Name: a magnetic-bead-based mosquito dna extraction protocol for next-generation sequencing
Uploaded: 2021-04-15T14:00:00
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우리는 미국이 자금을 지원하는 벡터 매개 질병에 대한 우수의 태평양 남서부 지역 센터의 자금 지원을 인정합니다. 질병통제예방센터(협력계약 1U01CK0000516), CDC 보조금 NU50CK000420-04-04, USDA 국립식품농업연구소(해치 프로젝트 1025565), UF/IFAS 플로리다 메디컬 곤충학 연구소 펠로우십 Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC 단계 II 보조금(AWD05009_MOD0030), 플로리다 보건부(CoQ) 이 문서의 결과와 결론은 저자의 결과이며 반드시 미국 어류 및 야생 동물 서비스의 견해를 나타내지는 않습니다.

1. DNA 추출 전에 일반 샘플 저장 및 준비
<ol><li>샘플을 조직을 부드럽게 하기 위해 >70% 알코올에 저장된 경우 4°C에서 1시간(또는 하룻밤)에 100 μL PCR 급 수분으로 샘플을 수화한다.</li>
</ol>2. 샘플 중단
<ol><li>인큐베이터 또는 흔들림 열 블록을 56°C에서 설정합니다.</li>
	<li>단백질 효소 K (PK) 버퍼/ 효소 믹스를 만듭니다. 단백질제 K(100 mg/mL)의 2μL과 98μL의 단백질제 K 버퍼(총 100μL...

<ol>
	<li>Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+extraction+protocol+for+improved+DNA+yield+from+individual+mosquitoes.">A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes.</a> F1000Research. 4, 1314 (2015).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+divergence+among+invasive+populations+of+Aedes+aegypti+in+California.">Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California.</a> BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance+of+conserved+CRISPR-Cas9+target+sites+within+the+highly+polymorphic+genomes+of+Anopheles+and+Aedes+mosquitoes.">Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes.</a> Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcontinental+dispersal+of+Anopheles+gambiae+occurred+from+West+African+origin+via+serial+founder+events.">Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events.</a> Communications Biology. 2, 473 (2019).</li><li>Norris, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+introgression+in+an+African+malaria+mosquito+coincident+with+the+increased+usage+of+insecticide-treated+bed+nets.">Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).</li><li>Main, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+of+host+preference+and+resting+behavior+in+the+major+african+malaria+vector,+Anopheles+arabiensis.">The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis.</a> Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).</li><li>Yamasaki, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+genomic+DNA+library+construction+of+small+insects.">Improved tools for genomic DNA library construction of small insects.</a> F1000Research. 5, 211 (2016).</li><li>Tabuloc, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+of+Tuta+absoluta+genome+to+develop+SNP+genotyping+assays+for+species+identification.">Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification.</a> Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).</li><li>Campos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+mitogenome+sequence+of+Anopheles+coustani+from+S&#227;o+Tom&#233;+island.">Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from S&#227;o Tom&#233; island.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).</li><li>Cornel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+mitogenome+sequences+of+Aedes+(Howardina)+busckii+and+Aedes+(Ochlerotatus)+taeniorhynchus+from+the+Caribbean+Island+of+Saba.">Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).</li><li>Lucena-Aguilar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+source+selection+for+downstream+applications+based+on+dna+quality+indicators+analysis.">DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis.</a> Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).</li></ol>

여기에 설명된 프로토콜은 다른 곤충 종에 맞게 조정할 수 있다. Nieman 외1에 도입 된 프로토콜의원래 버전은 Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, 아노펠레스 아라비엔시스, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila ...

최근 개선된 DNA 추출 프로토콜1의 개발로 전체 게놈 시퀀싱2,3,4,5,6을포함하는 많은 고충격 다운스트림 연구를허용하고있다. 이 자기 비드 기반 DNA 추출 프로토콜은 개별 모기 샘플에서 신뢰할 수있는 DNA 수율을 제공하므로 필드 수집에서 충분한 수의 샘플을 획득하는 데 드는 비용과 시간을 줄입니다.
인구와 조경 유전체학의 최근 발전은 전체 게놈 시퀀싱의 비용 감소와 직접적으로 상관관계가 있습니다. 이전 DNA 추출 프로토콜1은 높은 처리량 시퀀싱과 관련된 효율성을 증가하지만, 자금이없는 작은 실험실 / 연구는 프로토콜 (예를 들어, 특수 기기의 비용)을 구현하는 비용으로 인해 이러한 새로운 강력한 풍경 및 인구 유전체 학 도구를 사용하지 않을 수 있습니다.
여기서, 수정된 DNA 추출 프로토콜은 Neiman외. 1과 유사한 자기 비드 추출 단계를 사용하여 고순도 DNA를 얻지만 조직 용해 및 DNA 추출을 위한 고비용 기기에 의존하지 않는다는 것을 제시한다. 이 프로토콜은 고품질 DNA의 >10 ng를 요구하는 실험에 적합합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19077</td>
			<td>Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AL Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19075</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW1 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19081</td>
			<td>Washing buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW2 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19072</td>
			<td>Washing buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagAttract Suspension G</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1026901</td>
			<td>magnetic bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead separator</td>
			<td>Epigentek</td>
			<td>Q10002-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>microvolume spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PK Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4489111</td>
			<td>Proteinase K buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td>fluorometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a magnetic-bead-based mosquito dna extraction protocol for next-generation sequencing

마그네틱 비즈와 자동화된 DNA 추출 기기를 사용하여 최근에 발표된 DNA 추출 프로토콜은 다운스트림 전체 게놈 시퀀싱에 충분한 잘 보존된 개별 모기로부터 고품질 및 수량 DNA를 추출할 수 있음을 시사했습니다. 그러나 고가의 자동화 된 DNA 추출 기기에 대한 의존은 많은 실험실에서 금지 될 수 있습니다. 여기서, 연구 결과는 저중간 처리량에 적합한 예산 친화적인 자기 비드 기지를 둔 DNA 추출 프로토콜을 제공합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 개별 Aedes aegypti 모기 견본을 사용하여 성공적으로 시험되었습니다. 고품질 DNA 추출과 관련된 비용 절감은 자원 제한된 실험실 및 연구에 높은 처리량 시퀀싱의 적용을 증가시킬 것이다.

개별 모기 헤드/흉부 조직당 평균 DNA 수율은 용출 버퍼 100μL을 사용하여 용출할 때 형광계를 사용하여 측정된 4.121 ng/μL(N= 92, 표준 편차 3.513)이었다. 이는 전체 게놈 라이브러리 시공1,7에필요한 10-30 ng 게놈 DNA 입력 요구 사항에 충분합니다. DNA의 양은 모기 체 크기와 보존 조건에 따라 0.3-29.7 ng/μL 사이에서 다를 수 있습니다. 높은 가변성 중 일부는 연구...

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A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

여기에 설명된 DNA 추출 프로토콜은 모기에서 고품질의 DNA 추출을 생성하기 위하여 자기 구슬을 사용하여 입니다. 이러한 추출은 다운스트림 차세대 시퀀싱 접근 방식에 적합합니다.

차세대 시퀀싱을 위한 자기 비드 기반 모기 DNA 추출 프로토콜

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...

이 예산 친화적 인 자기 비드 기반 DNA 추출 프로토콜은 자원 제한된 실험실 및 연구에 액세스 할 수있는 높은 처리량 시퀀싱을 합니다. 이 프로토콜은 고품질 DNA 추출을 위한 고가의 장비를 필요로 하지 않으며 높은 처리량 시퀀싱을 위한 질로 충분한 양의 DNA를 얻는 것이 어려운 특정 진단 또는 연구 상황에서 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 일회성 데모로 쉽게 복제할 수 있습니다.워크플로에 익숙해지려면 먼저 소수의 샘플로 시도해야 합니다. 우선, PCR 급수 의 100 마이크로리터를 추가하고 조직을 부드럽게하기 위해 섭씨 4도에서 1 시간 동안 배양하여 70 % 이상의 알코올에 저장된 모기 조직 샘플을 수화하십시오. 인큐베이션 후 물을 버리고 100 마이크로리터의 Proteinase K 완충 효소 믹스를 추가합니다.그런 다음 마이크로 원심 분리기 튜브유봉을 사용하여 조직을 균질화하십시오. 균질화 후, 원심분리하고 56섭씨에서 2~3시간 동안 조직을 용해시키고 배양한다. DNA를 추출하기 위해 조직의 파이펫 100 마이크로리터가 새로운 깨끗한 미세 원심 분리튜브로 분해됩니다.그런 다음 마그네틱 비드 마스터 믹스의 215 마이크로 리터를 추가합니다. 파이펫을 사용하여 용액과 마그네틱 구슬 혼합물을 10~20초 동안 섞은 다음 실온에서 10분 동안 방치합니다. 잠복하는 동안, 부드럽게 자기 구슬에 DNA의 결합을 극대화하기 위해 때때로 튜브를 흔들어.다음으로, 용액이 명확해질 때까지 자기 비드 분리기 위에 튜브를 놓습니다. 그런 다음 파이펫을 사용하여 DNA를 들고 있는 자기 구슬을 방해하지 않고 튜브에서 액체를 부드럽게 흡인시합니다. 마그네틱 비드 분리기에서 튜브를 멀리 이동하고 세척 버퍼 1의 325 마이크로 리터를 추가하여 구슬을 씻어.피펫팅으로 철저히 섞고 실온에서 1분간 배양합니다. 인큐베이션 후, 튜브를 마그네틱 비드 분리기 위에 놓고 이전에 설명한 대로 상체를 제거한 다음, 자기 비드 분리기에서 튜브를 멀리 이동시키고 완충액으로 한 번 구슬을 세척합니다. 완충1로 두 번째 세척 후, 250 마이크로리터의 세탁 버퍼 2개로 구슬을 두 번 씻는다.마지막 세척 후, 자기 비드 분리기에서 멀리 튜브를 이동하고 용출 버퍼의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 파이펫팅으로 철저히 섞은 다음 실온에서 2분 동안 튜브를 배양한 다음 마그네틱 분리기위에 다시 놓습니다. 용액이 명확해지면 상체를 새롭고 깨끗한 0.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 옮기고 적절하게 보관하십시오.0.5 밀리몰러 EDTA를 함유하는 용출 완충제에서 모기 DNA의 전형적인 마이크로볼륨 형광계 판독으로 여기에 도시되었다. 평균 260 ~ 280 나노미터 흡광도 비는 2.3이다. 이 표는 다른 추출 방법에 대해 하루 동안 처리된 샘플의 비용과 수를 보여 주어 있습니다.이 프로토콜에 의한 추출에 대한 일반적인 시약 및 소모품 비용은 샘플당 약 9.50입니다. 이 비용은 일반적인 자기 비드 기반 추출 방법과 동일합니다. 이 프로토콜의 주요 비용 이점은 자동화 된 DNA 추출 기기를 필요로하지 에서 비롯됩니다.여러 샘플로 작업할 때 DNA의 교차 오염을 방지하기 위해 샘플 간에 파이펫 팁을 변경해야 합니다. 우리는 전체 게놈 시퀀싱을 위해이 방법을 사용하여 추출 된 고품질의 DNA를 사용합니다. 우리는 현재 공중 보건 및 질병 통제에 있는 우려의 살충제 저항 또는 면역 유전자에 있는 새로운 돌연변이를 확인하기 위하여 시퀀싱 데이터를 사용하고 있습니다.높은 처리량 시퀀싱을 위한 적당한 해결책을 갖는 것은 많은 새로운 유전 통제 전략의 성공에 영향을 미치는 모기 분산및 유전자 흐름을 이해하기 위한 인구 유전체학 및 조경 유전체학을 위한 흥미진진한 문을 엽니다.

Research

JoVE Journal

Biology

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Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

모스키토 리어링 (A. gambiae)에 대한 프로토콜

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

연구

생물학

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형광 - 현미경 검사와 차세대 장면 : Organelle 무결성에 관련된 유전자의 식별을위한 유용한 도구

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

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