Name: a magnetic-bead-based mosquito dna extraction protocol for next-generation sequencing
Uploaded: 2021-04-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

We erkennen de financiering van het Pacific Southwest Regional Center of Excellence for Vector-Borne Diseases, gefinancierd door de Amerikaanse Centers for Disease Control and Prevention (Cooperative Agreement 1U01CK000516), CDC-subsidie NU50CK000420-04-04, het USDA National Institute of Food and Agriculture (Hatch-project 1025565), UF/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory fellowship to Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC Phase II grant (AWD05009_MOD0030) De bevindingen en conclusies in dit artikel zijn die van de auteur(s) en vertegenwoordigen niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de U.S. Fish and Wildlife Service.

1. Algemene monsteropslag en preparaten voorafgaand aan DNA-extractie
<ol><li>Hydrateer het monster gedurende 1 uur (of 's nachts) bij 4 °C in 100 μL PCR-water als het monster is opgeslagen in >70% alcohol om het weefsel te verzachten.</li>
</ol>2. Voorbeeld verstoring
<ol><li>Zet een incubator of schudwarmteblok op 56 °C.</li>
	<li>Maak proteinase K (PK) buffer/enzymmix. 2 μL Proteïnase K (100 mg/ml) en 98 μL Proteinase K Buffer (totaal 100 μL) is vereist voor elke individuele muggenex...

<ol>
	<li>Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+extraction+protocol+for+improved+DNA+yield+from+individual+mosquitoes.">A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes.</a> F1000Research. 4, 1314 (2015).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+divergence+among+invasive+populations+of+Aedes+aegypti+in+California.">Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California.</a> BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance+of+conserved+CRISPR-Cas9+target+sites+within+the+highly+polymorphic+genomes+of+Anopheles+and+Aedes+mosquitoes.">Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes.</a> Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcontinental+dispersal+of+Anopheles+gambiae+occurred+from+West+African+origin+via+serial+founder+events.">Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events.</a> Communications Biology. 2, 473 (2019).</li><li>Norris, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+introgression+in+an+African+malaria+mosquito+coincident+with+the+increased+usage+of+insecticide-treated+bed+nets.">Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).</li><li>Main, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+of+host+preference+and+resting+behavior+in+the+major+african+malaria+vector,+Anopheles+arabiensis.">The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis.</a> Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).</li><li>Yamasaki, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+genomic+DNA+library+construction+of+small+insects.">Improved tools for genomic DNA library construction of small insects.</a> F1000Research. 5, 211 (2016).</li><li>Tabuloc, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+of+Tuta+absoluta+genome+to+develop+SNP+genotyping+assays+for+species+identification.">Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification.</a> Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).</li><li>Campos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+mitogenome+sequence+of+Anopheles+coustani+from+S&#227;o+Tom&#233;+island.">Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from S&#227;o Tom&#233; island.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).</li><li>Cornel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+mitogenome+sequences+of+Aedes+(Howardina)+busckii+and+Aedes+(Ochlerotatus)+taeniorhynchus+from+the+Caribbean+Island+of+Saba.">Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).</li><li>Lucena-Aguilar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+source+selection+for+downstream+applications+based+on+dna+quality+indicators+analysis.">DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis.</a> Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).</li></ol>

Het hier beschreven protocol kan worden aangepast voor andere insectensoorten. De oorspronkelijke versie van het protocol geïntroduceerd in Nieman et al.1 is getest op meerdere soorten, waaronder Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An...

Recente ontwikkeling van een verbeterd DNA-extractieprotocol1 heeft veel downstreamstudies met een hoge impact mogelijk gemaakt met hele genoomsequencing2,3,4,5,6. Dit magnetische dna-extractieprotocol op basis van kralen biedt een betrouwbare DNA-opbrengst van individuele muggenmonsters, wat op zijn beurt de kosten en tijd vermindert die gepaard gaan met het verkrijgen van een voldoende aantal monsters uit veldcollecties.
Recente vooruitgang in populatie- en landschapsgenomica is direct gecorreleerd met dalende kosten van hele genoomsequencing. Hoewel het vorige DNA-extractieprotocol1 de efficiëntie verhoogt die gepaard gaat met sequencing met hoge doorvoer, kunnen kleinere laboratoria / studies zonder de fondsen zich afmelden voor het gebruik van deze nieuwe krachtige landschaps- en populatiegenomicatools vanwege de kosten van de implementatie van het protocol (bijv. kosten van gespecialiseerde instrumenten).
Hier wordt een aangepast DNA-extractieprotocol gepresenteerd dat een vergelijkbare magnetische kraalextractiestap gebruikt als Neiman et al.1 om DNA met een hoge zuiverheid te verkrijgen, maar niet afhankelijk is van dure instrumenten voor weefsellysis en DNA-extractie. Dit protocol is geschikt voor experimenten waarbij >10 ng hoogwaardig DNA nodig is.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19077</td>
			<td>Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AL Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19075</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW1 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19081</td>
			<td>Washing buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW2 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19072</td>
			<td>Washing buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagAttract Suspension G</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1026901</td>
			<td>magnetic bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead separator</td>
			<td>Epigentek</td>
			<td>Q10002-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>microvolume spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PK Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4489111</td>
			<td>Proteinase K buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td>fluorometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a magnetic-bead-based mosquito dna extraction protocol for next-generation sequencing

Een onlangs gepubliceerd DNA-extractieprotocol met behulp van magnetische kralen en een geautomatiseerd DNA-extractie-instrument suggereerde dat het mogelijk is om DNA van hoge kwaliteit en kwantiteit te extraheren uit een goed bewaarde individuele mug die voldoende is voor downstream hele genoomsequencing. Vertrouwen op een duur geautomatiseerd DNA-extractie-instrument kan echter voor veel laboratoria onbetaalbaar zijn. Hier biedt de studie een budgetvriendelijk dna-extractieprotocol op basis van magnetische kraal, dat geschikt is voor lage tot gemiddelde doorvoer. Het hier beschreven protocol is met succes getest met behulp van individuele Aedes aegypti muggenmonsters. De lagere kosten in verband met dna-extractie van hoge kwaliteit zullen de toepassing van hoge doorvoer sequencing op resource beperkte laboratoria en studies verhogen.

De gemiddelde DNA-opbrengst per individuele muggenkop/thoraxweefsel was 4,121 ng/μL (N = 92, standaardafwijking 3,513) gemeten met behulp van een fluorometer bij elutie met 100 μL elutiebuffer. Dit is voldoende voor de 10-30 ng genomische DNA-inputvereisten die nodig zijn voor de constructie van de gehele genoombibliotheek1,7. De hoeveelheid DNA kan variëren tussen 0,3-29,7 ng/μL, afhankelijk van de lichaamsgrootte en conserveringsomstandigheden van de mug. E...

Watch this Scientific Journal Video about A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

Hier wordt een DNA-extractieprotocol beschreven met behulp van magnetische kralen om DNA-extracties van hoge kwaliteit van muggen te produceren. Deze extracties zijn geschikt voor een downstream next-generation sequencing benadering.

Een op magnetische kraal gebaseerd mosquito-DNA-extractieprotocol voor sequencing van de volgende generatie

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...

Dit budgetvriendelijke magnetische dna-extractieprotocol op basis van kralen maakt een hoge doorvoer sequencing toegankelijk voor labs en studies met beperkte middelen. Dit protocol vereist geen dure apparatuur voor dna-extractie van hoge kwaliteit en kan nuttig zijn in bepaalde diagnostische of onderzoekssituaties waar het verkrijgen van een voldoende hoeveelheid DNA met een kwaliteit voor hoge doorvoer sequencing een uitdaging is. Dit protocol is eenvoudig te repliceren met een eenmalige demonstratie.Het moet eerst worden geprobeerd met een klein aantal voorbeelden om vertrouwd te raken met de workflow. Om te beginnen, hydrateren de muggenweefselmonsters opgeslagen in meer dan 70% alcohol door 100 microliter PCR-kwaliteit water toe te voegen en gedurende een uur te broeden bij vier graden Celsius om het weefsel te verzachten. Gooi na de incubatie het water weg en voeg 100 microliters Proteinase K bufferenzymmix toe.Gebruik vervolgens een microcentrifugebuis stamper om het weefsel te homogeniseren. Centrifugeer na homogenisatie het weefsellysaat en incubeer gedurende twee tot drie uur bij 56 graden Celsius. Om DNA te extraheren, pipeteert u 100 microliters van het weefsellysaat in een nieuwe schone microcentrifugebuis.Voeg vervolgens 215 microliters van de magnetische kraal master mix toe. Meng met behulp van een pipet het lysaat en het magnetische kralenmengsel gedurende 10 tot 20 seconden en laat het vervolgens 10 minuten op kamertemperatuur staan. Schud tijdens de incubatie de buis af en toe voorzichtig om de binding van het DNA aan de magnetische kralen te maximaliseren.Plaats vervolgens de buis op de magnetische kraalafscheider totdat de oplossing duidelijk wordt. Vervolgens met behulp van een pipet, voorzichtig aspireren de vloeistof uit de buis zonder het verstoren van de magnetische kralen die het DNA. Verplaats de buis uit de buurt van de magnetische kraalafscheider en was de kralen door 325 microliters wasbuffer één toe te voegen.Meng grondig door pipetten en incubeer gedurende één minuut op kamertemperatuur. Plaats na de incubatie de buis op de magnetische kraalafscheider en verwijder het supernatant zoals eerder aangetoond, verplaats vervolgens de buis weg van de magnetische kraalafscheider en was de kralen eenmaal met wasbuffer één. Was na de tweede wasbeurt met buffer één de kralen twee keer met 250 microliter wasbuffer twee op dezelfde manier.Verplaats na de laatste wasbeurt de buis uit de buurt van de magnetische kraalafscheider en voeg 100 microliter elutiebuffer toe. Meng grondig door de buis te pipetten en incubeer de buis vervolgens gedurende twee minuten op kamertemperatuur voordat u deze weer op de magneetscheider plaatst. Wanneer de oplossing duidelijk wordt, breng het supernatant over in een nieuwe, schone microcentrifugebuis van 0,5 milliliter en bewaar het op de juiste manier.Hier weergegeven als een typische microvolume fluorometer meting van het DNA van de mug in een elutiebuffer met 0,5 millimol EDTA. De gemiddelde absorptieverhouding van 260 tot 280 nanometer is 2,3. Deze tabel toont de kosten en het aantal monsters dat in één werkdag is verwerkt voor verschillende extractiemethoden.De typische reagens- en verbruikskosten voor een extractie volgens dit protocol bedragen ongeveer 9,50 per monster. Deze kosten zijn gelijk aan elke typische magnetische afzuigmethode op basis van kraal. Het grote kostenvoordeel van dit protocol komt door het niet vereisen van het geautomatiseerde DNA-extractie-instrument.Zorg ervoor dat u pipetpunten tussen monsters verwisselt om kruisbesmetting van DNA te voorkomen bij het werken met meerdere monsters. We gebruiken het hoogwaardige DNA dat met deze methode wordt geëxtraheerd voor hele genoomsequencing. We gebruiken momenteel de sequencinggegevens om nieuwe mutaties in insecticideresistentie of immuungenen te identificeren die van belang zijn voor de volksgezondheid en ziektebestrijding.Het hebben van betaalbare oplossingen voor sequencing met hoge doorvoer opent spannende deuren voor populatiegenomica en landschapsgenomica gericht op het begrijpen van muggendispersie en genstroom die het succes van veel nieuwe genetische controlestrategieën beïnvloedt.

Research

JoVE Journal

Biology

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

Protocol voor Mosquito Opfok (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Fluorescentie-microscopie Screening en next-generation sequencing: Handige hulpmiddelen voor de identificatie van genen betrokken bij organel Integriteit

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Next-generation sequencing van het 16S ribosomaal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Gerichte DNA methylatie analyse van next-generation sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

Efficiënte Nucleic Acid Extraction en 16S rRNA Gene Sequencing voor Bacteriële Gemeenschap karakterisering

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interactome-Seq: Een Protocol voor Domainome bibliotheek bouw, de validatie en de selectie door Phage Display en volgende generatie sequentiebepaling

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Karakterisering van het Microbiome van de teek door Next-Generation 16S rRNA Amplicon sequentiebepaling

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Microbiota-analyse met behulp van twee-stap PCR en de volgende generatie 16S rRNA Gensequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Creating Robust Bisulfite-mRNA Libraries for Transcriptome-Wide Mapping

Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing

Decoding RNA Methylation's Role in Pancreatic Cancer - A Single-Base Resolution Study (Video) | JoVE

Verrijking van mRNA en bisulfiet-mRNA-bibliotheekvoorbereiding voor sequencing van de volgende generatie

RNA post-transcriptional modifications in various types of RNA transcripts are associated with diverse RNA regulation in eukaryotic cells. Aberrant RNA ...