Name: generation of a simplified three-dimensional skin-on-a-chip model in a micromachined microfluidic platform
Uploaded: 2021-05-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform at JoVE.com

Vi tackar verkligen Dr. Javier Rodríguez, Dr. María Luisa López, Carlos Matellán och Juan Francisco Rodríguez för mycket användbara förslag, diskussioner och / eller preliminära data. Vi tackar också Sergio Férnandez, Pedro Herreros och Lara Stolzenburgs bidrag till detta projekt. Särskilt tack till Dr. Marta García för GFP-märkta hFBs och hKCs. Slutligen erkänner vi guillermo Vizcaínos och Angélica Corrals utmärkta tekniska hjälp. Detta arbete stöddes av "Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid", Project S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Detta arbete stöddes också av "Programa de excelencia", Project EPUC3M03, CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.

1. Parametrar för spåndesign och mikrotillverkning
<ol><li>Designa de mikrofluidiska spånskikten med FreeCAD öppen källkodsdesignprogramvara; se tabell 1 för kanalernas dimensioner. Inkludera fyra hål med diametern 2,54 mm i designen för att använda en skräddarsydd aligner för en korrekt lager superposition.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Längd (μm)</td>
			<td>Bredd (μm)</td>
		</tr>
<tr>
<...

<ol>
	<li>McNamee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tiered+approach+to+the+use+of+alternatives+to+animal+testing+for+the+safety+assessment+of+cosmetics:+Eye+irritation.">A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 54 (2), 197-209 (2009).</li><li>Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+skin+models+in+drug+development.">The use of skin models in drug development.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 81-102 (2014).</li><li>Abd, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+models+for+the+testing+of+transdermal+drugs.">Skin models for the testing of transdermal drugs.</a> Clinical Pharmacology: Advances and Applications. 8, 163-176 (2016).</li><li>Flaten, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+skin+models+as+a+tool+in+optimization+of+drug+formulation.">In vitro skin models as a tool in optimization of drug formulation.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 75, 10-24 (2015).</li><li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+skin+disease+for+drug+discovery.">Animal models of skin disease for drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 8 (3), 331-355 (2014).</li><li>Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lost+in+translation:+animal+models+and+clinical+trials+in+cancer+treatment.">Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment.</a> American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).</li><li>Pronko, P. P., VanRompay, P. A., Zhang, Z., Nees, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pronko+et+al.+Reply.">Pronko et al. Reply.</a> Physical Review Letters. 86 (7-12), 1387 (2001).</li><li>H.R.2858 - Humane Cosmetics Act. 114th Congress Available from: <a target="_blank" href="https://congress.gov/bill/114th-congress/house-bill/2858">https://congress.gov/bill/114th-congress/house-bill/2858</a> (2016)</li><li>. Global in-vitro toxicology testing market report: size, share &amp; trends analysis 2014-2015 Available from: <a target="_blank" href="https://www.prnewswire.com/news-releases/global-in-vitro-toxicology-testing-market-report-size-share--trends-analysis-2014-2025-300704958.html">https://www.prnewswire.com/news-releases/global-in-vitro-toxicology-testing-market-report-size-share--trends-analysis-2014-2025-300704958.html</a> (2018)</li><li>Zhang, Z., Michniak-Kohn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineered+human+skin+equivalents.">Tissue engineered human skin equivalents.</a> Pharmaceutics. 4 (1), 26-41 (2012).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+skin+corrosion:+reconstructed+human+epidermis+(RhE)+test+method.+Test+Guideline+No.431.">In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RhE) test method. Test Guideline No.431.</a> OECD Guideline for Testing of Chemicals. , (2019).</li><li>Almeida, A., Sarmento, B., Rodrigues, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+in+vitro+models+for+safety+and+toxicity+assessment+of+cosmetic+ingredients.">Insights on in vitro models for safety and toxicity assessment of cosmetic ingredients.</a> International Journal of Pharmaceutics. 519 (1-2), 178-185 (2017).</li><li>vanden Broek, L. J., Bergers, L. I. J. C., Reijnders, C. M. A., Gibbs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+future+Prospectives+in+Skin-on-Chip+Development+with+Emphasis+on+the+use+of+Different+Cell+Types+and+Technical+Challenges.">Progress and future Prospectives in Skin-on-Chip Development with Emphasis on the use of Different Cell Types and Technical Challenges.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 13 (3), 418-429 (2017).</li><li>Ata&#231;, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+on-a-chip:+In+vitro+skin+models+versus+ex+vivo+tissue+maintenance+with+dynamic+perfusion.">Skin and hair on-a-chip: In vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion.</a> Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).</li><li>Abaci, H. E., Gledhill, K., Guo, Z., Christiano, A. M., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pumpless+microfluidic+platform+for+drug+testing+on+human+skin+equivalents.">Pumpless microfluidic platform for drug testing on human skin equivalents.</a> Lab on a Chip. 15 (3), 882-888 (2015).</li><li>Wu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-thickness+human+skin-on-chip+with+enhanced+epidermal+morphogenesis+and+barrier+function.">Full-thickness human skin-on-chip with enhanced epidermal morphogenesis and barrier function.</a> Materials Today. 21 (4), 326-340 (2017).</li><li>Materne, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multi-organ+chip+-+a+microfluidic+platform+for+long-term+multi-tissue+coculture.">The multi-organ chip - a microfluidic platform for long-term multi-tissue coculture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52526 (2015).</li><li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+of+a+full-thickness+skin+equivalent+in+a+96-well+insert+format+for+substance+permeation+studies+and+organ-on-a-chip+applications.">Bioengineering of a full-thickness skin equivalent in a 96-well insert format for substance permeation studies and organ-on-a-chip applications.</a> Bioengineering. 5 (2), 43 (2018).</li><li>Alberti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-chamber+microfluidic+platform+for+high-precision+skin+permeation+testing.">Multi-chamber microfluidic platform for high-precision skin permeation testing.</a> Lab on a Chip. 17, 1625-1634 (2017).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature BIotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li><li>Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+3D+cell+culture+to+organs-on-chips.">From 3D cell culture to organs-on-chips.</a> Trends in Cell Biology. 21 (12), 745-754 (2011).</li><li>Wufuer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-on-a-chip+model+simulating+inflammation,+edema+and+drug-based+treatment.">Skin-on-a-chip model simulating inflammation, edema and drug-based treatment.</a> Scientific Reports. 6, 37471 (2016).</li><li>Ramadana, Q., Ting, F. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micro-physiological+immune-competent+model+of+the+human+skin.">In vitro micro-physiological immune-competent model of the human skin.</a> Lab on a Chip. 16, 1899-1908 (2016).</li><li>Kim, K., Jeon, H. M., Choi, K. C., Sung, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+effectiveness+of+Curcuma+longa+leaf+extract+on+a+skin+equivalent+using+a+pumpless+skin-on-a-chip+model.">Testing the effectiveness of Curcuma longa leaf extract on a skin equivalent using a pumpless skin-on-a-chip model.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3898 (2020).</li><li>Halldorsson, S., Lucumi, E., G&#243;mez-Sj&#246;berg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices.">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li><li>Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+disease+model+of+drug+toxicity+-+induced+pulmonary+edema+in+a+lung-on-a-chip+microdevice.">A human disease model of drug toxicity - induced pulmonary edema in a lung-on-a-chip microdevice.</a> Scientific Translational Medicine. 4 (159), (2012).</li><li>Beckwitt, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+'+organ+on+a+chip+'.">Liver ' organ on a chip '.</a> Experimental Cell Research. 363 (1), 15-25 (2018).</li><li>Poceviciute, R., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-gut-microbiome+on+a+chip.">Human-gut-microbiome on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 500-501 (2019).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).</li><li>Esc&#225;mez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+optimal+virus-mediated+growth+factor+gene+delivery+for+human+cutaneous+wound+healing+enhancement.">Assessment of optimal virus-mediated growth factor gene delivery for human cutaneous wound healing enhancement.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128 (6), 1565-1575 (2008).</li><li>Llames, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+plasma+as+a+dermal+scaffold+for+the+generation+of+a+completely+autologous+bioengineered+skin.">Human plasma as a dermal scaffold for the generation of a completely autologous bioengineered skin.</a> Transplantation. 77 (3), 350-355 (2004).</li><li>Llames, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+results+of+an+autologous+engineered+skin.">Clinical results of an autologous engineered skin.</a> Cell Tissue Bank. 7 (1), 47-53 (2006).</li><li>Cubo, N., Garcia, M., del Ca&#241;izo, J. F., Velasco, D., Jorcano, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+functional+human+skin:+production+and+in+vivo+analysis.">3D bioprinting of functional human skin: production and in vivo analysis.</a> Biofabrication. 9 (1), 015006 (2016).</li><li>Mori, N., Morimoto, Y., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+integrated+with+perfusable+vascular+channels+on+a+chip.">Skin integrated with perfusable vascular channels on a chip.</a> Biomaterials. 116, 48-56 (2017).</li><li>Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+microbiome+and+mechanical+deformation+to+intestinal+bacterial+overgrowth+and+inflammation+in+a+human+gut-on-a-chip.">Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 7-15 (2016).</li><li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidics-based+in+vitro+model+of+the+gastrointestinal+human-microbe+interface.">A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface.</a> Nature Communications. 7, 11535 (2016).</li><li>Marx, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-on-a-chip'+developments:+A+translational+cuttingedge+alternative+to+systemic+safety+assessment+and+efficiency+evaluation+of+substances+in+laboratory+animals+and+man.">Human-on-a-chip' developments: A translational cuttingedge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 40 (5), 235-257 (2012).</li><li>Bein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organ-on-a-chip+models+of+human+intestine.">Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).</li><li>Bennet, D., Estlack, Z., Reid, T., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microengineered+human+corneal+epithelium-on-a-chip+for+eye+drops+mass+transport+evaluation.">A microengineered human corneal epithelium-on-a-chip for eye drops mass transport evaluation.</a> Lab on a Chip. 18, 1539-1551 (2018).</li><li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow.">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab on a chip. 12, 2165-2174 (2012).</li><li>Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut-on-a-chip+microenvironment+induces+human+intestinal+cells+to+undergo+villus+differentiation.">Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation.</a> Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).</li><li>O'Neill, A. T., Monteiro-Riviere, N. A., Walker, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microfluidic+human+epidermal+keratinocyte+culture.">Characterization of microfluidic human epidermal keratinocyte culture.</a> Cytotechnology. 56 (3), 197-207 (2008).</li><li>Ren, K., Chen, Y., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+materials+for+microfluidics+in+biology.">New materials for microfluidics in biology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 25, 78-85 (2014).</li></ol>

Motivationen att utveckla denna metod var viljan att modellera hudsjukdomar och studera effekterna av nya och innovativa terapier i en plattform med hög genomströmning. Hittills producerar detta laboratorium dessa dermo-epidermal motsvarigheter genom gjutning-antingen manuellt eller med hjälp av 3D bioprinting teknik-fibrin gel med fibroblaster i en cell kultur infoga tallrik och så keratinocyter ovanpå den. När keratinocyterna når sammanflöde utsätts 3D-kulturen för luft-vätskegränssnittet, vilket inducerar ...

Nyligen har framsteg gjorts mot utveckling och produktion av in vitro mänskliga hudmodeller för analys av toxiciteten hos kosmetiska och farmaceutiska produkter1. Forskare inom läkemedels- och hudvårdsindustrin har använt djur, möss är de vanligaste, för att testa sina produkter2,3,4,5. Testprodukter på djur är dock inte alltid förutsägande av svaret hos människor, vilket ofta leder till läkemedelssvikt eller negativa effekter hos människor och följaktligen till ekonomiska förluster5,6. Förenade kungariket var det första land som förbjöd användning av djur för kosmetisk testning 1998. Senare, 2013, förbjöd EU testning och approbation av kosmetika hos djur (EU:s kosmetikalagstiftning nr 1223/2009)7.
Detta förbud övervägs också av andra länder, t.ex. Förutom etiska problem gör de anatomiska skillnaderna mellan djur- och mänsklig hud djurförsök tidskrävande, dyra och ofta ineffektiva. Dessutom förväntas den globala marknaden för in vitro-toxikologitestning uppgå till 26,98 miljarder US-dollar år 20259. Av dessa skäl finns det ett behov av att utveckla nya metoder och alternativ för in vitro-studier, såsom bioengineered humana hudmodeller, som möjliggör testning av säkerhet och toxiska effekter av kosmetika och läkemedel utan användning av djur.
Det finns två olika typer av kommersiellt tillgängliga, in vitro, mänskliga hudmodeller. Den första typen består av stratifierade epidermala ekvivalenter som innehåller flera lager av differentierande keratinocyter som är sådda på olika material. Några av dem har godkänts av Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD) och godkänts av (Europeiska centrumet för validering av alternativa metoder (ECVAM) för hudkorrosion och irritationstestning, såsom EpiDerm eller SkinEthic10,11,12. Den andra typen är fullhudsekvivalenter med ett lager av differentierande mänskliga keratinocyter sådda på en tredimensionell (3D) byggnadsställning som innehåller fibroblaster, såsom T-Skin och EpiDerm-FT. Dessa modeller odlas dock under statiska förhållanden, vilket gör att de inte kan representera mänskliga fysiologiska förhållanden korrekt.
Det senaste intresset har fokuserat på att generera in vitro 3D-hudmodeller i cellodlingsinsatsformat (CCI) med dynamisk perfusion13,14,15,16,17,18,19. Dessa system kan dock inte betraktas som stricto sensu som mikrofluidiska skin-on-chips enligt deras klassiska definition på fältet. Ingbers definition för organ på ett chip anger att organet måste placeras inuti de mikrofluidiska kanalerna, vilket är ett villkor att endast ett fåtal enheter uppfyller20,21. Skin-on-chips har hittills modellerat mestadels enkel epitel som encelliga lager och/eller hudcelllager åtskilda av ett poröst membran22,23. Även om det har gjorts några framsteg modellering av huden i mikrofluidiska system16,24, finns det för närvarande ingen litteratur som visar ett organ-på-ett-chip-system som passar Ingbers definition, som kan producera en flerskiktad hud på plats och inklusive både epitelala och stromala komponenter.
I detta arbete presenteras en ny, kostnadseffektiv, robust, vinylbaserad mikrofluidisk plattform för hud-på-ett-chip-applikationer. Denna plattform producerades genom mikrobearbetning, vilket ger mer enkelhet i tillverkningsprocessen, liksom ökad flexibilitet och mångsidighet i enhetens layout, övervinna några av begränsningarna i PDMS25. Ett sätt att införa en förenklad hudkonstruktion genom ett parallellt flöde som styrs med sprutpumpar utformades också. Parallellt flöde gör att två vätskor med mycket olika viskositeter (en buffert och fibrin pre-gel i detta fall) kan perfuseras genom en kanal utan att blandas med varandra. Som ett bevis på koncept introducerades en dermo-epidermal konstruktion som innehåller fibroblaster inbäddade i en fibrin matris som härma dermis i enheten, ovanpå vilken en monolayer av keratinocyter laddades för att efterlikna odifferentierade epidermis. Dermal kupéhöjden kan moduleras genom att ändra flödeshastigheterna. Huvudförfattaren i detta arbete, jämfört med tidigare beskrivna modeller22,26,27,28,29, är utvecklingen av en 3D-konstruktion inuti en mikrokammare med hjälp av mikrofluidik. Även om denna artikel presenterar en förenklad odifferentierad hud, är det långsiktiga målet att generera och karakterisera en helt differentierad hudkonstruktion för att visa dess livskraft och funktionalitet för läkemedels- och kosmetiska teständamål.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amchafibrin</td>
			<td>Rottafarm</td>
			<td></td>
			<td>Tranexamic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic</td>
			<td>Thermo Scientific HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape vynil</td>
			<td>ATP Adhesive Systems</td>
			<td></td>
			<td>GM 107CC, 12 &#181;m thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edge plotter</td>
			<td>Brother</td>
			<td></td>
			<td>Scanncut CM900</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Scientific HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Extracted from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-Human dermal fibroblasts</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Primary. Gift from Dr. Marta Garc&#237;a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2B-GFP-HaCaT cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta Garc&#237;a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/dead kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Merk TM</td>
			<td></td>
			<td>5 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>Sylgard 184</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>10 NIH/vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent adhesive vinyl</td>
			<td>Mactac</td>
			<td></td>
			<td>JT 8500 CG-RT, 95 &#181;m thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td></td>
			<td>Teflon, 1/16&#8221; OD, 0.020&#8221; ID</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a simplified three-dimensional skin-on-a-chip model in a micromachined microfluidic platform

Detta arbete presenterar en ny, kostnadseffektiv och pålitlig mikrofluidisk plattform med potential att generera komplexa flerskiktsvävnader. Som ett konceptbevis har en förenklad och odifferentierad mänsklig hud som innehåller en dermal (stromal) och ett epidermalt (epitelial) fack modellerats. För att uppnå detta har en mångsidig och robust, vinylbaserad enhet uppdelad i två kammare utvecklats, övervinna några av nackdelarna som finns i mikrofluidiska enheter baserade på polydimethylsiloxan (PDMS) för biomedicinska tillämpningar, såsom användning av dyr och specialiserad utrustning eller absorption av små, hydrofoba molekyler och proteiner. Dessutom utvecklades en ny metod baserad på parallella flöden, vilket möjliggör in situ-deponering av både dermala och epidermal avdelningar. Hudkonstruktionen består av en fibrinmatris som innehåller mänskliga primära fibroblaster och ett monoskikt av odödliga keratinocyter sådda ovanpå, som därefter upprätthålls under dynamiska odlingsförhållanden. Denna nya mikrofluidiska plattform öppnar möjligheten att modellera mänskliga hudsjukdomar och extrapolera metoden för att generera andra komplexa vävnader.

Det designade chipet består av två fluida kammare åtskilda av ett 5 μm porstorlek PC-membran som möjliggör tillväxten av cellen genom att tillåta passage av tillväxtfrämjande molekyler från den nedre kammaren. Den övre kammaren håller vävnad konstruktion, i detta fall, en monolayer av hKCs på en fibrin hydrogel som innehåller hFBs.
Kanalernas höjd bestäms av antalet självhäftande ark som läggs till varje kanal. Den nedre kammaren består av 4 lager (380 μm) och det övre ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform at JoVE.com

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

Här presenterar vi ett protokoll för att generera en tredimensionell förenklad och odifferentierad hudmodell med hjälp av en mikromaskin mikrofluidisk plattform. En parallell flödesmetod gör det möjligt att in situ deponera ett hudfack för sådd av epitelceller ovanpå, allt styrt av sprutpumpar.

Generering av en förenklad tredimensionell hud-på-ett-chip-modell i en mikromaskin mikrofluidisk plattform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Detta är ett nytt, litografifritt protokoll för modellering av en 3D-hud-på-chip med hjälp av mikromaskin, självhäftande vinylskikt och en parallellflödesmetodik för dermala fackgenerering. Micromachined vinyl ger mer enkelhet i tillverkningsprocessen och mångsidighet i enhetens layout, övervinna några av begränsningarna i PDMS och traditionella litografimetoder. Denna flerskiktade hud-på-ett-chip kan användas för läkemedels- och kosmetiska testmetoder, eftersom det möjliggör screening med hög genomströmning till lägre kostnader och kan användas för att modellera flera sjukdomar.Börja med att designa ett mikrofluidiskt chip med Brother Canvas Workspace-programvaran. Skapa en arbetsyta på 30 och 30 centimeter och fyll den med designmönstren för chipets olika lager innan du lagrar den i en svg-fil. Skär de 30 med 30 centimeter vinyllakanen.Håll den på en låghäftande limmatta och eliminera alla luftbubblor vid behov. Använd en USB-enhet, ladda upp svg-filen till kantplottern och ställa in skärparametrarna som skärtryck på nivå noll, skärblad på nivå tre och nivå ett för skärhastigheten. När parametrarna är inställda, placera den självhäftande mattan med vinylen i plottern och börja processen med att skära kanalmönstren på 95 mikrometer tjock vinyl.Montera hela enheten med hjälp av en aligner för rätt justeringskanaler, inlopp och uttag. Stapla upp för vinyllager med en motsvarande mikromachine design för montering av den nedre kanalen, hålla täcktejpen på bottenskiktet för att undvika att hålla fast vid justeringen. Skär och placera polykarbonatporösa membranet ovanpå den nedre kanalen utan att täcka inloppen.Lägg till 10 vinyllager med den övre kammardesignen och fäst ett dubbelsidigt tejpslutskikt ovanpå. Ta bort chipet från alignern för att fästa det på glasglasglaset. Placera ett två millimeter tjockt PDMS-ark ovanpå det dubbelsidiga tejp vinylskiktet.För att säkerställa att chipet är helt vattentätt, lämna en vikt ovanpå chipet över natten. Nästa dag steriliserar du chipet genom att spola det med 70% etanol i fem minuter, följt av en tvätt med destillerat vatten. Anslut pump ett och pumpa två till det övre kammaren inlopp ett respektive övre kammaren inlopp två.Anslut pump tre till inloppet till den nedre kammaren och anslut sedan den övre kammaren och de nedre kammarutloppen till ett avfallsbadkar. Anslut sprutorna till varje inlopp med PTFE-rör och 18-gauge rostfria kontakter. Pumpa PBS med pump tre genom det nedre kammarens inlopp vid 50 mikroliter per minut, och med pump två genom den övre kammaren inlopp två med 100 mikroliter per minut.Ladda sedan sprutan med fibrinogen pregelen, placera den omedelbart i pump ett och kör den vid 200 mikroliter per minut. När förgelen lämnar det övre kammarutloppet, stoppa pumparna ett och två, lämna sedan chipet utan att ta bort slangen för att tillåta gellation vid 37 grader Celsius i 10 minuter. Efter gellation, blockera den övre kammaren inlopp en med ett lock, och pumpa odlingsmediet genom övre kammaren inlopp två med pump tre vid 50 mikroliter per timme över natten.24 timmar efter genereringen av hudutrymmet, kontrollera att mänskliga primära fibroblastceller sprids i enheten och för sedan fem gånger 10 till de 6 HKC per milliliter genom det övre kanalinloppet två vid 40 mikroliter per minut i en minut. För cellfäste, placera chipet över natten vid 37 grader Celsius i en fuktighetsmättad inkubator. Börja pumpa nytt odlingsmedium med pump tre endast genom det nedre kammarens inlopp vid 50 mikroliter per minut.I den representativa analysen visas höjden på hydrogelen längs monteringens övre kammare. En genomsnittlig höjd på 550 mikrometer var optimal för gelens funktion vid flödeshastigheterna 100 respektive 200 mikroliter per minut för offer PBS respektive pre-gel. Underlåtenhet att spola PBS genom den nedre kanalen ledde till skillnader mellan gelens teoretiska höjd och den uppmätta, med en skillnad på 40%Efter 24 timmar från initieringen av parallellflödesprotokollet, befanns de mänskliga primära fibroblasterna vara framgångsrikt spridda i fibringelen i enhetens övre kammare, därefter kan gröna fluorescerande protein-uttrycka HKCs effektivt sådas ovanpå hydrogelen.Avlägsnande av slangar utan att hålla systemet stängt över natten för att hkcs skulle kunna sediment resulterade i en icke-enhetlig, sammanflyttande monolayer av celler. 3D konfokal analys av den odifferentierade huden modellen i microfluidic chip visade tydligt ytan av hydrogel separera HKCs i toppen från fibroblast inbäddat längst ner. Den genererade huden kan utsättas för luft/flytande gränssnitt för att erhålla en mogen och differentierad epidermis, och ytterligare karakteriseras med hjälp av flera dermal och epidermal markörer.Denna teknik möjliggör en snabbare och billigare enhetstillverkning och generering av flerskiktad hud med hjälp av mikrofluidik, vilket ger ett mer realistiskt tillvägagångssätt för läkemedel och kosmetikatestning.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Tredimensionell optisk upplösning photoacoustic Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Plana och tredimensionella Tryckning av ledande bläck

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Hög genomströmning Protein Expression Generator Med en mikroflödessystem plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Cell Klämma som en robust, mikroflödes Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

Undersöka den tredimensionella flödesseparationen inducerad av en modell vokal vikpolyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generering av ett tredimensionellt Full Tjocklek hudekvivalent och automatiserade sårar

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Tillverkning av Inverted kolloidalt Crystal Poly (etylenglykol) Scaffold: En tredimensionell cellkultur plattform för levervävnad Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Tillverkning av Tredimensionell Pappersbaserade Mikrofluidikanordningar för Immun

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Mikroflödes Plattform med Multiplex elektronisk detektering för rumslig Spårning av partiklar

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

En mikroflödessystem plattform för längsgående Imaging i Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...