Name: generation of a simplified three-dimensional skin-on-a-chip model in a micromachined microfluidic platform
Uploaded: 2021-05-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform at JoVE.com

Agradecemos sinceramente ao Dr. Javier Rodríguez, à Dra. Agradecemos gentilmente as contribuições de Sergio Férnandez, Pedro Herreros e Lara Stolzenburg para este projeto. Agradecimentos especiais à Dra. Por fim, reconhecemos a excelente assistência técnica de Guillermo Vizcaíno e Angélica Corral. Este trabalho contou com o apoio do "Programa de Atividades de I+D entre Grupos de Investigação de la Comunidad de Madrid", Projeto S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Este trabalho também contou com o apoio do "Programa de excelencia", Projeto EPUC3M03, CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGAÇÃO.

1. Projeto de chip e parâmetros de micromaquinção
<ol><li>Projetar as camadas de chip microfluidos com software de design de código aberto FreeCAD; consulte a Tabela 1 para as dimensões dos canais. Inclua quatro orifícios de 2,54 mm de diâmetro no design para usar um alinhador personalizado para uma superposição de camada correta.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Comprimento (μm)</td>
			<td>Largu...

<ol>
	<li>McNamee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tiered+approach+to+the+use+of+alternatives+to+animal+testing+for+the+safety+assessment+of+cosmetics:+Eye+irritation.">A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 54 (2), 197-209 (2009).</li><li>Mathes, S. 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J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow.">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab on a chip. 12, 2165-2174 (2012).</li><li>Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut-on-a-chip+microenvironment+induces+human+intestinal+cells+to+undergo+villus+differentiation.">Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation.</a> Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).</li><li>O'Neill, A. T., Monteiro-Riviere, N. A., Walker, G. 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A motivação para desenvolver esse método foi o desejo de modelar doenças de pele e estudar os efeitos de terapias novas e inovadoras em uma plataforma de alto rendimento. Até o momento, este laboratório produz esses equivalentes dermo-epidérmicos, lançando manualmente ou com a ajuda da tecnologia de bioimpressão 3D - o gel fibrin com fibroblastos em uma placa de inserção de cultura celular e semeadura dos queratinócitos em cima dele. Uma vez que os queratinócitos atingem a confluência, a cultura 3D é expos...

Recentemente, foram feitos avanços no desenvolvimento e produção de modelos in vitro de pele humana para a análise da toxicidade de produtos cosméticos e farmacêuticos1. Pesquisadores de indústrias farmacêuticas e de cuidados com a pele têm usado animais, sendo os camundongos os mais comuns, para testar seus produtos2,3,4,5. No entanto, testar produtos em animais nem sempre é preditivo da resposta em humanos, o que frequentemente leva à falha de drogas ou efeitos adversos em humanos e,consequentemente,a perdas econômicas5,6. O Reino Unido foi o primeiro país que proibiu o uso de animais para testes cosméticos em 1998. Mais tarde, em 2013, a UE proibiu os testes e aprovação de cosméticos em animais (Regulamento de Cosméticos da UE nº 1223/2009)7.
Essa proibição também está sendo considerada por outros países, como no 'The Humane Cosmetics Act' nos EUA8. Além das preocupações éticas, as diferenças anatômicas entre pele animal e humana tornam os testes em animais demorados, caros e muitas vezes ineficazes. Além disso, o tamanho global do mercado de testes toxicológicos in vitro deve atingir US$ 26,98 bilhões até 20259. Por essas razões, é necessário desenvolver novos métodos e alternativas para esses estudos in vitro, como modelos de pele humana bioengenharia, que possibilitam testes para segurança e efeitos tóxicos de cosméticos e drogas sem o uso de animais.
Existem dois tipos diferentes de modelos de pele humana disponíveis comercialmente, in vitro. O primeiro tipo consiste em equivalentes epidérmicos estratificados contendo múltiplas camadas de queratinócitos diferenciadores que são semeados em diferentes materiais. Alguns deles foram aprovados pela Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE) e validados pelo (Centro Europeu para validação de Métodos Alternativos (ECVAM) para testes de corrosão e irritação da pele, como EpiDerm ou SkinEthic10,11,12. O segundo tipo são equivalentes de pele cheia com uma camada de diferenciação de queratinócitos humanos semeados em um andaime tridimensional (3D) que contém fibroblastos, como T-Skin e EpiDerm-FT. No entanto, esses modelos são cultivados sob condições estáticas, o que os torna incapazes de representar com precisão as condições fisiológicas humanas.
O interesse recente tem focado na geração de modelos in vitro de pele 3D em formatos de inserção de cultura celular (CCI) com perfusão dinâmica13,14,15,16,17,18,19. No entanto, esses sistemas não podem ser considerados stricto sensu como microfluidic skin-on-chips, conforme sua definição clássica no campo. A definição de Ingber para órgãos-em-um-chip afirma que o órgão deve ser colocado dentro dos canais microfluidos, condição que apenas alguns dispositivos cumprem20,21. A pele sobre chips modelou até agora epithelia simples como camadas de células únicas e/ou camadas de células dérmicas separadas por uma membrana porosa22,23. Embora tenha havido alguns avanços modelando a pele em sistemas microfluidos16,24, atualmente não há literatura mostrando um sistema órgão-em-um-chip que se encaixe na definição de Ingber, capaz de produzir uma pele multicamadas in situ e incluindo componentes epiteliais e estrânicos.
Neste trabalho, uma nova plataforma microfluida baseada em vinil, econômica e robusta para aplicações de pele em um chip, é apresentada. Esta plataforma foi produzida pela micro-usinagem, que proporciona mais simplicidade no processo de fabricação, além de maior flexibilidade e versatilidade no layout do dispositivo, superando algumas das limitações do PDMS25. Também foi projetada uma maneira de introduzir uma construção de pele simplificada através de um fluxo paralelo controlado com bombas de seringa. O fluxo paralelo permite que dois fluidos com viscosidades muito diferentes (um pré-gel tampão e fibrina neste caso) sejam perfundidos através de um canal sem se misturarem. Como prova de conceito, foi introduzido no dispositivo uma construção dermo-epidérmica contendo fibroblastos embutidos em uma matriz fibrina imitando a derme, além da qual uma monocamada de queratinócitos foi carregada para emular a epiderme indiferenciada. A altura do compartimento dérmico pode ser modulada modificando as taxas de fluxo. A principal novidade deste trabalho, em comparação com os modelos descritos anteriormente22,26,27,28,29, é o desenvolvimento de uma construção 3D dentro de uma microcâmara por meio de microfluidos. Embora este artigo apresente uma pele simplificada e indiferenciada, o objetivo a longo prazo é gerar e caracterizar uma construção de pele totalmente diferenciada para demonstrar sua viabilidade e funcionalidade para fins de testes medicamentosos e cosméticos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amchafibrin</td>
			<td>Rottafarm</td>
			<td></td>
			<td>Tranexamic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic</td>
			<td>Thermo Scientific HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape vynil</td>
			<td>ATP Adhesive Systems</td>
			<td></td>
			<td>GM 107CC, 12 &#181;m thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edge plotter</td>
			<td>Brother</td>
			<td></td>
			<td>Scanncut CM900</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Scientific HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Extracted from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-Human dermal fibroblasts</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Primary. Gift from Dr. Marta Garc&#237;a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2B-GFP-HaCaT cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta Garc&#237;a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/dead kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Merk TM</td>
			<td></td>
			<td>5 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>Sylgard 184</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>10 NIH/vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent adhesive vinyl</td>
			<td>Mactac</td>
			<td></td>
			<td>JT 8500 CG-RT, 95 &#181;m thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td></td>
			<td>Teflon, 1/16&#8221; OD, 0.020&#8221; ID</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a simplified three-dimensional skin-on-a-chip model in a micromachined microfluidic platform

Este trabalho apresenta uma nova plataforma microfluida, econômica e confiável, com potencial para gerar tecidos multicamadas complexos. Como prova de conceito, foi modelado um compartimento humano simplificado e indiferenciado contendo um compartimento dérmico (estrommal) e um compartimento epidélico (epitelial). Para isso, foi desenvolvido um dispositivo versátil e robusto, à base de vinil, dividido em duas câmaras, superando algumas das desvantagens presentes em dispositivos microfluidos à base de polidimtilsiloxano (PDMS) para aplicações biomédicas, como o uso de equipamentos caros e especializados ou a absorção de pequenas moléculas hidrofóbicas e proteínas. Além disso, foi desenvolvido um novo método baseado no fluxo paralelo, possibilitando a deposição in situ dos compartimentos dérmico e epidérmico. A construção da pele consiste em uma matriz fibrina contendo fibroblastos primários humanos e uma monocamada de queratinócitos imortalizados semeados no topo, que é posteriormente mantido sob condições dinâmicas de cultura. Essa nova plataforma microfluidica abre a possibilidade de modelar doenças de pele humanas e extrapolar o método para gerar outros tecidos complexos.

O chip projetado é composto por duas câmaras fluidas separadas por uma membrana pc de tamanho de poros de 5 μm que permite o crescimento da célula, permitindo a passagem de moléculas promotoras de crescimento da câmara inferior. A câmara superior contém a construção tecidual, neste caso, uma monocamadas de hKCs em um hidrogel fibrina contendo hFBs.
A altura dos canais é determinada pelo número de folhas adesivas adicionadas a cada canal. A câmara inferior é composta por 4 camadas...

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Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um modelo de pele simplificado e indiferenciado tridimensional usando uma plataforma microfluida micromaquinda. Uma abordagem de fluxo paralelo permite a deposição in situ de um compartimento dérmico para a semeadura de células epiteliais em cima, todas controladas por bombas de seringa.

Geração de um modelo simplificado de pele em um chip tridimensional em uma plataforma microfluida micromaquinda

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Este é um novo protocolo, livre de litografia para modelar um skin-on-chip 3D usando camadas de vinil micromachined, adesivo e uma metodologia de fluxo paralelo para a geração de compartimentos dérmicos. O vinil micromaquinado proporciona mais simplicidade no processo de fabricação e versatilidade no layout do dispositivo, superando algumas das limitações do PDMS e das abordagens tradicionais de litografia. Este skin-on-a-chip multicamadas pode ser usado para abordagens de testes medicamentosos e cosméticos, uma vez que permite a triagem de alto rendimento a custos mais baixos e poderia ser usado para modelar várias doenças.Comece projetando um chip microfluido usando o software Brother Canvas Workspace. Crie um espaço de trabalho de 30 por 30 centímetros e preencha-o com os padrões de design para as diferentes camadas do chip antes de armazená-lo em um arquivo svg. Corte as folhas de vinil de 30 por 30 centímetros.Coloque-o em um tapete adesivo de baixa aderência e elimine todas as bolhas de ar, conforme necessário. Usando uma unidade USB, carregue o arquivo svg para o plotter de borda, e defina os parâmetros de corte como pressão de corte no nível zero, lâmina de corte no nível três e nível um para a velocidade de corte. Quando os parâmetros forem definidos, coloque o tapete adesivo com o vinil no plotador e inicie o processo de corte dos padrões do canal em vinil de 95 micrômetros de espessura.Monte todo o dispositivo usando um alinhador para canais de ajuste adequados, entradas e tomadas. Empilhe camadas de vinil com um design de micrometralhadora correspondente para a montagem do canal inferior, mantendo a fita de cobertura da camada inferior para evitar grudar no alinhador. Corte e coloque a membrana porosa de policarbonato em cima do canal inferior sem cobrir as entradas.Adicione 10 camadas de vinil com o design da câmara superior e coloque uma camada final de fita de dois lados na parte superior. Remova o chip do alinhador para enfiá-lo na lâmina de vidro. Coloque uma folha PDMS de dois milímetros de espessura em cima da camada de vinil de fita dupla face.Para garantir que o chip esteja completamente impermeável, deixe um peso em cima do chip durante a noite. No dia seguinte, esterilize o chip lavando-o com 70% de etanol por cinco minutos, seguido de uma lavagem com água destilada. Conecte a bomba um e bombeie dois para a entrada da câmara superior um e a entrada da câmara superior dois, respectivamente.Conecte a bomba três à entrada da câmara inferior e, em seguida, conecte a câmara superior e as saídas de câmara inferior a uma banheira de resíduos. Conecte as seringas a cada entrada usando tubos PTFE e conectores de aço inoxidável de 18 calibres. Bombeie PBS com bomba três através da entrada da câmara inferior a 50 microliters por minuto, e com bomba dois através da entrada da câmara superior dois a 100 microliters por minuto.Em seguida, carregue a seringa com o pré-gel de fibrinogênio, coloque-a imediatamente na bomba um e execute-a a 200 microliters por minuto. Uma vez que o pré-gel saia da saída da câmara superior, pare as bombas um e dois, em seguida, sem remover o tubo, deixe o chip para permitir a gelagem a 37 graus Celsius por 10 minutos. Após a gelagem, bloqueie a entrada da câmara superior com uma tampa, e bombeie o meio de cultura através da entrada da câmara superior dois com bomba três a 50 microliters por hora durante a noite.24 horas após a geração do compartimento dérmico, verifique se as células do fibroblasto primário humano estão espalhadas no conjunto, em seguida, introduza cinco vezes 10 para os 6 HKCs por mililitro através da entrada do canal superior dois a 40 microliters por minuto por um minuto. Para fixação celular, coloque o chip durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora saturada de umidade. Comece a bombear meio de cultura fresco com bomba três apenas através da entrada da câmara inferior a 50 microliters por minuto.Na análise representativa, é exibida a altura do hidrogel ao longo da câmara superior da montagem. Uma altura média de 550 micrômetros foi ótima para o funcionamento do gel nas taxas de fluxo de 100 e 200 microliters por minuto para o PBS sacrificial e o pré-gel, respectivamente. A não descarga do PBS pelo canal inferior levou a discrepâncias entre a altura teórica do gel e a medida, com uma diferença de 40%Após 24 horas do início do protocolo de fluxo paralelo, os fibroblastos primários humanos foram encontrados para serem espalhados com sucesso no gel de fibrina na câmara superior da montagem, após o qual, os HKCs fluorescentes verdes expressos de proteína poderiam ser efetivamente semeados em cima do hidrogel.A remoção da tubulação sem manter o sistema fechado durante a noite para permitir que o HKCS sedimente resultou em uma monocamada não uniforme e confluente de células. A análise confocal 3D do modelo de pele indiferenciado no chip microfluido mostrou claramente a superfície do hidrogel que separa os HKCs na parte superior do fibroblasto embutido na parte inferior. A pele gerada poderia ser exposta à interface ar/líquido para obter uma epiderme madura e diferenciada, e ainda ser caracterizada usando vários marcadores dérmicos e epidérmicos.Esta técnica permite uma fabricação de dispositivos mais rápida e mais barata, e a geração de pele multicamadas usando microfluidos, proporcionando uma abordagem mais realista para testes de drogas e cosméticos.

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