Name: a magnetic-bead-based mosquito dna extraction protocol for next-generation sequencing
Uploaded: 2021-04-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

Wir danken für die finanzielle Unterstützung durch das Pacific Southwest Regional Center of Excellence for Vector-Borne Diseases, das von den U.S. Centers for Disease Control and Prevention (Cooperative Agreement 1U01CK000516), cdc grant NU50CK000420-04-04,04, dem USDA National Institute of Food and Agriculture (Hatch project 1025565), UF/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory Fellowship an Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC Phase II Grant (AWD05009_MOD0030) und Florida Department of Health (Contract CODQJ) finanziert wird. Die Ergebnisse und Schlussfolgerungen in diesem Artikel sind die des Autors /der Autoren und geben nicht unbedingt die Ansichten des U.S. Fish and Wildlife Service an.

1. Allgemeine Probenlagerung und Vorbereitung vor der DNA-Extraktion
<ol><li>Hydratisieren Sie die Probe in 100 μL PCR-Wasser für 1 h (oder über Nacht) bei 4 °C, wenn die Probe in >70% Alkohol gelagert wurde, um das Gewebe weicher zu machen.</li>
</ol>2. Unterbrechung der Probe
<ol><li>Stellen Sie einen Inkubator oder Schüttelwärmeblock auf 56 °C ein.</li>
	<li>Machen Sie Proteinase K (PK) Puffer / Enzym-Mix. Für jede einzelne Mückenextraktion werden 2 μL Proteinase K (100 mg/ml) und...

<ol>
	<li>Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+extraction+protocol+for+improved+DNA+yield+from+individual+mosquitoes.">A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes.</a> F1000Research. 4, 1314 (2015).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+divergence+among+invasive+populations+of+Aedes+aegypti+in+California.">Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California.</a> BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance+of+conserved+CRISPR-Cas9+target+sites+within+the+highly+polymorphic+genomes+of+Anopheles+and+Aedes+mosquitoes.">Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes.</a> Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcontinental+dispersal+of+Anopheles+gambiae+occurred+from+West+African+origin+via+serial+founder+events.">Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events.</a> Communications Biology. 2, 473 (2019).</li><li>Norris, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+introgression+in+an+African+malaria+mosquito+coincident+with+the+increased+usage+of+insecticide-treated+bed+nets.">Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).</li><li>Main, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+of+host+preference+and+resting+behavior+in+the+major+african+malaria+vector,+Anopheles+arabiensis.">The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis.</a> Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).</li><li>Yamasaki, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+genomic+DNA+library+construction+of+small+insects.">Improved tools for genomic DNA library construction of small insects.</a> F1000Research. 5, 211 (2016).</li><li>Tabuloc, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+of+Tuta+absoluta+genome+to+develop+SNP+genotyping+assays+for+species+identification.">Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification.</a> Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).</li><li>Campos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+mitogenome+sequence+of+Anopheles+coustani+from+S&#227;o+Tom&#233;+island.">Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from S&#227;o Tom&#233; island.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).</li><li>Cornel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+mitogenome+sequences+of+Aedes+(Howardina)+busckii+and+Aedes+(Ochlerotatus)+taeniorhynchus+from+the+Caribbean+Island+of+Saba.">Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).</li><li>Lucena-Aguilar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+source+selection+for+downstream+applications+based+on+dna+quality+indicators+analysis.">DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis.</a> Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).</li></ol>

Das hier beschriebene Protokoll kann für andere Insektenarten angepasst werden. Die ursprüngliche Version des in Nieman et al.1 eingeführten Protokolls wurde an mehreren Arten getestet, darunter Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta und Keifer...

Die jüngste Entwicklung eines verbesserten DNA-Extraktionsprotokolls1 hat viele hochwirbende nachgelagerte Studien mit der Sequenzierung des gesamten Genoms2,3,4,5,6ermöglicht. Dieses auf magnetischen Perlen basierende DNA-Extraktionsprotokoll bietet eine zuverlässige DNA-Ausbeute aus einzelnen Mückenproben, was wiederum die Kosten und den Zeitaufwand reduziert, die mit der Gewinnung einer ausreichenden Anzahl von Proben aus Feldsammlungen verbunden sind.
Jüngste Fortschritte in der Populations- und Landschaftsgenomik stehen in direktem Zusammenhang mit sinkenden Kosten für die Sequenzierung des gesamten Genoms. Obwohl das vorherige DNA-Extraktionsprotokoll1 die Effizienz im Zusammenhang mit der Hochdurchsatzsequenzierung erhöht, können kleinere Labore / Studien ohne die Mittel die Verwendung dieser neuen leistungsstarken Landschafts- und Populationsgenomik-Tools aufgrund der Kosten für die Implementierung des Protokolls (z. B. Kosten für spezialisierte Instrumente) ablehnen.
Hier wird ein modifiziertes DNA-Extraktionsprotokoll vorgestellt, das einen ähnlichen magnetischen Perlenextraktionsschritt wie Neiman et al.1 verwendet, um hochreine DNA zu erhalten, aber nicht auf kostenintensive Instrumente für die Gewebelyse und DNA-Extraktion angewiesen ist. Dieses Protokoll eignet sich für Experimente, die >10 ng hochwertiger DNA erfordern.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19077</td>
			<td>Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AL Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19075</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW1 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19081</td>
			<td>Washing buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW2 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19072</td>
			<td>Washing buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagAttract Suspension G</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1026901</td>
			<td>magnetic bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead separator</td>
			<td>Epigentek</td>
			<td>Q10002-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>microvolume spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PK Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4489111</td>
			<td>Proteinase K buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td>fluorometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a magnetic-bead-based mosquito dna extraction protocol for next-generation sequencing

Ein kürzlich veröffentlichtes DNA-Extraktionsprotokoll mit magnetischen Perlen und einem automatisierten DNA-Extraktionsinstrument deutete darauf hin, dass es möglich ist, qualitativ hochwertige und quantitativ DNA aus einer gut erhaltenen einzelnen Mücke zu extrahieren, die für die nachgelagerte Sequenzierung des gesamten Genoms ausreicht. Die Abhängigkeit von einem teuren automatisierten DNA-Extraktionsinstrument kann jedoch für viele Labore unerschwinglich sein. Hier liefert die Studie ein budgetfreundliches magnetperlenbasiertes DNA-Extraktionsprotokoll, das für niedrigen bis mittleren Durchsatz geeignet ist. Das hier beschriebene Protokoll wurde erfolgreich mit einzelnen Aedes aegypti Mückenproben getestet. Die reduzierten Kosten, die mit einer qualitativ hochwertigen DNA-Extraktion verbunden sind, werden die Anwendung der Hochdurchsatzsequenzierung in ressourcenbeschmierten Laboren und Studien erhöhen.

Die durchschnittliche DNA-Ausbeute pro einzelnem Mückenkopf/Thoraxgewebe betrug 4,121 ng/μL (N = 92, Standardabweichung 3,513), gemessen mit einem Fluorometer, wenn es mit 100 μL Elutionspuffer eluiert wurde. Dies ist ausreichend für die 10-30 ng genomischen DNA-Eingangsanforderungen, die für den Aufbau der gesamten Genombibliothek erforderlich sind1,7. Die Menge an DNA kann zwischen 0,3-29,7 ng / μL variieren, abhängig von der Körpergröße der Mücke un...

Watch this Scientific Journal Video about A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

Hier wird ein DNA-Extraktionsprotokoll mit magnetischen Perlen beschrieben, um qualitativ hochwertige DNA-Extraktionen aus Moskitos herzustellen. Diese Extraktionen eignen sich für einen nachgelagerten Next-Generation-Sequencing-Ansatz.

Ein magnetperlenbasiertes Moskito-DNA-Extraktionsprotokoll für die Sequenzierung der nächsten Generation

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...

Dieses budgetfreundliche DNA-Extraktionsprotokoll auf Basis magnetischer Perlen macht die Sequenzierung mit hohem Durchsatz für ressourcenbeschmierte Labore und Studien zugänglich. Dieses Protokoll erfordert keine teure Ausrüstung für eine qualitativ hochwertige DNA-Extraktion und kann in bestimmten Diagnose- oder Forschungssituationen hilfreich sein, in denen es schwierig ist, eine ausreichende Menge an DNA mit einer Qualität für die Hochdurchsatzsequenzierung zu erhalten. Dieses Protokoll ist mit einer einmaligen Demonstration einfach zu replizieren.Es sollte zuerst mit einer kleinen Anzahl von Beispielen versucht werden, um sich mit dem Workflow vertraut zu machen. Hydratisieren Sie zunächst die in mehr als 70% Alkohol gelagerten Mückengewebeproben, indem Sie 100 Mikroliter PCR-Wasser hinzufügen und eine Stunde lang bei vier Grad Celsius inkubieren, um das Gewebe zu erweichen. Nach der Inkubation das Wasser entsorgen und 100 Mikroliter Proteinase K Pufferenzymmischung hinzufügen.Verwenden Sie dann einen Mikrozentrifugenschlauchstößel, um das Gewebe zu homogenisieren. Nach der Homogenisierung zentrifugieren Sie das Gewebelysat und inkubieren Sie es zwei bis drei Stunden bei 56 Grad Celsius. Um DNA zu extrahieren, pipetten Sie 100 Mikroliter des Gewebelysats in ein neues sauberes Mikrozentrifugenröhrchen.Fügen Sie dann 215 Mikroliter der magnetischen Perlen-Mastermischung hinzu. Mischen Sie mit einer Pipette das Lysat und das magnetische Perlengemisch für 10 bis 20 Sekunden und lassen Sie es dann 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Schütteln Sie das Röhrchen während der Inkubation gelegentlich sanft, um die Bindung der DNA an die magnetischen Perlen zu maximieren.Als nächstes legen Sie das Röhrchen auf den magnetischen Perlenabscheider, bis die Lösung klar ist. Dann mit einer Pipette die Flüssigkeit vorsichtig aus dem Röhrchen absaugen, ohne die magnetischen Perlen zu stören, die die DNA halten. Bewegen Sie das Röhrchen vom magnetischen Perlenabscheider weg und waschen Sie die Perlen, indem Sie 325 Mikroliter Waschpuffer eins hinzufügen.Durch Pipettieren gründlich mischen und eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie nach der Inkubation das Röhrchen auf den magnetischen Perlenabscheider und entfernen Sie den Überstand, wie zuvor gezeigt, bewegen Sie dann das Rohr vom Magnetperlenabscheider weg und waschen Sie die Perlen einmal mit einem Waschpuffer. Nach der zweiten Wäsche mit Puffer eins waschen Sie die Perlen zweimal mit 250 Mikrolitern Waschpuffer zwei auf die gleiche Weise.Nach der letzten Wäsche bewegen Sie das Röhrchen vom magnetischen Perlenabscheider weg und fügen Sie 100 Mikroliter Elutionspuffer hinzu. Mischen Sie das Röhrchen gründlich durch Pipettieren und inkubieren Sie es dann zwei Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie es wieder auf den Magnetabscheider legen. Wenn die Lösung klar ist, den Überstand in ein neues, sauberes 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen geben und entsprechend lagern.Hier als typische Mikrovolumenfluorometer-Ablesung der Mücken-DNA in einem Elutionspuffer mit 0,5 Millimolar-EDTA dargestellt. Das durchschnittliche Absorptionsverhältnis von 260 bis 280 Nanometern beträgt 2,3. Diese Tabelle zeigt die Kosten und die Anzahl der an einem Arbeitstag verarbeiteten Proben für verschiedene Extraktionsmethoden.Die typischen Reagenzien- und Verbrauchsmaterialkosten für eine Extraktion nach diesem Protokoll betragen etwa 9,50 pro Probe. Diese Kosten entsprechen jeder typischen Extraktionsmethode auf Basis magnetischer Perlen. Der größte Kostenvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass das automatisierte DNA-Extraktionsinstrument nicht erforderlich ist.Stellen Sie sicher, dass Sie die Pipettenspitzen zwischen den Proben wechseln, um eine Kreuzkontamination der DNA bei der Arbeit mit mehreren Proben zu vermeiden. Wir verwenden die hochwertige DNA, die mit dieser Methode extrahiert wird, für die Sequenzierung des gesamten Genoms. Wir verwenden derzeit die Sequenzierungsdaten, um neuartige Mutationen in Insektizidresistenzen oder Immungenen zu identifizieren, die für die öffentliche Gesundheit und Krankheitskontrolle von Belang sind.Erschwingliche Lösungen für die Hochdurchsatzsequenzierung öffnen aufregende Türen für die Populationsgenomik und Landschaftsgenomik, die darauf abzielen, die Ausbreitung von Moskitos und den Genfluss zu verstehen, was den Erfolg vieler neuartiger genetischer Kontrollstrategien beeinflusst.

Research

JoVE Journal

Biology

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

Protokoll für Mosquito Aufzucht (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Forschung

Biologie

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Fluoreszenz-Mikroskopie Screening und Next-Generation-Sequencing: Nützliche Tools für die Identifizierung von Genen in den Organellen Integrität beteiligt

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Next-Generation-Sequenzierung der ribosomalen 16S-RNA Gene Amplikons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Gezielte DNA Methylierungsanalyse von Next-Generation-Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interaktom-Seq: Ein Protokoll zur Domainome Bibliotheksbau, Validierung und Auswahl von Phagen-Display und Next Generation Sequencing

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Tick Microbiome Charakterisierung von Next-Generation-16 s rRNA Amplikons Sequenzierung

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Mikrobiota-Analyse mit zweistufiger PCR- und 16S-rRNA-Gensequenzierung der nächsten Generation

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Creating Robust Bisulfite-mRNA Libraries for Transcriptome-Wide Mapping

Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing

Decoding RNA Methylation's Role in Pancreatic Cancer - A Single-Base Resolution Study (Video) | JoVE

Anreicherung von mRNA- und Bisulfit-mRNA-Bibliotheksvorbereitung für Next-Generation-Sequencing

RNA post-transcriptional modifications in various types of RNA transcripts are associated with diverse RNA regulation in eukaryotic cells. Aberrant RNA ...