Name: a magnetic-bead-based mosquito dna extraction protocol for next-generation sequencing
Uploaded: 2021-04-15T14:00:00
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Nous reconnaissons le soutien financier du Pacific Southwest Regional Center of Excellence for Vector-Borne Diseases financé par les Centers for Disease Control and Prevention des États-Unis (Accord de coopération 1U01CK000516), de la subvention des CDC NU50CK000420-04-04, de l’Usda National Institute of Food and Agriculture (projet Hatch 1025565), de la bourse UF/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory à Tse-Yu Chen, de la subvention NSF CAMTech IUCRC Phase II (AWD05009_MOD0030) et du Florida Department of Health (Contrat CODQJ). Les constatations et les conclusions du présent article sont celles de l’auteur ou des auteurs et ne représentent pas nécessairement le point de vue du U.S. Fish and Wildlife Service.

1. Entreposage général des échantillons et préparations avant l’extraction de l’ADN
<ol><li>Hydrater l’échantillon dans de l’eau de qualité PCR de 100 μL pendant 1 h (ou pendant la nuit) à 4 °C si l’échantillon a été conservé dans de l’alcool de >70 % pour adoucir le tissu.</li>
</ol>2. Perturbation de l’échantillon
<ol><li>Réglez un incubateur ou un bloc chauffant secouant à 56 °C.</li>
	<li>Faire de la protéinase K (PK) tampon/mélange d’enzymes. 2 μL de pr...

<ol>
	<li>Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+extraction+protocol+for+improved+DNA+yield+from+individual+mosquitoes.">A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes.</a> F1000Research. 4, 1314 (2015).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+divergence+among+invasive+populations+of+Aedes+aegypti+in+California.">Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California.</a> BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance+of+conserved+CRISPR-Cas9+target+sites+within+the+highly+polymorphic+genomes+of+Anopheles+and+Aedes+mosquitoes.">Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes.</a> Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcontinental+dispersal+of+Anopheles+gambiae+occurred+from+West+African+origin+via+serial+founder+events.">Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events.</a> Communications Biology. 2, 473 (2019).</li><li>Norris, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+introgression+in+an+African+malaria+mosquito+coincident+with+the+increased+usage+of+insecticide-treated+bed+nets.">Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).</li><li>Main, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+of+host+preference+and+resting+behavior+in+the+major+african+malaria+vector,+Anopheles+arabiensis.">The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis.</a> Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).</li><li>Yamasaki, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+genomic+DNA+library+construction+of+small+insects.">Improved tools for genomic DNA library construction of small insects.</a> F1000Research. 5, 211 (2016).</li><li>Tabuloc, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+of+Tuta+absoluta+genome+to+develop+SNP+genotyping+assays+for+species+identification.">Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification.</a> Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).</li><li>Campos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+mitogenome+sequence+of+Anopheles+coustani+from+S&#227;o+Tom&#233;+island.">Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from S&#227;o Tom&#233; island.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).</li><li>Cornel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+mitogenome+sequences+of+Aedes+(Howardina)+busckii+and+Aedes+(Ochlerotatus)+taeniorhynchus+from+the+Caribbean+Island+of+Saba.">Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).</li><li>Lucena-Aguilar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+source+selection+for+downstream+applications+based+on+dna+quality+indicators+analysis.">DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis.</a> Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).</li></ol>

Le protocole décrit ici peut être adapté à d’autres espèces d’insectes. La version originale du protocole introduit dans Nieman et al.1 a été testée sur plusieurs espèces, y compris Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta, et Keiferia ...

Le développement récent d’un protocole d’extraction d’ADN amélioré1 a permis de nombreuses études en aval à fort impact impliquant le séquençage du génome entier2,3,4,5,6. Ce protocole d’extraction d’ADN à base de perles magnétiques fournit un rendement fiable en ADN à partir d’échantillons individuels de moustiques, ce qui réduit le coût et le temps associés à l’acquisition d’un nombre suffisant d’échantillons provenant de collections sur le terrain.
Les progrès récents de la génomique des populations et des paysages sont directement corrélés à la diminution des coûts du séquençage du génome entier. Bien que l’ancien protocole d’extraction de l’ADN1 augmente l’efficacité associée au séquençage à haut débit, les petits laboratoires ou études sans fonds peuvent choisir de ne pas utiliser ces nouveaux outils puissants de génomique du paysage et des populations en raison des coûts de mise en œuvre du protocole (p. ex. les coûts des instruments spécialisés).
Ici, un protocole d’extraction d’ADN modifié est présenté qui utilise une étape d’extraction de perles magnétique similaire à celle de Neiman et al.1 pour obtenir de l’ADN de haute pureté, mais ne repose pas sur des instruments coûteux pour la lyse tissulaire et l’extraction de l’ADN. Ce protocole convient aux expériences nécessitant >10 ng d’ADN de haute qualité.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19077</td>
			<td>Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AL Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19075</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW1 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19081</td>
			<td>Washing buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW2 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19072</td>
			<td>Washing buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagAttract Suspension G</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1026901</td>
			<td>magnetic bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead separator</td>
			<td>Epigentek</td>
			<td>Q10002-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>microvolume spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PK Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4489111</td>
			<td>Proteinase K buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td>fluorometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a magnetic-bead-based mosquito dna extraction protocol for next-generation sequencing

Un protocole d’extraction de l’ADN récemment publié à l’aide de billes magnétiques et d’un instrument automatisé d’extraction de l’ADN suggère qu’il est possible d’extraire de l’ADN de haute qualité et en quantité d’un moustique individuel bien préservé suffisant pour le séquençage du génome entier en aval. Cependant, le recours à un instrument automatisé coûteux d’extraction de l’ADN peut être prohibitif pour de nombreux laboratoires. Ici, l’étude fournit un protocole d’extraction d’ADN à base de perles magnétiques économique, qui convient à un débit faible à moyen. Le protocole décrit ici a été testé avec succès à l’aide d’échantillons individuels de moustiques Aedes aegypti. La réduction des coûts associés à l’extraction de l’ADN de haute qualité augmentera l’application du séquençage à haut débit aux laboratoires et aux études aux ressources limitées.

Le rendement moyen en ADN par tissu de tête/thorax de moustique était de 4,121 ng/μL (N = 92, écart-type de 3,513) mesuré à l’aide d’un fluoromètre lorsqu’il était élué à l’aide de 100 μL de tampon d’élution. Ceci est suffisant pour les besoins d’entrée d’ADN génomique de 10 à 30 ng nécessaires à la construction de la bibliothèque de génomesentiers 1,7. La quantité d’ADN peut varier entre 0,3 et 29,7 ng/μL selon la taille cor...

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A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

Décrit ici est un protocole d’extraction d’ADN utilisant des perles magnétiques pour produire des extractions d’ADN de haute qualité à partir de moustiques. Ces extractions conviennent à une approche de séquençage de nouvelle génération en aval.

Un protocole d’extraction de l’ADN des moustiques à base de perles magnétiques pour le séquençage de nouvelle génération

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...

Ce protocole d’extraction d’ADN à base de perles magnétiques économique rend le séquençage à haut débit accessible aux laboratoires et aux études aux ressources limitées. Ce protocole ne nécessite pas d’équipement coûteux pour l’extraction de l’ADN de haute qualité et il peut être utile dans certaines situations de diagnostic ou de recherche où l’obtention d’une quantité suffisante d’ADN avec une qualité pour le séquençage à haut débit est difficile. Ce protocole est facile à répliquer avec une démonstration unique.Il doit d’abord être essayé avec un petit nombre d’échantillons pour se familiariser avec le flux de travail. Pour commencer, hydratez les échantillons de tissus de moustiques stockés dans plus de 70% d’alcool en ajoutant 100 microlitres d’eau de qualité PCR et en incubant pendant une heure à quatre degrés Celsius pour adoucir le tissu. Après l’incubation, jetez l’eau et ajoutez 100 microlitres de mélange d’enzymes tampon protéinase K.Ensuite, utilisez un pilon à tube microcentrifuge pour homogénéiser le tissu. Après homogénéisation, centrifuger le tissu lysat et incuber pendant deux à trois heures à 56 degrés Celsius. Pour extraire l’ADN, pipettez 100 microlitres du tissu lysat dans un nouveau tube de microcentrifugation propre.Ajoutez ensuite 215 microlitres du mélange maître de perles magnétiques. À l’aide d’une pipette, mélanger le lysat et le mélange de billes magnétiques pendant 10 à 20 secondes, puis le laisser reposer pendant 10 minutes à température ambiante. Pendant l’incubation, secouez doucement le tube de temps en temps pour maximiser la liaison de l’ADN aux perles magnétiques.Ensuite, placez le tube sur le séparateur de perles magnétiques jusqu’à ce que la solution devienne claire. Ensuite, à l’aide d’une pipette, aspirez doucement le liquide du tube sans perturber les perles magnétiques qui retiennent l’ADN. Éloignez le tube du séparateur de perles magnétiques et lavez les perles en ajoutant 325 microlitres de tampon de lavage.Bien mélanger par pipetage et incuber pendant une minute à température ambiante. Après l’incubation, placez le tube sur le séparateur de perles magnétiques et retirez le surnageant comme démontré précédemment, puis éloignez le tube du séparateur de perles magnétiques et lavez les perles une fois avec un tampon de lavage. Après le deuxième lavage avec tampon un, lavez les perles deux fois avec 250 microlitres de tampon de lavage deux de la même manière.Après le dernier lavage, éloignez le tube du séparateur de perles magnétiques et ajoutez 100 microlitres de tampon d’élution. Bien mélanger par pipetage puis incuber le tube pendant deux minutes à température ambiante avant de le remettre sur le séparateur magnétique. Lorsque la solution devient claire, transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifuge propre de 0,5 millilitre et le conserver de manière appropriée.Montré ici comme une lecture typique de fluoromètre de microvolume de l’ADN du moustique dans un tampon d’élution contenant 0,5 millimolaire EDTA. Le rapport d’absorbance moyen de 260 à 280 nanomètres est de 2,3. Ce tableau indique les coûts et le nombre d’échantillons traités en une journée ouvrable pour différentes méthodes d’extraction.Le coût typique du réactif et des consommables pour une extraction par ce protocole est d’environ 9,50 par échantillon. Ce coût est équivalent à n’importe quelle méthode d’extraction à base de billes magnétiques typique. Le principal avantage de ce protocole vient du fait qu’il n’est pas besoin de l’instrument automatisé d’extraction de l’ADN.Assurez-vous de changer les pointes de pipette entre les échantillons pour éviter la contamination croisée de l’ADN lorsque vous travaillez avec plusieurs échantillons. Nous utilisons l’ADN de haute qualité extrait à l’aide de cette méthode pour le séquençage du génome entier. Nous utilisons actuellement les données de séquençage pour identifier de nouvelles mutations dans la résistance aux insecticides ou les gènes immunitaires préoccupants en santé publique et en lutte contre les maladies.Disposer de solutions abordables pour le séquençage à haut débit ouvre des portes passionnantes pour la génomique des populations et la génomique du paysage visant à comprendre la dispersion des moustiques et le flux génétique, ce qui influence le succès de nombreuses nouvelles stratégies de contrôle génétique.

Research

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