Name: a magnetic-bead-based mosquito dna extraction protocol for next-generation sequencing
Uploaded: 2021-04-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

Vi anerkender finansiering støtte fra Pacific Southwest Regional Center of Excellence for vektor-bårne sygdomme finansieret af den amerikanske Centers for Disease Control og Forebyggelse (Samarbejdsaftale 1U01CK000516), CDC tilskud NU50CK000420-04-04, USDA National Institute of Food and Agriculture (Hatch projekt 1025565), UF / IFAS Florida Medical Entomology Laboratory stipendium til Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC Fase II tilskud (AWD05009_MOD0030), og Florida Department of Health (Kontrakt CODQJ). Resultaterne og konklusionerne i denne artikel er dem af forfatteren (r) og ikke nødvendigvis repræsenterer de synspunkter, som den amerikanske Fish and Wildlife Service.

1. Generel opbevaring af prøver og præparater inden DNA-ekstraktion
<ol><li>Prøven inddamsprøven i vand af 100 μL PCR-kvalitet i 1 time (eller natten over) ved 4 °C, hvis prøven er opbevaret i > 70% alkohol for at blødgøre vævet.</li>
</ol>2. Afbrydelse af stikprøven
<ol><li>Sæt en inkubator eller rystende varmeblok ved 56 °C.</li>
	<li>Lav proteinase K (PK) buffer/enzym mix. Der kræves 2 μL Proteinase K (100 mg/mL) og 98 μL Proteinase K Buffer (i alt 100 μL) for hver enkelt m...

<ol>
	<li>Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+extraction+protocol+for+improved+DNA+yield+from+individual+mosquitoes.">A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes.</a> F1000Research. 4, 1314 (2015).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+divergence+among+invasive+populations+of+Aedes+aegypti+in+California.">Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California.</a> BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance+of+conserved+CRISPR-Cas9+target+sites+within+the+highly+polymorphic+genomes+of+Anopheles+and+Aedes+mosquitoes.">Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes.</a> Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcontinental+dispersal+of+Anopheles+gambiae+occurred+from+West+African+origin+via+serial+founder+events.">Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events.</a> Communications Biology. 2, 473 (2019).</li><li>Norris, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+introgression+in+an+African+malaria+mosquito+coincident+with+the+increased+usage+of+insecticide-treated+bed+nets.">Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).</li><li>Main, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+of+host+preference+and+resting+behavior+in+the+major+african+malaria+vector,+Anopheles+arabiensis.">The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis.</a> Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).</li><li>Yamasaki, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+genomic+DNA+library+construction+of+small+insects.">Improved tools for genomic DNA library construction of small insects.</a> F1000Research. 5, 211 (2016).</li><li>Tabuloc, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+of+Tuta+absoluta+genome+to+develop+SNP+genotyping+assays+for+species+identification.">Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification.</a> Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).</li><li>Campos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+mitogenome+sequence+of+Anopheles+coustani+from+S&#227;o+Tom&#233;+island.">Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from S&#227;o Tom&#233; island.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).</li><li>Cornel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+mitogenome+sequences+of+Aedes+(Howardina)+busckii+and+Aedes+(Ochlerotatus)+taeniorhynchus+from+the+Caribbean+Island+of+Saba.">Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).</li><li>Lucena-Aguilar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+source+selection+for+downstream+applications+based+on+dna+quality+indicators+analysis.">DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis.</a> Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).</li></ol>

Den her beskrevne protokol kan tilpasses andre insektarter. Den oprindelige version af protokollen indført i Nieman et al.1 er blevet testet på flere arter, herunder Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta og Keiferia lycopersicella<sup clas...

Den seneste udvikling af en forbedret DNA-ekstraktionsprotokol1 har gjort det muligt at se mange undersøgelser af nedstrøms med stor effekt , der omfatter hele genomsekvensering2,3,4,5,6. Denne magnetiske perlebaserede DNA-ekstraktionsprotokol giver pålideligt DNA-udbytte fra individuelle mygprøver, hvilket igen reducerer omkostningerne og tiden forbundet med at erhverve et tilstrækkeligt antal prøver fra feltsamlinger.
De seneste fremskridt inden for befolknings- og landskabsgenomik hænger direkte sammen med faldende omkostninger ved helgenomsekvensering. Selvom den tidligere DNA-ekstraktionsprotokol1 øger effektiviteten forbundet med høj gennemløbssekvensering, kan mindre laboratorier / undersøgelser uden midler fravælge at bruge disse nye kraftfulde landskabs- og populationsgenomikværktøjer på grund af omkostningerne ved at implementere protokollen (f.eks. omkostninger til specialiserede instrumenter).
Her præsenteres en modificeret DNA-ekstraktionsprotokol, der bruger et lignende magnetisk perleekstraktionstrin som Neiman et al.1 for at opnå DNA med høj renhed, men ikke er afhængig af dyre instrumenter til væv lysis og DNA-ekstraktion. Denne protokol er velegnet til eksperimenter, der kræver >10 ng dna af høj kvalitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19077</td>
			<td>Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AL Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19075</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW1 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19081</td>
			<td>Washing buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW2 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19072</td>
			<td>Washing buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagAttract Suspension G</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1026901</td>
			<td>magnetic bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead separator</td>
			<td>Epigentek</td>
			<td>Q10002-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>microvolume spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PK Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4489111</td>
			<td>Proteinase K buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td>fluorometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a magnetic-bead-based mosquito dna extraction protocol for next-generation sequencing

En nyligt offentliggjort DNA-ekstraktionsprotokol ved hjælp af magnetiske perler og et automatiseret DNA-ekstraktionsinstrument antydede, at det er muligt at udtrække DNA af høj kvalitet og mængde fra en velbevaret individuel myg, der er tilstrækkelig til downstream hele genomsekvensering. Afhængighed af et dyrt automatiseret DNA-ekstraktionsinstrument kan dog være uoverkommeligt for mange laboratorier. Her giver undersøgelsen en budgetvenlig magnetisk-perlebaseret DNA-ekstraktionsprotokol, som er velegnet til lav til medium gennemløb. Protokollen beskrevet her blev med succes testet ved hjælp af individuelle Aedes aegypti myg prøver. De reducerede omkostninger forbundet med dna-ekstraktion af høj kvalitet vil øge anvendelsen af høj gennemløbssekvensering på ressourcebegrænsede laboratorier og undersøgelser.

Det gennemsnitlige DNA-udbytte pr. enkelt myghoved/brystkassevæv var 4,121 ng/μL (N = 92, standardafvigelse 3,513) målt ved hjælp af et fluorometer ved eluering ved hjælp af 100 μL elueringsbuffer. Dette er tilstrækkeligt til de 10-30 ng genomiske DNA-inputkrav, der er nødvendige for hele genombibliotekets konstruktion1,7. Mængden af DNA kan variere mellem 0,3-29,7 ng/μL afhængigt af myggenes kropsstørrelse og bevaringsforhold. Nogle af de høje varia...

Watch this Scientific Journal Video about A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

Beskrevet her er en DNA-ekstraktionsprotokol ved hjælp af magnetiske perler til at producere DNA-ekstraktioner af høj kvalitet fra myg. Disse ekstraktioner er velegnede til en downstream næste generations sekventeringsmetode.

En magnetisk perle-baseret Mosquito DNA ekstraktion protokol for næste generations sekventering

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...

Denne budgetvenlige magnetiske perlebaserede DNA-ekstraktionsprotokol gør høj gennemløbssekvensering tilgængelig for ressourcebegrænsede laboratorier og undersøgelser. Denne protokol kræver ikke dyrt udstyr til DNA-ekstraktion af høj kvalitet, og det kan være nyttigt i visse diagnostiske eller forskningsmæssige situationer, hvor det er udfordrende at opnå en tilstrækkelig mængde DNA med en kvalitet til sekvensering af høj gennemløb. Denne protokol er nem at replikere med en engangsdemonstration.Det skal først prøves med et lille antal prøver for at blive fortrolig med arbejdsgangen. Til at begynde med skal du hydrere myggevævsprøverne, der opbevares i mere end 70% alkohol, ved at tilføje 100 mikroliter PCR-kvalitet vand og inkubere i en time ved fire grader Celsius for at blødgøre vævet. Efter inkubationen kasseres vandet og tilsættes 100 mikroliter Proteinase K bufferenzymblanding.Brug derefter et mikrocentrifugerør til at homogenisere vævet. Efter homogenisering centrifuges vævslysatet og inkuberes i to til tre timer ved 56 grader Celsius. For at udtrække DNA, pipette 100 mikroliter af vævet lysat i en ny ren mikrocentrifuge rør.Derefter tilsættes 215 mikroliter af den magnetiske perle master mix. Ved hjælp af en pipette blandes lysatet og den magnetiske perlerblanding i 10 til 20 sekunder, og lad den stå i 10 minutter ved stuetemperatur. Under inkubationen rystes røret lejlighedsvis for at maksimere bindingen af DNA'et til de magnetiske perler.Placer derefter røret på den magnetiske perleseparator, indtil opløsningen bliver klar. Derefter ved hjælp af en pipette, forsigtigt suge væsken fra røret uden at forstyrre den magnetiske perler holde DNA. Flyt røret væk fra den magnetiske perleseparator, og vask perlerne ved at tilsætte 325 mikroliter vaskebuffer 1.Bland grundigt ved pipettering og inkuber i et minut ved stuetemperatur. Efter inkubationen skal røret anbringes på den magnetiske perleseparator og supernatanten fjernes som tidligere påvist, og derefter flyttes røret væk fra den magnetiske perleseparator, og perlerne vaskes én gang med vaskebuffer en. Efter den anden vask med buffer en, vask perlerne to gange med 250 mikroliter vask buffer to på samme måde.Efter den sidste vask skal røret flyttes væk fra den magnetiske perleseparator og tilsæt 100 mikroliter elueringsbuffer. Bland grundigt ved pipettering og inkubter derefter røret i to minutter ved stuetemperatur, før det placeres tilbage på den magnetiske separator. Når opløsningen bliver klar, overføres supernatanten til et nyt, rent mikrocentrifugerør på 0,5 milliliter og opbevares korrekt.Vist her som en typisk mikrovolume fluorometeraflæsning af myg DNA i en eluering buffer indeholder 0,5 millimolar EDTA. Den gennemsnitlige absorbansprocent på 260 til 280 nanometer er 2,3. Denne tabel viser omkostningerne og antallet af prøver, der behandles på én arbejdsdag for forskellige ekstraktionsmetoder.De typiske reagens- og forbrugsomkostninger ved en ekstraktion ved denne protokol er omkring 9,50 pr. prøve. Denne omkostning svarer til enhver typisk magnetisk perlebaseret ekstraktionsmetode. Den største omkostningsfordel ved denne protokol kommer fra ikke at kræve det automatiserede DNA-ekstraktionsinstrument.Sørg for at skifte pipettespidser mellem prøverne for at forhindre krydskontaminering af DNA, når du arbejder med flere prøver. Vi bruger dna af høj kvalitet udvundet ved hjælp af denne metode til helgenomsekvensering. Vi bruger i øjeblikket sekventeringsdataene til at identificere nye mutationer i insekticidresistens eller immungener, der giver anledning til bekymring i folkesundheds- og sygdomsbekæmpelse.At have overkommelige løsninger til høj gennemløbssekvensering åbner spændende døre for populationsgenomik og landskabsgenomik med det formål at forstå myggespredning og genstrøm, hvilket påvirker succesen med mange nye genetiske kontrolstrategier.

Research

JoVE Journal

Biology

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Fluorescens-mikroskopi Screening og næste generation sekventering: Nyttige værktøjer til identifikation af gener involveret i organel Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Næste generations sekventering af 16S ribosomalt RNA Gene Amplikoner

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Målrettet DNA methyleringsanalyse by Next generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Forstærkning, Næste generations sekventering, og Genomisk DNA Kortlægning af retroviral integration steder

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

Effektiv Nucleic Acid Udvinding og 16S rRNA Gene sekventering for bakteriel Community karakterisering

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interactome-Seq: En protokol til Domainome bibliotek konstruktion, validering og udvælgelse af Phage Display og næste Generation Sequencing

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Kryds Microbiome karakterisering af næste generations 16S rRNA-amplikon sekventering

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Mikrobiota-analyse ved hjælp af to-trins PCR og næste generations 16S rRNA-Gensekvensering

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Creating Robust Bisulfite-mRNA Libraries for Transcriptome-Wide Mapping

Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing

Decoding RNA Methylation's Role in Pancreatic Cancer - A Single-Base Resolution Study (Video) | JoVE

Berigelse af mRNA og bisulfit-mRNA biblioteksforberedelse til næste generations sekventering

RNA post-transcriptional modifications in various types of RNA transcripts are associated with diverse RNA regulation in eukaryotic cells. Aberrant RNA ...