Name: a magnetic-bead-based mosquito dna extraction protocol for next-generation sequencing
Uploaded: 2021-04-15T14:00:00
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Riconosciamo il sostegno finanziario del Pacific Southwest Regional Center of Excellence for Vector-Borne Diseases finanziato dai Centri statunitensi per il controllo e la prevenzione delle malattie (Accordo di cooperazione 1U01CK000516), sovvenzione CDC NU50CK000420-04-04, l'USDA National Institute of Food and Agriculture (Hatch project 1025565), la borsa di studio UF/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory a Tse-Yu Chen, la sovvenzione NSF CAMTech IUCRC Phase II (AWD05009_MOD0030) e il Florida Department of Health (Contract CODQJ). I risultati e le conclusioni di questo articolo sono quelli dell'autore o degli autori e non rappresentano necessariamente le opinioni del Servizio pesce e fauna selvatica degli Stati Uniti.

1. Conservazione generale del campione e preparati prima dell'estrazione del DNA
<ol><li>Idratare il campione in acqua pcr da 100 μL per 1 h (o durante la notte) a 4 °C se il campione è stato conservato in alcool >70% per ammorbidire il tessuto.</li>
</ol>2. Interruzione del campione
<ol><li>Impostare un incubatore o un blocco termico a tremante a 56 °C.</li>
	<li>Fare proteinasi K (PK) tampone/enzima miscela. Per ogni singola estrazione di zanzare sono necessari 2 μL di Proteinasi K (100...

<ol>
	<li>Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+extraction+protocol+for+improved+DNA+yield+from+individual+mosquitoes.">A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes.</a> F1000Research. 4, 1314 (2015).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+divergence+among+invasive+populations+of+Aedes+aegypti+in+California.">Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California.</a> BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance+of+conserved+CRISPR-Cas9+target+sites+within+the+highly+polymorphic+genomes+of+Anopheles+and+Aedes+mosquitoes.">Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes.</a> Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcontinental+dispersal+of+Anopheles+gambiae+occurred+from+West+African+origin+via+serial+founder+events.">Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events.</a> Communications Biology. 2, 473 (2019).</li><li>Norris, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+introgression+in+an+African+malaria+mosquito+coincident+with+the+increased+usage+of+insecticide-treated+bed+nets.">Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).</li><li>Main, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+of+host+preference+and+resting+behavior+in+the+major+african+malaria+vector,+Anopheles+arabiensis.">The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis.</a> Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).</li><li>Yamasaki, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+genomic+DNA+library+construction+of+small+insects.">Improved tools for genomic DNA library construction of small insects.</a> F1000Research. 5, 211 (2016).</li><li>Tabuloc, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+of+Tuta+absoluta+genome+to+develop+SNP+genotyping+assays+for+species+identification.">Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification.</a> Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).</li><li>Campos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+mitogenome+sequence+of+Anopheles+coustani+from+S&#227;o+Tom&#233;+island.">Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from S&#227;o Tom&#233; island.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).</li><li>Cornel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+mitogenome+sequences+of+Aedes+(Howardina)+busckii+and+Aedes+(Ochlerotatus)+taeniorhynchus+from+the+Caribbean+Island+of+Saba.">Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).</li><li>Lucena-Aguilar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+source+selection+for+downstream+applications+based+on+dna+quality+indicators+analysis.">DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis.</a> Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).</li></ol>

Il protocollo qui descritto può essere adattato per altre specie di insetti. La versione originale del protocollo introdotto in Nieman etal. An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta e Keiferia lycopersicella2,8,9,<sup cla...

Il recente sviluppo di un protocollo di estrazione del DNAmigliorato 1 ha permesso molti studi a valle ad alto impatto che coinvolgono il sequenziamento dell'interogenoma 2,3,4,5,6. Questo protocollo di estrazione del DNA basato su perline magnetiche fornisce una resa affidabile del DNA da singoli campioni di zanzara, che a sua volta riduce il costo e il tempo associati all'acquisizione di un numero sufficiente di campioni dalle raccolte sul campo.
I recenti progressi nella genomica della popolazione e del paesaggio sono direttamente correlati con la diminuzione dei costi del sequenziamento dell'intero genoma. Sebbene il precedente protocollo di estrazione del DNA1 aumenti l'efficienza associata al sequenziamento ad alta produttività, laboratori / studi più piccoli senza i fondi possono scegliere di non utilizzare questi nuovi potenti strumenti genomici per il paesaggio e la popolazione a causa dei costi di implementazione del protocollo (ad esempio, i costi degli strumenti specializzati).
Qui viene presentato un protocollo di estrazione del DNA modificato che utilizza una fase di estrazione del tallone magnetico simile a Quella di Neiman etal. Questo protocollo è adatto per esperimenti che richiedono >10 ng di DNA di alta qualità.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19077</td>
			<td>Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AL Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19075</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW1 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19081</td>
			<td>Washing buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW2 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19072</td>
			<td>Washing buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagAttract Suspension G</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1026901</td>
			<td>magnetic bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead separator</td>
			<td>Epigentek</td>
			<td>Q10002-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>microvolume spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PK Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4489111</td>
			<td>Proteinase K buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td>fluorometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a magnetic-bead-based mosquito dna extraction protocol for next-generation sequencing

Un protocollo di estrazione del DNA recentemente pubblicato che utilizza perline magnetiche e uno strumento automatizzato di estrazione del DNA hanno suggerito che è possibile estrarre DNA di alta qualità e quantità da una zanzara individuale ben conservata sufficiente per il sequenziamento dell'intero genoma a valle. Tuttavia, la dipendenza da un costoso strumento automatizzato di estrazione del DNA può essere proibitiva per molti laboratori. Qui, lo studio fornisce un protocollo di estrazione del DNA basato su perline magnetiche budget-friendly, adatto per una produttività da bassa a media. Il protocollo qui descritto è stato testato con successo utilizzando singoli campioni di zanzare Aedes aegypti. La riduzione dei costi associati all'estrazione del DNA di alta qualità aumenterà l'applicazione del sequenziamento ad alta produttività a laboratori e studi limitati alle risorse.

La resa media del DNA per singolo tessuto testa di zanzara/torace era di 4,121 ng/μL (N = 92, deviazione standard 3.513) misurata utilizzando un fluorometro se eluita utilizzando 100 μL di tampone di eluizione. Questo è sufficiente per i requisiti di input di DNA genomico da 10-30 ng necessari per la costruzione dell'intera libreriadel genoma 1,7. La quantità di DNA può variare tra 0,3-29,7 ng / μL a seconda delle dimensioni del corpo della zanzara e delle ...

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A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

Qui descritto è un protocollo di estrazione del DNA che utilizza perline magnetiche per produrre estrazioni di DNA di alta qualità dalle zanzare. Queste estrazioni sono adatte per un approccio di sequenziamento di nuova generazione a valle.

Un protocollo di estrazione del DNA delle zanzare a base di perline magnetiche per il sequenziamento di nuova generazione

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...

Questo protocollo di estrazione del DNA basato su perline magnetiche a basso budget rende il sequenziamento ad alta produttività accessibile a laboratori e studi limitati alle risorse. Questo protocollo non richiede apparecchiature costose per l'estrazione del DNA di alta qualità e può essere utile in determinate situazioni diagnostiche o di ricerca in cui ottenere una quantità sufficiente di DNA con una qualità per il sequenziamento ad alta produttività è impegnativo. Questo protocollo è facile da replicare con una dimostrazione una sola volta.Dovrebbe essere provato prima con un piccolo numero di campioni per familiarizzare con il flusso di lavoro. Per iniziare, idratare i campioni di tessuto di zanzara conservati in più del 70% di alcol aggiungendo 100 microlitri di acqua di grado PCR e incubando per un'ora a quattro gradi Celsius per ammorbidire il tessuto. Dopo l'incubazione, scartare l'acqua e aggiungere 100 microlitri di miscela enzimatica tampone Proteinasi K.Quindi utilizzare un pestello del tubo di microcentrifugo per omogeneizzare il tessuto. Dopo l'omogeneizzazione, centrifugare il lisato tissutale e incubare per due o tre ore a 56 gradi Celsius. Per estrarre il DNA, pipettare 100 microlitri del tessuto si lisce in un nuovo tubo di microcentrifugo pulito.Quindi aggiungere 215 microlitri del mix di master perline magnetiche. Utilizzando una pipetta, mescolare il lisato e la miscela di perline magnetiche per 10-20 secondi, quindi lasciarlo riposare per 10 minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, agitare delicatamente il tubo di tanto in tanto per massimizzare il legame del DNA alle perline magnetiche.Quindi, posizionare il tubo sul separatore magnetico delle perline fino a quando la soluzione non diventa chiara. Quindi, utilizzando una pipetta, aspirare delicatamente il liquido dal tubo senza disturbare le perline magnetiche che tengono il DNA. Allontanare il tubo dal separatore magnetico delle perline e lavare le perline aggiungendo 325 microlitri di tampone di lavaggio uno.Mescolare accuratamente con pipettazione e incubare per un minuto a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, posizionare il tubo sul separatore magnetico delle perline e rimuovere il supernatante come precedentemente dimostrato, quindi allontanare il tubo dal separatore magnetico delle perline e lavare le perline una volta con il tampone di lavaggio uno. Dopo il secondo lavaggio con tampone uno, lavare le perline due volte con 250 microlitri di tampone di lavaggio due nello stesso modo.Dopo l'ultimo lavaggio, allontanare il tubo dal separatore magnetico delle perline e aggiungere 100 microlitri di tampone di eluizione. Mescolare accuratamente con pipettazione e quindi incubare il tubo per due minuti a temperatura ambiente prima di riposizionare sul separatore magnetico. Quando la soluzione diventa chiara, trasferire il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifugo da 0,5 millilitri pulito e conservare in modo appropriato.Mostrato qui come una tipica lettura del fluorometro a microvolume del DNA della zanzara in un tampone di eluizione contenente EDTA da 0,5 millimolare. Il rapporto medio di assorbanza da 260 a 280 nanometri è di 2,3. Questa tabella mostra i costi e il numero di campioni elaborati in un giorno lavorativo per diversi metodi di estrazione.Il tipico costo del reagente e dei materiali di consumo per un'estrazione da parte di questo protocollo è di circa 9,50 per campione. Questo costo è equivalente a qualsiasi metodo tipico di estrazione a base di perline magnetiche. Il principale vantaggio in termini di costi di questo protocollo deriva dal fatto che non è necessario lo strumento di estrazione automatica del DNA.Assicurarsi di cambiare le punte delle pipette tra i campioni per prevenire la contaminazione incrociata del DNA quando si lavora con più campioni. Usiamo il DNA di alta qualità estratto usando questo metodo per il sequenziamento dell'intero genoma. Attualmente stiamo utilizzando i dati di sequenziamento per identificare nuove mutazioni nella resistenza agli insetticidi o geni immunitari che desta preoccupazione nella salute pubblica e nel controllo delle malattie.Avere soluzioni convenienti per il sequenziamento ad alta produttività apre porte entusiasmanti per la genomica della popolazione e la genomica del paesaggio volte a comprendere la dispersione delle zanzare e il flusso genico che influenza il successo di molte nuove strategie di controllo genetico.

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