li>Design de mikrofluidiske chiplagene med FreeCAD åpen kildekode-designprogramvare; se tabell 1 for dimensjonene til kanalene. Inkluder fire hull med en diameter på 2,54 mm i designet for å bruke en skreddersydd justering for riktig lagoverlegg.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Lengde (μm)</td>
			<td>Bredde (μm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nedre kammer</td...

<ol>
	<li>McNamee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tiered+approach+to+the+use+of+alternatives+to+animal+testing+for+the+safety+assessment+of+cosmetics:+Eye+irritation.">A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 54 (2), 197-209 (2009).</li><li>Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+skin+models+in+drug+development.">The use of skin models in drug development.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 81-102 (2014).</li><li>Abd, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+models+for+the+testing+of+transdermal+drugs.">Skin models for the testing of transdermal drugs.</a> Clinical Pharmacology: Advances and Applications. 8, 163-176 (2016).</li><li>Flaten, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+skin+models+as+a+tool+in+optimization+of+drug+formulation.">In vitro skin models as a tool in optimization of drug formulation.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 75, 10-24 (2015).</li><li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+skin+disease+for+drug+discovery.">Animal models of skin disease for drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 8 (3), 331-355 (2014).</li><li>Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lost+in+translation:+animal+models+and+clinical+trials+in+cancer+treatment.">Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment.</a> American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).</li><li>Pronko, P. P., VanRompay, P. A., Zhang, Z., Nees, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pronko+et+al.+Reply.">Pronko et al. Reply.</a> Physical Review Letters. 86 (7-12), 1387 (2001).</li><li>H.R.2858 - Humane Cosmetics Act. 114th Congress Available from: <a target="_blank" href="https://congress.gov/bill/114th-congress/house-bill/2858">https://congress.gov/bill/114th-congress/house-bill/2858</a> (2016)</li><li>. Global in-vitro toxicology testing market report: size, share &amp; trends analysis 2014-2015 Available from: <a target="_blank" href="https://www.prnewswire.com/news-releases/global-in-vitro-toxicology-testing-market-report-size-share--trends-analysis-2014-2025-300704958.html">https://www.prnewswire.com/news-releases/global-in-vitro-toxicology-testing-market-report-size-share--trends-analysis-2014-2025-300704958.html</a> (2018)</li><li>Zhang, Z., Michniak-Kohn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineered+human+skin+equivalents.">Tissue engineered human skin equivalents.</a> Pharmaceutics. 4 (1), 26-41 (2012).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+skin+corrosion:+reconstructed+human+epidermis+(RhE)+test+method.+Test+Guideline+No.431.">In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RhE) test method. Test Guideline No.431.</a> OECD Guideline for Testing of Chemicals. , (2019).</li><li>Almeida, A., Sarmento, B., Rodrigues, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+in+vitro+models+for+safety+and+toxicity+assessment+of+cosmetic+ingredients.">Insights on in vitro models for safety and toxicity assessment of cosmetic ingredients.</a> International Journal of Pharmaceutics. 519 (1-2), 178-185 (2017).</li><li>vanden Broek, L. J., Bergers, L. I. J. C., Reijnders, C. M. A., Gibbs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+future+Prospectives+in+Skin-on-Chip+Development+with+Emphasis+on+the+use+of+Different+Cell+Types+and+Technical+Challenges.">Progress and future Prospectives in Skin-on-Chip Development with Emphasis on the use of Different Cell Types and Technical Challenges.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 13 (3), 418-429 (2017).</li><li>Ata&#231;, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+on-a-chip:+In+vitro+skin+models+versus+ex+vivo+tissue+maintenance+with+dynamic+perfusion.">Skin and hair on-a-chip: In vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion.</a> Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).</li><li>Abaci, H. E., Gledhill, K., Guo, Z., Christiano, A. M., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pumpless+microfluidic+platform+for+drug+testing+on+human+skin+equivalents.">Pumpless microfluidic platform for drug testing on human skin equivalents.</a> Lab on a Chip. 15 (3), 882-888 (2015).</li><li>Wu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-thickness+human+skin-on-chip+with+enhanced+epidermal+morphogenesis+and+barrier+function.">Full-thickness human skin-on-chip with enhanced epidermal morphogenesis and barrier function.</a> Materials Today. 21 (4), 326-340 (2017).</li><li>Materne, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multi-organ+chip+-+a+microfluidic+platform+for+long-term+multi-tissue+coculture.">The multi-organ chip - a microfluidic platform for long-term multi-tissue coculture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52526 (2015).</li><li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+of+a+full-thickness+skin+equivalent+in+a+96-well+insert+format+for+substance+permeation+studies+and+organ-on-a-chip+applications.">Bioengineering of a full-thickness skin equivalent in a 96-well insert format for substance permeation studies and organ-on-a-chip applications.</a> Bioengineering. 5 (2), 43 (2018).</li><li>Alberti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-chamber+microfluidic+platform+for+high-precision+skin+permeation+testing.">Multi-chamber microfluidic platform for high-precision skin permeation testing.</a> Lab on a Chip. 17, 1625-1634 (2017).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature BIotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li><li>Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+3D+cell+culture+to+organs-on-chips.">From 3D cell culture to organs-on-chips.</a> Trends in Cell Biology. 21 (12), 745-754 (2011).</li><li>Wufuer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-on-a-chip+model+simulating+inflammation,+edema+and+drug-based+treatment.">Skin-on-a-chip model simulating inflammation, edema and drug-based treatment.</a> Scientific Reports. 6, 37471 (2016).</li><li>Ramadana, Q., Ting, F. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micro-physiological+immune-competent+model+of+the+human+skin.">In vitro micro-physiological immune-competent model of the human skin.</a> Lab on a Chip. 16, 1899-1908 (2016).</li><li>Kim, K., Jeon, H. M., Choi, K. C., Sung, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+effectiveness+of+Curcuma+longa+leaf+extract+on+a+skin+equivalent+using+a+pumpless+skin-on-a-chip+model.">Testing the effectiveness of Curcuma longa leaf extract on a skin equivalent using a pumpless skin-on-a-chip model.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3898 (2020).</li><li>Halldorsson, S., Lucumi, E., G&#243;mez-Sj&#246;berg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices.">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li><li>Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+disease+model+of+drug+toxicity+-+induced+pulmonary+edema+in+a+lung-on-a-chip+microdevice.">A human disease model of drug toxicity - induced pulmonary edema in a lung-on-a-chip microdevice.</a> Scientific Translational Medicine. 4 (159), (2012).</li><li>Beckwitt, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+'+organ+on+a+chip+'.">Liver ' organ on a chip '.</a> Experimental Cell Research. 363 (1), 15-25 (2018).</li><li>Poceviciute, R., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-gut-microbiome+on+a+chip.">Human-gut-microbiome on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 500-501 (2019).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).</li><li>Esc&#225;mez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+optimal+virus-mediated+growth+factor+gene+delivery+for+human+cutaneous+wound+healing+enhancement.">Assessment of optimal virus-mediated growth factor gene delivery for human cutaneous wound healing enhancement.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128 (6), 1565-1575 (2008).</li><li>Llames, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+plasma+as+a+dermal+scaffold+for+the+generation+of+a+completely+autologous+bioengineered+skin.">Human plasma as a dermal scaffold for the generation of a completely autologous bioengineered skin.</a> Transplantation. 77 (3), 350-355 (2004).</li><li>Llames, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+results+of+an+autologous+engineered+skin.">Clinical results of an autologous engineered skin.</a> Cell Tissue Bank. 7 (1), 47-53 (2006).</li><li>Cubo, N., Garcia, M., del Ca&#241;izo, J. F., Velasco, D., Jorcano, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+functional+human+skin:+production+and+in+vivo+analysis.">3D bioprinting of functional human skin: production and in vivo analysis.</a> Biofabrication. 9 (1), 015006 (2016).</li><li>Mori, N., Morimoto, Y., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+integrated+with+perfusable+vascular+channels+on+a+chip.">Skin integrated with perfusable vascular channels on a chip.</a> Biomaterials. 116, 48-56 (2017).</li><li>Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+microbiome+and+mechanical+deformation+to+intestinal+bacterial+overgrowth+and+inflammation+in+a+human+gut-on-a-chip.">Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 7-15 (2016).</li><li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidics-based+in+vitro+model+of+the+gastrointestinal+human-microbe+interface.">A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface.</a> Nature Communications. 7, 11535 (2016).</li><li>Marx, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-on-a-chip'+developments:+A+translational+cuttingedge+alternative+to+systemic+safety+assessment+and+efficiency+evaluation+of+substances+in+laboratory+animals+and+man.">Human-on-a-chip' developments: A translational cuttingedge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 40 (5), 235-257 (2012).</li><li>Bein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organ-on-a-chip+models+of+human+intestine.">Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).</li><li>Bennet, D., Estlack, Z., Reid, T., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microengineered+human+corneal+epithelium-on-a-chip+for+eye+drops+mass+transport+evaluation.">A microengineered human corneal epithelium-on-a-chip for eye drops mass transport evaluation.</a> Lab on a Chip. 18, 1539-1551 (2018).</li><li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow.">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab on a chip. 12, 2165-2174 (2012).</li><li>Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut-on-a-chip+microenvironment+induces+human+intestinal+cells+to+undergo+villus+differentiation.">Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation.</a> Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).</li><li>O'Neill, A. T., Monteiro-Riviere, N. A., Walker, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microfluidic+human+epidermal+keratinocyte+culture.">Characterization of microfluidic human epidermal keratinocyte culture.</a> Cytotechnology. 56 (3), 197-207 (2008).</li><li>Ren, K., Chen, Y., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+materials+for+microfluidics+in+biology.">New materials for microfluidics in biology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 25, 78-85 (2014).</li></ol>

Motivasjonen for å utvikle denne metoden var ønsket om å modellere hudsykdommer og studere effekten av nye og innovative terapier i en plattform med høy gjennomstrømning. Til dags dato produserer dette laboratoriet disse dermo-epidermale ekvivalentene ved å støpe- enten manuelt eller ved hjelp av 3D-bioprintingsteknologien - fibringelen med fibroblaster i en cellekulturinnleggsplate og sådd keratinocyttene på toppen av den. Når keratinocyttene når samløp, blir 3D-kulturen utsatt for luftvæskegrensesnittet, s...

Nylig har det blitt gjort fremskritt mot utvikling og produksjon av in vitro menneskelige hudmodeller for analyse av toksisiteten til kosmetiske og farmasøytiske produkter1. Forskere i farmasøytisk og hudpleieindustri har brukt dyr, mus er de vanligste, for å teste sine produkter2,3,4,5. Imidlertid er testing av produkter på dyr ikke alltid prediktivt for responsen hos mennesker, noe som ofte fører til narkotikasvikt eller bivirkninger hos mennesker og følgelig til økonomiske tap5,6. Storbritannia var det første landet som forbød bruk av dyr til kosmetisk testing i 1998. Senere, i 2013, forbød EU testing og godkjennelse av kosmetikk hos dyr (EU Cosmetics Regulation No. 1223/2009)7.
Dette forbudet vurderes også av andre land som i 'The Humane Cosmetics Act' i USA8. I tillegg til etiske bekymringer gjør de anatomiske forskjellene mellom dyr og menneskelig hud dyreforsøk tidkrevende, dyre og ofte ineffektive. Videre forventes den globale in vitro toksikologitestingsmarkedets størrelse å nå 26,98 milliarder USD innen 20259. Av disse grunnene er det behov for å utvikle nye metoder og alternativer for de in vitro-studiene, for eksempel bioengineered menneskelige hudmodeller, som muliggjør testing for sikkerhet og toksiske effekter av kosmetikk og narkotika uten bruk av dyr.
Det finnes to forskjellige typer kommersielt tilgjengelige, in vitro, menneskelige hudmodeller. Den første typen består av stratifiserte epidermale ekvivalenter som inneholder flere lag med differensierende keratinocytter som er frøet på forskjellige materialer. Noen av dem er godkjent av Organisasjonen for økonomisk samarbeid og utvikling (OECD) og validert av (European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) for hudkorrosjon og irritasjonstesting, for eksempel EpiDerm eller SkinEthic10,11,12. Den andre typen er full-skin ekvivalenter med et lag av differensiering menneskelig keratinocytter frøet på en tredimensjonal (3D) stillas som inneholder fibroblaster, for eksempel T-Skin og EpiDerm-FT. Imidlertid dyrkes disse modellene under statiske forhold, noe som gjør at de ikke kan representere menneskelige fysiologiske forhold nøyaktig.
Nylig interesse har fokusert på å generere in vitro 3D-hudmodeller i cellekulturinnsettingsformater (CCI) med dynamisk perfusjon13,14,15,16,17,18,19. Imidlertid kan disse systemene ikke betraktes som stricto sensu som mikrofluidisk hud-på-chips i henhold til deres klassiske definisjon i feltet. Ingbers definisjon for organer-på-en-chip sier at orgelet må plasseres inne i mikrofluidiske kanaler, noe som er en betingelse at bare noen få enheter oppfyller20,21. Skin-on-chips har så langt modellert for det meste enkle epithelia som encellede lag og / eller dermale cellelag skilt av en porøsmembran 22,23. Selv om det har vært noen fremskritt modellering hud i mikrofluidiske systemer16,24, det er for tiden ingen litteratur som viser et organ-on-a-chip system som passer Ingber definisjon, i stand til å produsere en flerlags hud in situ og inkludert både epitelial og stromal komponenter.
I dette arbeidet presenteres en ny, kostnadseffektiv, robust, vinylbasert mikrofluidisk plattform for hud-på-en-chip-applikasjoner. Denne plattformen ble produsert av mikrobearbeiding, som gir mer enkelhet i fabrikasjonsprosessen, samt økt fleksibilitet og allsidighet i utformingen av enheten, og overvinner noen av begrensningene til PDMS25. En måte å introdusere en forenklet hudkonstruksjon gjennom en parallell strømning kontrollert med sprøytepumper ble også designet. Parallell strømning gjør at to væsker med svært forskjellige viskositeter (en buffer og fibrin pre-gel i dette tilfellet) kan perfunderes gjennom en kanal uten å blande seg med hverandre. Som et konseptbevis ble en dermo-epidermal konstruksjon som inneholder fibroblaster innebygd i en fibrinmatrise som etterligner dermis introdusert i enheten, på toppen av hvilken en monolayer av keratinocytter ble lastet for å etterligne den uavklarte epidermis. Høyden på det dermale rommet kan moduleres ved å endre strømningshastighetene. Hovednyheten i dette arbeidet, sammenlignet med tidligere beskrevne modeller22,26,27,28,29, er utviklingen av en 3D-konstruksjon inne i en mikrokammer ved hjelp av mikrofluidikk. Selv om denne artikkelen presenterer en forenklet undifferentiated hud, er det langsiktige målet å generere og karakterisere en fullt differensiert hudkonstruksjon for å demonstrere sin levedyktighet og funksjonalitet for narkotika- og kosmetiske testformål.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amchafibrin</td>
			<td>Rottafarm</td>
			<td></td>
			<td>Tranexamic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic</td>
			<td>Thermo Scientific HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape vynil</td>
			<td>ATP Adhesive Systems</td>
			<td></td>
			<td>GM 107CC, 12 &#181;m thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edge plotter</td>
			<td>Brother</td>
			<td></td>
			<td>Scanncut CM900</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Scientific HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Extracted from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-Human dermal fibroblasts</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Primary. Gift from Dr. Marta Garc&#237;a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2B-GFP-HaCaT cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta Garc&#237;a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/dead kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Merk TM</td>
			<td></td>
			<td>5 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>Sylgard 184</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>10 NIH/vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent adhesive vinyl</td>
			<td>Mactac</td>
			<td></td>
			<td>JT 8500 CG-RT, 95 &#181;m thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td></td>
			<td>Teflon, 1/16&#8221; OD, 0.020&#8221; ID</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a simplified three-dimensional skin-on-a-chip model in a micromachined microfluidic platform

Dette arbeidet presenterer en ny, kostnadseffektiv og pålitelig mikrofluidisk plattform med potensial til å generere komplekse flerlagsvev. Som et konseptbevis er en forenklet og uavklart menneskelig hud som inneholder en dermal (stromal) og et epidermalt (epitel) rom blitt modellert. For å oppnå dette har en allsidig og robust, vinylbasert enhet delt inn i to kamre blitt utviklet, og overvinner noen av ulempene som er tilstede i mikrofluidiske enheter basert på polydimetylsiloksan (PDMS) for biomedisinske applikasjoner, for eksempel bruk av dyrt og spesialisert utstyr eller absorpsjon av små, hydrofobe molekyler og proteiner. Videre ble det utviklet en ny metode basert på parallell strømning, noe som muliggjør in situ-avsetning av både dermale og epidermale rom. Hudkonstruksjonen består av en fibrinmatrise som inneholder menneskelige primære fibroblaster og en monolayer av udødeliggjorte keratinocytter frøet på toppen, som senere opprettholdes under dynamiske kulturforhold. Denne nye mikrofluidiske plattformen åpner muligheten for å modellere menneskelige hudsykdommer og ekstrapolere metoden for å generere andre komplekse vev.

Den designede brikken består av to fluidiske kamre skilt av en PC-membran på 5 μm porestørrelse som tillater veksten av cellen ved å tillate passasje av vekstfremmende molekyler fra det nedre kammeret. Det øvre kammeret holder vevskonstruksjonen, i dette tilfellet en monolayer av hKCer på en fibrin hydrogel som inneholder hGB-er.
Kanalens høyde bestemmes av antall limplater som legges til hver kanal. Det nedre kammeret består av 4 lag (380 μm) og det øvre av 10 ensidige tapelag og e...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform at JoVE.com

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

Her presenterer vi en protokoll for å generere en tredimensjonal forenklet og uavklart hudmodell ved hjelp av en mikromaskinert mikrofluidisk plattform. En parallell strømningstilnærming tillater in situ-avsetning av et dermalt rom for såing av epitelceller på toppen, alt kontrollert av sprøytepumper.

Generering av en forenklet tredimensjonal hud-på-en-chip-modell i en mikromaskin mikrofluidisk plattform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Dette er en ny, litografifri protokoll for modellering av en 3D-skin-on-chip ved hjelp av mikromaskinerte, selvklebende vinyllag og en parallellstrømningsmetodikk for dermal romgenerering. Mikromachined vinyl gir mer enkelhet i fabrikasjonsprosessen og allsidigheten i utformingen av enheten, overvinne noen av begrensningene i PDMS og tradisjonelle litografi tilnærminger. Denne flerlags hud-på-en-chip kan brukes til narkotika og kosmetisk testing tilnærminger, siden det tillater høy gjennomstrømning screening til lavere kostnader og kan brukes til å modellere flere sykdommer.Begynn med å designe en mikrofluidisk brikke ved hjelp av Brother Canvas Workspace-programvare. Opprett et arbeidsområde på 30 x 30 centimeter, og fyll det med designmønstrene for de forskjellige lagene på brikken før du lagrer det i en SVG-fil. Klipp de 30 x 30 centimeter vinylplatene.Hold den til en lav-tack limmatte og eliminere alle luftbobler etter behov. Bruk en USB-stasjon til å laste opp SVG-filen til kantplotteren, og angi skjæreparametrene som skjæretrykk på nivå null, skjæreblad på nivå tre og nivå én for skjærehastigheten. Når parametrene er satt, plasser limmatten med vinylen i plotteren og start prosessen med å kutte kanalmønstrene på 95-mikrometer tykk vinyl.Monter hele enheten ved hjelp av en justeringsenhet for riktige justeringskanaler, innløp og uttak. Stable opp for vinyllag med en tilsvarende mikromaskindesign for montering av den nedre kanalen, og hold dekselbåndet på bunnlaget for å unngå å holde seg til justeringen. Klipp og legg polykarbonat porøs membran på toppen av den nedre kanalen uten å dekke innløpene.Tilsett 10 vinyllag med det øvre kammerdesignet og fest et dobbeltsidig tapefinalelag på toppen. Fjern brikken fra justeringsskuffen for å feste den på glasssklie. Plasser et to millimeter tykt PDMS-ark oppå det tosidige vinyllaget.For å sikre at brikken er helt vanntett, legg en vekt på toppen av brikken over natten. På neste dag steriliserer du brikken ved å skylle den med 70% etanol i fem minutter, etterfulgt av en vask med destillert vann. Koble pumpen en og pump to til det øvre kammerinntaket og det øvre kammerinntaket to.Koble pumpe tre til det nedre kammerinntaket, og koble deretter det øvre kammeret og de nedre kammeruttakene til et avfallsbadekar. Koble sprøytene til hvert innløp ved hjelp av PTFE-rør og 18-gauge kontakter i rustfritt stål. Pump PBS med pumpe tre gjennom det nedre kammerinntaket med 50 mikroliter per minutt, og med pumpe to gjennom det øvre kammerinntaket to ved 100 mikroliter per minutt.Last deretter sprøyten med fibrinogen pre-gel, plasser den umiddelbart i pumpe en, og kjør den på 200 mikroliter per minutt. Når forgelen går ut av det øvre kammerutløpet, stopp pumper en og to, så uten å fjerne slangen, la brikken stå på 37 grader Celsius i 10 minutter. Etter gellasjon, blokker den øvre kammerinntaket med en hette, og pump kulturmediet gjennom det øvre kammerinntaket to med pumpe tre ved 50 mikroliter per time over natten.24 timer etter genereringen av dermalrommet, kontroller at humane primære fibroblastceller er spredt i enheten, og innfør deretter fem ganger 10 til 6 HKC per milliliter gjennom den øvre kanalinntaket to ved 40 mikroliter per minutt i ett minutt. For cellevedlegg, plasser brikken over natten ved 37 grader Celsius i en fuktighetsmettet inkubator. Begynn å pumpe friskt kulturmedium med pumpe tre bare gjennom det nedre kammerinntaket med 50 mikroliter per minutt.I den representative analysen vises høyden på hydrogelen langs det øvre kammeret av forsamlingen. En gjennomsnittlig høyde på 550 mikrometer var optimal for gelens funksjon med strømningshastighetene på henholdsvis 100 og 200 mikroliter per minutt for offer PBS og pre-gel. Unnlatelse av å skylle PBS gjennom den nedre kanalen førte til uoverensstemmelser mellom gelens teoretiske høyde og den som ble målt, med en forskjell på 40%Etter 24 timer fra initiering av parallellstrømningsprotokollen ble de menneskelige primære fibroblaster funnet å være vellykket spredt i fibringelen i det øvre kammeret av forsamlingen, Deretter kan grønne fluorescerende protein-uttrykkende HKCer effektivt bli sådd på toppen av hydrogelen.Fjerning av rør uten å holde systemet lukket over natten for å la HKCS sedimentere resulterte i en ikke-ensartet, sammenfallende monolayer av celler. 3D-konfokal analyse av den uifferensierte hudmodellen i mikrofluidisk chip viste tydelig overflaten av hydrogelen som separerte HKCer i toppen fra fibroblast innebygd i bunnen. Den genererte huden kan bli utsatt for luft/væske-grensesnittet for å oppnå en moden og differensiert epidermis, og videre karakteriseres ved hjelp av flere dermale og epidermale markører.Denne teknikken gir mulighet for en raskere og billigere enhetsproduksjon, og generering av flerlags hud ved hjelp av mikrofluidikk, noe som gir en mer realistisk tilnærming for testing av narkotika og kosmetikk.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Planar og tredimensjonale Trykking av Conductive blekk

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator Ved hjelp av en Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Cell klemme som en robust, Microfluidic Intracellulær Levering Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

Undersøke den tredimensjonale flytseparasjonen indusert av en modellvokalfold polypp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generering av en Tredimensjonal Full Tykkelse hudekvivalent og Automated såret

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrikasjon av invertert Kolloidalt Crystal Poly (etylenglykol) Stillas: En Tredimensjonal Cell Culture plattform for Liver Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Fabrikasjon av Tredimensjonal Papirbaserte mikrofluid Enheter for immunologiske

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic Plattform med multiplekset Electronic Detection for Spatial Sporing av partikler

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

En Microfluidic plattform for langsgående Imaging i Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...