Name: generation of a simplified three-dimensional skin-on-a-chip model in a micromachined microfluidic platform
Uploaded: 2021-05-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform at JoVE.com

Мы искренне благодарим д-ра Хавьера Родригеса, д-ра Марию Луизу Лопес, Карлоса Мателлана и Хуана Франсиско Родригеса за очень полезные предложения, обсуждения и/или предварительные данные. Мы также благодарим Серхио Фернандеса, Педро Эррероса и Лару Штольценбург за вклад в этот проект. Особая благодарность доктору Марте Гарсия за HFB и hKCs с маркировкой GFP. Наконец, мы отмечаем прекрасную техническую помощь Гильермо Вискаино и Анжелики Корраль. Эта работа была поддержана «Программой деятельности I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid», проект S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Эта работа была также поддержана "Программой превосходства", проектом EPUC3M03, CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.

1. Конструкция чипа и параметры микрообработки
<ol><li>Проектирование микрофлюидных слоев чипа с помощью программного обеспечения для проектирования с открытым исходным кодом FreeCAD; размеры каналов приведены в таблице 1. Включите в конструкцию четыре отверстия диаметром 2,54 мм, ч?...

<ol>
	<li>McNamee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tiered+approach+to+the+use+of+alternatives+to+animal+testing+for+the+safety+assessment+of+cosmetics:+Eye+irritation.">A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 54 (2), 197-209 (2009).</li><li>Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+skin+models+in+drug+development.">The use of skin models in drug development.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 81-102 (2014).</li><li>Abd, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+models+for+the+testing+of+transdermal+drugs.">Skin models for the testing of transdermal drugs.</a> Clinical Pharmacology: Advances and Applications. 8, 163-176 (2016).</li><li>Flaten, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+skin+models+as+a+tool+in+optimization+of+drug+formulation.">In vitro skin models as a tool in optimization of drug formulation.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 75, 10-24 (2015).</li><li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+skin+disease+for+drug+discovery.">Animal models of skin disease for drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 8 (3), 331-355 (2014).</li><li>Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lost+in+translation:+animal+models+and+clinical+trials+in+cancer+treatment.">Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment.</a> American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).</li><li>Pronko, P. P., VanRompay, P. A., Zhang, Z., Nees, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pronko+et+al.+Reply.">Pronko et al. Reply.</a> Physical Review Letters. 86 (7-12), 1387 (2001).</li><li>H.R.2858 - Humane Cosmetics Act. 114th Congress Available from: <a target="_blank" href="https://congress.gov/bill/114th-congress/house-bill/2858">https://congress.gov/bill/114th-congress/house-bill/2858</a> (2016)</li><li>. Global in-vitro toxicology testing market report: size, share &amp; trends analysis 2014-2015 Available from: <a target="_blank" href="https://www.prnewswire.com/news-releases/global-in-vitro-toxicology-testing-market-report-size-share--trends-analysis-2014-2025-300704958.html">https://www.prnewswire.com/news-releases/global-in-vitro-toxicology-testing-market-report-size-share--trends-analysis-2014-2025-300704958.html</a> (2018)</li><li>Zhang, Z., Michniak-Kohn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineered+human+skin+equivalents.">Tissue engineered human skin equivalents.</a> Pharmaceutics. 4 (1), 26-41 (2012).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+skin+corrosion:+reconstructed+human+epidermis+(RhE)+test+method.+Test+Guideline+No.431.">In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RhE) test method. Test Guideline No.431.</a> OECD Guideline for Testing of Chemicals. , (2019).</li><li>Almeida, A., Sarmento, B., Rodrigues, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+in+vitro+models+for+safety+and+toxicity+assessment+of+cosmetic+ingredients.">Insights on in vitro models for safety and toxicity assessment of cosmetic ingredients.</a> International Journal of Pharmaceutics. 519 (1-2), 178-185 (2017).</li><li>vanden Broek, L. J., Bergers, L. I. J. C., Reijnders, C. M. A., Gibbs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+future+Prospectives+in+Skin-on-Chip+Development+with+Emphasis+on+the+use+of+Different+Cell+Types+and+Technical+Challenges.">Progress and future Prospectives in Skin-on-Chip Development with Emphasis on the use of Different Cell Types and Technical Challenges.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 13 (3), 418-429 (2017).</li><li>Ata&#231;, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+on-a-chip:+In+vitro+skin+models+versus+ex+vivo+tissue+maintenance+with+dynamic+perfusion.">Skin and hair on-a-chip: In vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion.</a> Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).</li><li>Abaci, H. E., Gledhill, K., Guo, Z., Christiano, A. M., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pumpless+microfluidic+platform+for+drug+testing+on+human+skin+equivalents.">Pumpless microfluidic platform for drug testing on human skin equivalents.</a> Lab on a Chip. 15 (3), 882-888 (2015).</li><li>Wu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-thickness+human+skin-on-chip+with+enhanced+epidermal+morphogenesis+and+barrier+function.">Full-thickness human skin-on-chip with enhanced epidermal morphogenesis and barrier function.</a> Materials Today. 21 (4), 326-340 (2017).</li><li>Materne, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multi-organ+chip+-+a+microfluidic+platform+for+long-term+multi-tissue+coculture.">The multi-organ chip - a microfluidic platform for long-term multi-tissue coculture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52526 (2015).</li><li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+of+a+full-thickness+skin+equivalent+in+a+96-well+insert+format+for+substance+permeation+studies+and+organ-on-a-chip+applications.">Bioengineering of a full-thickness skin equivalent in a 96-well insert format for substance permeation studies and organ-on-a-chip applications.</a> Bioengineering. 5 (2), 43 (2018).</li><li>Alberti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-chamber+microfluidic+platform+for+high-precision+skin+permeation+testing.">Multi-chamber microfluidic platform for high-precision skin permeation testing.</a> Lab on a Chip. 17, 1625-1634 (2017).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature BIotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li><li>Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+3D+cell+culture+to+organs-on-chips.">From 3D cell culture to organs-on-chips.</a> Trends in Cell Biology. 21 (12), 745-754 (2011).</li><li>Wufuer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-on-a-chip+model+simulating+inflammation,+edema+and+drug-based+treatment.">Skin-on-a-chip model simulating inflammation, edema and drug-based treatment.</a> Scientific Reports. 6, 37471 (2016).</li><li>Ramadana, Q., Ting, F. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micro-physiological+immune-competent+model+of+the+human+skin.">In vitro micro-physiological immune-competent model of the human skin.</a> Lab on a Chip. 16, 1899-1908 (2016).</li><li>Kim, K., Jeon, H. M., Choi, K. C., Sung, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+effectiveness+of+Curcuma+longa+leaf+extract+on+a+skin+equivalent+using+a+pumpless+skin-on-a-chip+model.">Testing the effectiveness of Curcuma longa leaf extract on a skin equivalent using a pumpless skin-on-a-chip model.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3898 (2020).</li><li>Halldorsson, S., Lucumi, E., G&#243;mez-Sj&#246;berg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices.">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li><li>Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+disease+model+of+drug+toxicity+-+induced+pulmonary+edema+in+a+lung-on-a-chip+microdevice.">A human disease model of drug toxicity - induced pulmonary edema in a lung-on-a-chip microdevice.</a> Scientific Translational Medicine. 4 (159), (2012).</li><li>Beckwitt, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+'+organ+on+a+chip+'.">Liver ' organ on a chip '.</a> Experimental Cell Research. 363 (1), 15-25 (2018).</li><li>Poceviciute, R., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-gut-microbiome+on+a+chip.">Human-gut-microbiome on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 500-501 (2019).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).</li><li>Esc&#225;mez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+optimal+virus-mediated+growth+factor+gene+delivery+for+human+cutaneous+wound+healing+enhancement.">Assessment of optimal virus-mediated growth factor gene delivery for human cutaneous wound healing enhancement.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128 (6), 1565-1575 (2008).</li><li>Llames, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+plasma+as+a+dermal+scaffold+for+the+generation+of+a+completely+autologous+bioengineered+skin.">Human plasma as a dermal scaffold for the generation of a completely autologous bioengineered skin.</a> Transplantation. 77 (3), 350-355 (2004).</li><li>Llames, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+results+of+an+autologous+engineered+skin.">Clinical results of an autologous engineered skin.</a> Cell Tissue Bank. 7 (1), 47-53 (2006).</li><li>Cubo, N., Garcia, M., del Ca&#241;izo, J. F., Velasco, D., Jorcano, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+functional+human+skin:+production+and+in+vivo+analysis.">3D bioprinting of functional human skin: production and in vivo analysis.</a> Biofabrication. 9 (1), 015006 (2016).</li><li>Mori, N., Morimoto, Y., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+integrated+with+perfusable+vascular+channels+on+a+chip.">Skin integrated with perfusable vascular channels on a chip.</a> Biomaterials. 116, 48-56 (2017).</li><li>Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+microbiome+and+mechanical+deformation+to+intestinal+bacterial+overgrowth+and+inflammation+in+a+human+gut-on-a-chip.">Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 7-15 (2016).</li><li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidics-based+in+vitro+model+of+the+gastrointestinal+human-microbe+interface.">A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface.</a> Nature Communications. 7, 11535 (2016).</li><li>Marx, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-on-a-chip'+developments:+A+translational+cuttingedge+alternative+to+systemic+safety+assessment+and+efficiency+evaluation+of+substances+in+laboratory+animals+and+man.">Human-on-a-chip' developments: A translational cuttingedge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 40 (5), 235-257 (2012).</li><li>Bein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organ-on-a-chip+models+of+human+intestine.">Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).</li><li>Bennet, D., Estlack, Z., Reid, T., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microengineered+human+corneal+epithelium-on-a-chip+for+eye+drops+mass+transport+evaluation.">A microengineered human corneal epithelium-on-a-chip for eye drops mass transport evaluation.</a> Lab on a Chip. 18, 1539-1551 (2018).</li><li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow.">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab on a chip. 12, 2165-2174 (2012).</li><li>Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut-on-a-chip+microenvironment+induces+human+intestinal+cells+to+undergo+villus+differentiation.">Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation.</a> Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).</li><li>O'Neill, A. T., Monteiro-Riviere, N. A., Walker, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microfluidic+human+epidermal+keratinocyte+culture.">Characterization of microfluidic human epidermal keratinocyte culture.</a> Cytotechnology. 56 (3), 197-207 (2008).</li><li>Ren, K., Chen, Y., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+materials+for+microfluidics+in+biology.">New materials for microfluidics in biology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 25, 78-85 (2014).</li></ol>

Мотивацией для разработки этого метода было желание моделировать кожные заболевания и изучать эффекты новых и инновационных методов лечения на высокопроизводительной платформе. На сегодняшний день эта лаборатория производит эти дермо-эпидермальные эквиваленты путем литья — вручну...

В последнее время были достигнуты успехи в разработке и производстве моделей кожи человека in vitro для анализа токсичности косметических и фармацевтических продуктов1. Исследователи в фармацевтической и коже промышленности используют животных, мышей которых мышей являются наиболее распространенными, для тестирования своих продуктов2,3,4,5. Однако тестирование продуктов на животных не всегда предсказывает реакцию у людей, что часто приводит к отказу лекарств или неблагоприятным последствиям у людей и, следовательно, к экономическим потерям5,6. Великобритания была первой страной, которая запретила использование животных для косметического тестирования в 1998 году. Позже, в 2013 году, ЕС запретил тестирование и апробацию косметики на животных (Регламент ЕС по косметике No 1223/2009)7.
Этот запрет также рассматривается другими странами, такими как «Закон о гуманистической косметике» в США8. В дополнение к этическим соображениям, анатомические различия между кожей животных и человека делают тестирование на животных трудоемким, дорогостоящим и часто неэффективным. Кроме того, ожидается, что к 2025 году объем мирового рынка токсикологических испытаний in vitro достигнет 26,98 млрд долларовСША9. По этим причинам существует необходимость в разработке новых методов и альтернатив для этих исследований in vitro, таких как биоинженерные модели кожи человека, которые позволяют тестировать безопасность и токсическое воздействие косметики и лекарств без использования животных.
Существует два различных вида коммерчески доступных, in vitro, моделей человеческой кожи. Первый тип состоит из стратифицированных эпидермальных эквивалентов, содержащих несколько слоев дифференцирующих кератиноцитов, которые высеиваются на разных материалах. Некоторые из них были одобрены Организацией экономического сотрудничества и развития (ОЭСР) и одобрены (Европейским центром валидации альтернативных методов (ECVAM) для тестирования на коррозию и раздражение кожи, таких как EpiDerm или SkinEthic10,11,12. Второй тип представляют собой полнокожные эквиваленты со слоем дифференцированных кератиноцитов человека, посеянных на трехмерном (3D) каркасе, который содержит фибробласты, такие как T-Skin и EpiDerm-FT. Однако эти модели культивируются в статических условиях, что делает их неспособными точно представлять физиологические условия человека.
Недавний интерес был сосредоточен на создании in vitro 3D-моделей кожи в форматах клеточной культуры-вставки (CCI) с динамической перфузией13,14,15,16,17,18,19. Тем не менее, эти системы не могут рассматриваться stricto sensu как микрофлюидные «кожа на чипах» в соответствии с их классическим определением в этой области. Определение Ингбера для органов на чипе гласит, что орган должен быть помещен внутрь микрофлюидных каналов, что является условием, что только несколько устройств удовлетворяют20,21. Skin-on-chips до сих пор моделировали в основном простой эпителий в виде одноклеточных слоев и/или слоев кожных клеток, разделенных пористой мембраной22,23. Хотя были достигнуты некоторые успехи в моделировании кожи в микрофлюидных системах16,24,в настоящее время нет литературы, показывающей систему «орган на чипе», которая соответствует определению Ингбера, способная производить многослойную кожу in situ и включающая как эпителиальные, так и стромальные компоненты.
В этой работе представлена новая, экономичная, надежная микрофлюидная платформа на основе винила для приложений «кожа на чипе». Данная платформа была изготовлена путем микрообработки, что обеспечивает большую простоту в процессе изготовления, а также повышенную гибкость и универсальность в компоновке устройства, преодолевая некоторые ограничения PDMS25. Также был разработан способ введения упрощенной конструкции обшивки через параллельный поток, управляемый шприцевыми насосами. Параллельный поток позволяет двум жидкостям с очень разной вязкостью (в данном случае буферу и прегелю фибрина) перфузиться через канал без смешивания друг с другом. В качестве доказательства концепции в устройство была введена дермо-эпидермальная конструкция, содержащая фибробласты, встроенные в фибриновую матрицу, имитируя дерму, поверх которой был загружен монослой кератиноцитов для эмуляции недифференцированного эпидермиса. Высота кожного отсека может модулироваться путем изменения скорости потока. Главной новинкой этой работы, по сравнению с ранее описанными моделями22,26,27,28,29,является разработка 3D-конструкции внутри микрокамеры с помощью микрофлюидики. Хотя в этой статье представлена упрощенная недифференцированная кожа, долгосрочная цель состоит в том, чтобы создать и охарактеризовать полностью дифференцированную конструкцию кожи, чтобы продемонстрировать ее жизнеспособность и функциональность для целей лекарственного и косметического тестирования.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amchafibrin</td>
			<td>Rottafarm</td>
			<td></td>
			<td>Tranexamic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic</td>
			<td>Thermo Scientific HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape vynil</td>
			<td>ATP Adhesive Systems</td>
			<td></td>
			<td>GM 107CC, 12 &#181;m thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edge plotter</td>
			<td>Brother</td>
			<td></td>
			<td>Scanncut CM900</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Scientific HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Extracted from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-Human dermal fibroblasts</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Primary. Gift from Dr. Marta Garc&#237;a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2B-GFP-HaCaT cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta Garc&#237;a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/dead kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Merk TM</td>
			<td></td>
			<td>5 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>Sylgard 184</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>10 NIH/vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent adhesive vinyl</td>
			<td>Mactac</td>
			<td></td>
			<td>JT 8500 CG-RT, 95 &#181;m thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td></td>
			<td>Teflon, 1/16&#8221; OD, 0.020&#8221; ID</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a simplified three-dimensional skin-on-a-chip model in a micromachined microfluidic platform

Эта работа представляет собой новую, экономически эффективную и надежную микрофлюидную платформу с потенциалом для создания сложных многослойных тканей. В качестве доказательства концепции была смоделирована упрощенная и недифференцированная кожа человека, содержащая дермальный (стромальный) и эпидермальный (эпителиальный) компартмент. Для достижения этой цели было разработано универсальное и надежное устройство на основе винила, разделенное на две камеры, преодолевающее некоторые недостатки, присутствующие в микрофлюидных устройствах на основе полидиметилсилоксана (PDMS) для биомедицинских применений, таких как использование дорогостоящего и специализированного оборудования или поглощение небольших гидрофобных молекул и белков. Кроме того, был разработан новый метод, основанный на параллельном потоке, позволяющий осуществлять осаждение in situ как кожного, так и эпидермального компартментов. Конструкция кожи состоит из фибриновой матрицы, содержащей первичные фибробласты человека и монослой из увековеченных кератиноцитов, посеянных сверху, который впоследствии поддерживается в условиях динамической культивации. Эта новая микрофлюидная платформа открывает возможность моделировать кожные заболевания человека и экстраполировать метод для генерации других сложных тканей.

Спроектированный чип состоит из двух жидкостных камер, разделенных мембраной PC размером пор 5 мкм, которая позволяет расти клетке, позволяя проходить молекулам, способствующим росту, из нижней камеры. Верхняя камера удерживает тканевую конструкцию, в данном случае монослой гКЦ на гидр?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform at JoVE.com

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

Здесь мы представляем протокол для создания трехмерной упрощенной и недифференцированной модели кожи с использованием микрообрабатываемой микрофлюидной платформы. Параллельный поточный подход позволяет наживать in situ кожный компартмент для посева эпителиальных клеток сверху, управляемых шприцевыми насосами.

Создание упрощенной трехмерной модели «кожа на чипе» на микрообрабатываемой микрофлюидной платформе

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Это новый протокол без литографии для моделирования 3D-кожи на чипе с использованием микрообрабатываемых, клейких виниловых слоев и методологии параллельного потока для генерации дермального компартмента. Микрообработанный винил обеспечивает большую простоту в процессе изготовления и универсальность в компоновке устройства, преодолевая некоторые ограничения PDMS и традиционных подходов к литографии. Эта многослойная кожа на чипе может быть использована для лекарственных и косметических подходов к тестированию, поскольку она позволяет проводить высокопроизводительный скрининг при меньших затратах и может быть использована для моделирования нескольких заболеваний.Начните с разработки микрофлюидного чипа с помощью программного обеспечения Brother Canvas Workspace. Создайте рабочее пространство размером 30 на 30 сантиметров и заполните его шаблонами проектирования для различных слоев чипа, прежде чем хранить его в файле svg. Вырежьте виниловые листы 30 на 30 сантиметров.Приклейте его к низкоклему клейкому коврику и при необходимости удалите все пузырьки воздуха. Используя USB-накопитель, загрузите файл svg в плоттер кромки и установите параметры резания: давление резания на нулевом уровне, режущее лезвие на третьем уровне и первый уровень для скорости резания. Когда параметры будут установлены, поместите клеевой коврик с винилом в плоттер и начните процесс резки узоров канала на виниле толщиной 95 микрометров.Соберите все устройство с помощью элайнера для правильной регулировки каналов, входов и розеток. Нагромождение для виниловых слоев с соответствующей конструкцией микромашины для сборки нижнего канала, сохраняя ленту крышки нижнего слоя, чтобы избежать прилипания к элайнеру. Вырежьте и поместите поликарбонатную пористую мембрану поверх нижнего канала, не закрывая входы.Добавьте 10 виниловых слоев с конструкцией верхней камеры и наклейте сверху двусторонний конечный слой ленты. Извлеките чип из элайнера, чтобы наклеить его на стеклянную горку. Поместите лист PDMS толщиной в два миллиметра поверх двустороннего винилового слоя ленты.Чтобы убедиться, что чип полностью водонепроницаем, оставьте вес поверх чипа на ночь. На следующий день стерилизуйте чипс, промыв его 70% этанолом в течение пяти минут, после чего промывку дистиллированной водой. Подключите насос один и насос два к верхнему входу камеры один и верхнему входу камеры два, соответственно.Подключите третий насос к входу в нижнюю камеру, затем подключите верхнюю камеру и выходы нижней камеры к отработанной ванне. Подключите шприцы к каждому входу с помощью трубок из PTFE и разъемов из нержавеющей стали 18 калибра. Насос PBS с насосом три через вход в нижнюю камеру со скоростью 50 микролитров в минуту, а с насосом два через входную верхнюю камеру два со скоростью 100 микролитров в минуту.Затем загрузите шприц предварительным гелем фибриногена, сразу же поместите его в насос и запустите его со скоростью 200 микролитров в минуту. Как только предварительный гель выйдет из верхней камеры, остановите насосы один и два, затем, не снимая трубку, оставьте чип, чтобы обеспечить гелляцию при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут. После геллации заблокируйте верхний вход камеры крышкой и прокачайте культурную среду через входную в верхнюю камеру два с помощью насоса три со скоростью 50 микролитров в час в течение ночи.Через 24 часа после генерации кожного компартмента проверьте, что клетки первичных фибробластов человека распределены в сборке, затем введите пять раз по 10 до 6 ГКК на миллилитр через верхний входной канал два со скоростью 40 микролитров в минуту в течение одной минуты. Для прикрепления клеток поместите чип на ночь при температуре 37 градусов цельсия в инкубаторе, насыщенном влажностью. Начинайте перекачивание свежей питательной среды с помощью насоса три только через вход в нижнюю камеру со скоростью 50 микролитров в минуту.В репрезентативном анализе отображается высота гидрогеля вдоль верхней камеры сборки. Средняя высота 550 микрометров была оптимальной для функционирования геля при скорости потока 100 и 200 микролитров в минуту для жертвенного PBS и пре-геля соответственно. Неспособность промыть PBS через нижний канал привела к расхождениям между теоретической высотой геля и измеренной, с разницей в 40% Через 24 часа от начала протокола параллельного потока было обнаружено, что первичные фибробласты человека успешно распространяются в фибриновом геле в верхней камере сборки, после чего зеленые флуоресцентные белково-экспрессивные ГКК могут быть эффективно посеяны поверх гидрогеля.Удаление трубки без удержания системы закрытой в течение ночи, чтобы позволить HKCS отстойнику, привело к неоднородному, сливательному монослою клеток. 3D-конфокальный анализ недифференцированной модели кожи в микрофлюидном чипе ясно показал поверхность гидрогеля, отделяющего ГКК в верхней части от фибробласта, встроенного внизу. Сгенерированная кожа может подвергаться воздействию воздушно-жидкого интерфейса для получения зрелого и дифференцированного эпидермиса и далее характеризоваться с использованием нескольких кожных и эпидермальных маркеров.Этот метод позволяет быстрее и дешевле изготовить устройства, а также создать многослойную кожу с использованием микрофлюидики, обеспечивая более реалистичный подход к тестированию лекарств и косметики.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Трехмерная оптическая разрешением Фотоакустическая микроскопии

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Плоские и трехмерной печати проводящей краски

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Высокая пропускная способность экспрессии белков генератора с использованием платформы Микрофлюидных

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Сотовый Сжатие как Robust, микрофлюидных внутриклеточного Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

Исследование трехмерного разделения потока, вызванного моделью Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Генерация трехмерной всю толщину кожи Эквивалент техники и автоматизированных Ранение

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Изготовление Перевернутый коллоидный кристалл поли (этиленгликоль) строительные леса: трехмерная Cell Culture платформа для печени тканевой инженерии

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Изготовление Трехмерная бумаги на основе микрожидком Устройства для иммуноанализа

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Микрожидкостных Платформа с уплотненными электронным детектором для пространственного слежения частиц

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

Microfluidic платформа для продольной Imaging в Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...