Name: a magnetic-bead-based mosquito dna extraction protocol for next-generation sequencing
Uploaded: 2021-04-15T14:00:00
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हम वेक्टर जनित रोगों के लिए उत्कृष्टता के प्रशांत दक्षिण पश्चिम क्षेत्रीय केंद्र से धन समर्थन स्वीकार रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए अमेरिका के केंद्रों द्वारा वित्त पोषित (सहकारी समझौता 1U01CK000516), सीडीसी अनुदान NU50CK000420-04-04, USDA राष्ट्रीय खाद्य और कृषि संस्थान (हैच परियोजना 1025565), UF/IFAS फ्लोरिडा मेडिकल कीट विज्ञान प्रयोगशाला फैलोशिप TSE-यू चेन, NSF CAMTech IUCRC चरण द्वितीय अनुदान (AWD05009_MOD0030), और फ्लोरिडा स्वास्थ्य विभाग (अनुबंध CODQJ) । इस लेख में निष्कर्ष और निष्कर्ष लेखक (ओं) के हैं और जरूरी नहीं कि अमेरिकी मछली और वन्यजीव सेवा के विचारों का प्रतिनिधित्व करें।

1. सामान्य नमूना भंडारण और डीएनए निष्कर्षण से पहले तैयारी
<ol><li>यदि ऊतक को नरम करने के लिए नमूना को 1 घंटे (या रात भर) 4 डिग्री सेल्सियस पर 100 माइक्रोन पीसीआर-ग्रेड पानी > में हाइड्रेट करें।</li>
</ol>2. नमूना ?...

<ol>
	<li>Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+extraction+protocol+for+improved+DNA+yield+from+individual+mosquitoes.">A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes.</a> F1000Research. 4, 1314 (2015).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+divergence+among+invasive+populations+of+Aedes+aegypti+in+California.">Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California.</a> BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance+of+conserved+CRISPR-Cas9+target+sites+within+the+highly+polymorphic+genomes+of+Anopheles+and+Aedes+mosquitoes.">Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes.</a> Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcontinental+dispersal+of+Anopheles+gambiae+occurred+from+West+African+origin+via+serial+founder+events.">Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events.</a> Communications Biology. 2, 473 (2019).</li><li>Norris, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+introgression+in+an+African+malaria+mosquito+coincident+with+the+increased+usage+of+insecticide-treated+bed+nets.">Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).</li><li>Main, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+of+host+preference+and+resting+behavior+in+the+major+african+malaria+vector,+Anopheles+arabiensis.">The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis.</a> Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).</li><li>Yamasaki, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+genomic+DNA+library+construction+of+small+insects.">Improved tools for genomic DNA library construction of small insects.</a> F1000Research. 5, 211 (2016).</li><li>Tabuloc, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+of+Tuta+absoluta+genome+to+develop+SNP+genotyping+assays+for+species+identification.">Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification.</a> Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).</li><li>Campos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+mitogenome+sequence+of+Anopheles+coustani+from+S&#227;o+Tom&#233;+island.">Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from S&#227;o Tom&#233; island.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).</li><li>Cornel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+mitogenome+sequences+of+Aedes+(Howardina)+busckii+and+Aedes+(Ochlerotatus)+taeniorhynchus+from+the+Caribbean+Island+of+Saba.">Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).</li><li>Lucena-Aguilar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+source+selection+for+downstream+applications+based+on+dna+quality+indicators+analysis.">DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis.</a> Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).</li></ol>

यहां वर्णित प्रोटोकॉल को अन्य कीट प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। निमैन एट अल में पेश किए गए प्रोटोकॉल के मूल संस्करण का परीक्षण कई प्रजातियों पर किया गयाहै, जिनमें एडीज एजिप्टी,...

बेहतर डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल1 के हालिया विकास ने कई उच्च प्रभाव वाले डाउनस्ट्रीम अध्ययनों की अनुमति दी है जिसमें संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण 2 ,3,4,5,6शामिल हैं । यह चुंबकीय मनका आधारित डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल व्यक्तिगत मच्छर नमूनों से विश्वसनीय डीएनए उपज प्रदान करता है, जो बदले में क्षेत्र संग्रह से पर्याप्त संख्या में नमूने प्राप्त करने से जुड़े लागत और समय को कम करता है।
जनसंख्या और परिदृश्य जीनोमिक्स में हाल की प्रगति सीधे पूरे जीनोम अनुक्रमण की घटती लागत के साथ सहसंबद्ध हैं। हालांकि पिछले डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल1 उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के साथ जुड़े क्षमता बढ़ जाती है, छोटे प्रयोगशालाओं/धन के बिना अध्ययन प्रोटोकॉल को लागू करने की लागत के कारण इन नए शक्तिशाली परिदृश्य और जनसंख्या जीनोमिक्स उपकरणों का उपयोग करने से बाहर निकलना हो सकता है (जैसे, विशेष उपकरणों की लागत) ।
यहां, एक संशोधित डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है जो उच्च शुद्धता डीएनए प्राप्त करने के लिए Neiman एट अलके रूप में एक समान चुंबकीय मनका निष्कर्षण कदम का उपयोग करता है, लेकिन ऊतक लाइसिस और डीएनए निष्कर्षण के लिए उच्च लागत वाले उपकरणों पर भरोसा नहीं करता है। यह प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए के >10 एनजी की आवश्यकता वाले प्रयोगों के लिए उपयुक्त है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19077</td>
			<td>Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AL Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19075</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW1 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19081</td>
			<td>Washing buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW2 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19072</td>
			<td>Washing buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagAttract Suspension G</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1026901</td>
			<td>magnetic bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead separator</td>
			<td>Epigentek</td>
			<td>Q10002-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>microvolume spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PK Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4489111</td>
			<td>Proteinase K buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td>fluorometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a magnetic-bead-based mosquito dna extraction protocol for next-generation sequencing

चुंबकीय मोतियों और एक स्वचालित डीएनए निष्कर्षण उपकरण का उपयोग करके हाल ही में प्रकाशित डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल ने सुझाव दिया कि डाउनस्ट्रीम पूरे जीनोम अनुक्रमण के लिए पर्याप्त एक अच्छी तरह से संरक्षित व्यक्तिगत मच्छर से उच्च गुणवत्ता और मात्रा डीएनए निकालना संभव है। हालांकि, एक महंगे स्वचालित डीएनए निष्कर्षण उपकरण पर निर्भरता कई प्रयोगशालाओं के लिए निषेधात्मक हो सकती है। यहां यह अध्ययन बजट के अनुकूल चुंबकीय-मनका आधारित डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल प्रदान करता है, जो कम से मध्यम थ्रूपुट के लिए उपयुक्त है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल का व्यक्तिगत एडीज एजिप्टी मच्छर के नमूनों का उपयोग करके सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया । उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए निष्कर्षण से जुड़ी कम लागत संसाधन सीमित प्रयोगशालाओं और अध्ययनों के लिए उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के आवेदन में वृद्धि होगी।

प्रति व्यक्ति मच्छर सिर/छाती ऊतक औसत डीएनए उपज ४.१२१ एनजी/μL (एन = ९२, मानक विचलन ३.५१३) एक फ्लोरोमीटर का उपयोग कर मापा गया था जब elution बफर के १०० μL का उपयोग कर eluted । यह संपूर्ण जीनोम पुस्तकालयनिर्माण1,<...

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A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

यहां वर्णित मच्छरों से उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए निष्कर्षण का उत्पादन करने के लिए चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके एक डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल है। ये निष्कर्षण एक डाउनस्ट्रीम अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोण के लिए उपयुक्त हैं।

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए एक चुंबकीय-मनका आधारित मच्छर डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...

यह बजट के अनुकूल चुंबकीय मनका आधारित डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण संसाधन सीमित प्रयोगशालाओं और अध्ययनों के लिए सुलभ बनाता है । इस प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए निष्कर्षण के लिए महंगे उपकरणों की आवश्यकता नहीं है और यह कुछ नैदानिक या अनुसंधान स्थितियों में सहायक हो सकता है जहां उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए गुणवत्ता के साथ डीएनए की पर्याप्त मात्रा प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल को एक बार प्रदर्शन के साथ दोहराने के लिए आसान है।वर्कफ्लो से परिचित होने के लिए पहले नमूनों की एक छोटी संख्या के साथ यह कोशिश की जानी चाहिए। शुरू करने के लिए, पीसीआर ग्रेड पानी के 100 माइक्रोलीटर जोड़कर 70% से अधिक अल्कोहल में संग्रहित मच्छर ऊतक नमूनों को हाइड्रेट करें और ऊतक को नरम करने के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए इनक्यूबेटिंग करें। इनक्यूबेशन के बाद पानी को त्याग दें और इसमें प्रोटीनेज के बफर एंजाइम मिक्स के 100 माइक्रोलीटर डालें।फिर ऊतक को समरूप बनाने के लिए माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब मूसल का उपयोग करें। समरूपता के बाद, ऊतक को 56 डिग्री सेल्सियस पर दो से तीन घंटे तक और थोड़ा-स करते हैं। डीएनए निकालने के लिए, ऊतक के पिपेट 100 माइक्रोलीटर एक नई स्वच्छ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में बदल जाते हैं।इसके बाद इसमें मैग्नेटिक मनका मास्टर मिक्स के 215 माइक्रोलीटर डालें। एक पिपेट का उपयोग करके, लिसेट और चुंबकीय मोतियों के मिश्रण को 10 से 20 सेकंड के लिए मिलाएं, फिर इसे कमरे के तापमान पर 10 मिनट तक खड़े रहने दें। इनक्यूबेशन के दौरान, चुंबकीय मोतियों के लिए डीएनए के बाध्यकारी को अधिकतम करने के लिए कभी-कभी ट्यूब को धीरे-धीरे हिलाएं।इसके बाद, ट्यूब को चुंबकीय मनका विभाजक पर तब तक रखें जब तक कि समाधान स्पष्ट न हो जाए। फिर एक पिपेट का उपयोग करके, डीएनए को पकड़े चुंबकीय मोतियों को परेशान किए बिना ट्यूब से तरल को धीरे से एस्पिरेट करें। ट्यूब को चुंबकीय मनका विभाजक से दूर ले जाएं और बफर एक धोने के 325 माइक्रोलीटर जोड़कर मोतियों को धोएं।कमरे के तापमान पर एक मिनट के लिए पाइपिंग और इनक्यूबेट करके अच्छी तरह से मिलाएं। इनक्यूबेशन के बाद, ट्यूब को चुंबकीय मनका विभाजक पर रखें और पहले के रूप में प्रदर्शित सुपरनैंट को हटा दें, फिर ट्यूब को चुंबकीय मनका विभाजक से दूर ले जाएं और एक बार बफर को धोने के साथ मोतियों को धोएं। बफर वन के साथ दूसरा धोने के बाद, मोतियों को एक ही तरीके से दो तरह से धोने वाले बफर के 250 माइक्रोलीटर के साथ दो बार धोएं।आखिरी वॉश के बाद ट्यूब को मैग्नेटिक मनका सेपरेटर से दूर ले जाएं और एल्यूशन बफर के 100 माइक्रोलीटर डालें। पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं और फिर ट्यूब को चुंबकीय विभाजक पर वापस रखने से पहले कमरे के तापमान पर दो मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। जब समाधान स्पष्ट हो जाता है, तो सुपरनिटेंट को एक नए, स्वच्छ 0.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और उचित रूप से स्टोर करें।यहां 0.5 मिलीमोलर ईडीटीए वाले एल्यूशन बफर में मच्छर डीएनए के एक विशिष्ट माइक्रोवोल्ट फ्लोरोमीटर पढ़ने के रूप में दिखाया गया है। औसत 260 से 280 नैनोमीटर अवशोषण अनुपात 2.3 है। यह तालिका विभिन्न निष्कर्षण विधियों के लिए एक कार्य दिवस में संसाधित नमूनों की लागत और संख्या को दर्शाती है।इस प्रोटोकॉल द्वारा निष्कर्षण के लिए विशिष्ट अभिकर्मक और उपभोग्य लागत प्रति नमूना लगभग 9.50 है। यह लागत किसी भी विशिष्ट चुंबकीय मनका आधारित निष्कर्षण विधि के बराबर है। इस प्रोटोकॉल का प्रमुख लागत लाभ स्वचालित डीएनए निष्कर्षण उपकरण की आवश्यकता नहीं से आता है।कई नमूनों के साथ काम करते समय डीएनए के क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए नमूनों के बीच पिपेट युक्तियां बदलना सुनिश्चित करें। हम पूरे जीनोम अनुक्रमण के लिए इस विधि का उपयोग कर निकाले गए उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए का उपयोग करते हैं। वर्तमान में हम अनुक्रमण डेटा का उपयोग कर रहे है कीटनाशक प्रतिरोध या सार्वजनिक स्वास्थ्य और रोग नियंत्रण में चिंता की प्रतिरक्षा जीन में उपंयास उत्परिवर्तन की पहचान ।उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए किफायती समाधान होने से मच्छर फैलाव और जीन प्रवाह को समझने के उद्देश्य से जनसंख्या जीनोमिक्स और लैंडस्केप जीनोमिक्स के लिए रोमांचक दरवाजे खुलते हैं जो कई उपन्यास आनुवंशिक नियंत्रण रणनीतियों की सफलता को प्रभावित करते हैं।

Research

JoVE Journal

Biology

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