Name: a magnetic-bead-based mosquito dna extraction protocol for next-generation sequencing
Uploaded: 2021-04-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

Vi anerkjenner finansieringsstøtte fra Pacific Southwest Regional Center of Excellence for Vector-Borne Diseases finansiert av U.S. Centers for Disease Control and Prevention (Cooperative Agreement 1U01CK000516), CDC grant NU50CK000420-04-04, USDA National Institute of Food and Agriculture (Hatch-prosjektet 1025565), UF/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory fellowship til Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC Phase II grant (AWD05009_MOD0030) og Florida Department of Health (Contract CODQJ). Funnene og konklusjonene i denne artikkelen er de av forfatteren(e) og representerer ikke nødvendigvis synspunktene til U.S. Fish and Wildlife Service.

1. Generell prøvelagring og preparater før DNA-ekstraksjon
<ol><li>Hydrater prøven i 100 μL PCR-klasse vann i 1 t (eller over natten) ved 4 °C hvis prøven er lagret i >70 % alkohol for å myke opp vevet.</li>
</ol>2. Prøveavbrudd
<ol><li>Sett en inkubator eller risting varmeblokk ved 56 °C.</li>
	<li>Lag proteinase K (PK) buffer/enzymblanding. 2 μL Proteinase K (100 mg/ml) og 98 μL Proteinase K Buffer (totalt 100 μL) kreves for hver enkelt myggutvinning. For å forberede en masterbl...

<ol>
	<li>Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+extraction+protocol+for+improved+DNA+yield+from+individual+mosquitoes.">A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes.</a> F1000Research. 4, 1314 (2015).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+divergence+among+invasive+populations+of+Aedes+aegypti+in+California.">Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California.</a> BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance+of+conserved+CRISPR-Cas9+target+sites+within+the+highly+polymorphic+genomes+of+Anopheles+and+Aedes+mosquitoes.">Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes.</a> Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcontinental+dispersal+of+Anopheles+gambiae+occurred+from+West+African+origin+via+serial+founder+events.">Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events.</a> Communications Biology. 2, 473 (2019).</li><li>Norris, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+introgression+in+an+African+malaria+mosquito+coincident+with+the+increased+usage+of+insecticide-treated+bed+nets.">Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).</li><li>Main, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+of+host+preference+and+resting+behavior+in+the+major+african+malaria+vector,+Anopheles+arabiensis.">The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis.</a> Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).</li><li>Yamasaki, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+genomic+DNA+library+construction+of+small+insects.">Improved tools for genomic DNA library construction of small insects.</a> F1000Research. 5, 211 (2016).</li><li>Tabuloc, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+of+Tuta+absoluta+genome+to+develop+SNP+genotyping+assays+for+species+identification.">Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification.</a> Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).</li><li>Campos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+mitogenome+sequence+of+Anopheles+coustani+from+S&#227;o+Tom&#233;+island.">Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from S&#227;o Tom&#233; island.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).</li><li>Cornel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+mitogenome+sequences+of+Aedes+(Howardina)+busckii+and+Aedes+(Ochlerotatus)+taeniorhynchus+from+the+Caribbean+Island+of+Saba.">Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).</li><li>Lucena-Aguilar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+source+selection+for+downstream+applications+based+on+dna+quality+indicators+analysis.">DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis.</a> Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).</li></ol>

Protokollen beskrevet her kan tilpasses andre insektarter. Den opprinnelige versjonen av protokollen introdusert i Nieman et al.1 har blitt testet på flere arter, inkludert Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absutaol, og Keiferia lycopersicella<s...

Nylig utvikling av en forbedret DNA-ekstraksjonsprotokoll1 har tillatt mange nedstrømsstudier med høy effekt som involverer hele genomsekvensering2,3,4,5,6. Denne magnetiske perlebaserte DNA-ekstraksjonsprotokollen gir pålitelig DNA-utbytte fra individuelle myggprøver, noe som igjen reduserer kostnadene og tiden forbundet med å skaffe seg et tilstrekkelig antall prøver fra feltsamlinger.
Nylige fremskritt innen befolknings- og landskapsgenomikk er direkte korrelert med avtagende kostnader ved hele genomsekvensering. Selv om den forrige DNA-utvinningsprotokollen1 øker effektiviteten forbundet med sekvensering med høy gjennomstrømning, kan mindre laboratorier/studier uten midlene velge bort å bruke disse nye kraftige landskaps- og populasjonsgenomikkverktøyene på grunn av kostnadene ved å implementere protokollen (f.eks. kostnader ved spesialiserte instrumenter).
Her presenteres en modifisert DNA-ekstraksjonsprotokoll som bruker et lignende magnetisk perleutvinningstrinn som Neiman et al.1 for å oppnå DNA med høy renhet, men er ikke avhengig av dyre instrumenter for vevslys og DNA-ekstraksjon. Denne protokollen er egnet for eksperimenter som krever >10 ng av dna av høy kvalitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19077</td>
			<td>Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AL Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19075</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW1 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19081</td>
			<td>Washing buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW2 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19072</td>
			<td>Washing buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagAttract Suspension G</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1026901</td>
			<td>magnetic bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead separator</td>
			<td>Epigentek</td>
			<td>Q10002-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>microvolume spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PK Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4489111</td>
			<td>Proteinase K buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td>fluorometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a magnetic-bead-based mosquito dna extraction protocol for next-generation sequencing

En nylig publisert DNA-ekstraksjonsprotokoll ved hjelp av magnetiske perler og et automatisert DNA-ekstraksjonsinstrument antydet at det er mulig å trekke ut DNA av høy kvalitet og kvantitets-DNA fra en godt bevart individuell mygg som er tilstrekkelig for nedstrøms hele genomsekvensering. Imidlertid kan avhengighet av et dyrt automatisert DNA-ekstraksjonsinstrument være forbudt for mange laboratorier. Her gir studien en budsjettvennlig magnetisk-perle-basert DNA-ekstraksjonsprotokoll, som er egnet for lav til middels gjennomstrømning. Protokollen beskrevet her ble vellykket testet ved hjelp av individuelle Aedes aegypti myggprøver. De reduserte kostnadene forbundet med DNA-ekstraksjon av høy kvalitet vil øke anvendelsen av høy gjennomstrømningssekvensering til ressursbegrensede laboratorier og studier.

Gjennomsnittlig DNA-utbytte per enkelt mygghode/thoraxvev var 4,121 ng/μL (N = 92, standardavvik 3,513) målt ved bruk av fluorometer ved bruk av 100 μL elutionbuffer. Dette er tilstrekkelig for de 10-30 ng genomiske DNA-inngangskravene som er nødvendige for hele genombibliotekets konstruksjon1,7. Mengden DNA kan variere mellom 0,3-29,7 ng/μL avhengig av myggkroppens størrelse og bevaringsforhold. Noe av den høye variasjonen skyldes karakteristikken til mag...

Watch this Scientific Journal Video about A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

Beskrevet her er en DNA-ekstraksjonsprotokoll ved hjelp av magnetiske perler for å produsere DNA-ekstraksjoner av høy kvalitet fra mygg. Disse ekstraksjonene er egnet for en nedstrøms neste generasjons sekvenseringstilnærming.

En magnetisk-perle-basert mygg DNA-ekstraksjonsprotokoll for neste generasjons sekvensering

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...

Denne budsjettvennlige magnetiske perlebaserte DNA-ekstraksjonsprotokollen gjør høy gjennomstrømningssekvensering tilgjengelig for ressursbegrensede laboratorier og studier. Denne protokollen krever ikke dyrt utstyr for DNA-ekstraksjon av høy kvalitet, og det kan være nyttig i visse diagnostiske eller forskningssituasjoner der det er utfordrende å skaffe tilstrekkelig mengde DNA med en kvalitet for høy gjennomstrømningssekvensering. Denne protokollen er enkel å replikere med en engangsdemonstrasjon.Det bør prøves med et lite antall eksempler først for å bli kjent med arbeidsflyten. For å begynne med, hydrer myggvevsprøvene som er lagret i mer enn 70% alkohol ved å legge til 100 mikroliter PCR-klasse vann og inkubere i en time ved fire grader Celsius for å myke vevet. Etter inkubasjonen, kast vannet og tilsett 100 mikroliter Proteinase K bufferenzymblanding.Bruk deretter en mikrocentrifuge tube pestle for å homogenisere vevet. Etter homogenisering, sentrifuger vevet lysat og inkubere i to til tre timer ved 56 grader Celsius. For å trekke ut DNA lyser pipette 100 mikrolitere av vevet inn i et nytt rent mikrosenterrør.Tilsett deretter 215 mikroliter av den magnetiske perlemasterblandingen. Bruk en pipette, bland lysatet og den magnetiske perleblandingen i 10 til 20 sekunder, og la den stå i 10 minutter ved romtemperatur. Under inkubasjonen rister du forsiktig røret av og til for å maksimere bindingen av DNA til de magnetiske perlene.Deretter plasserer du røret på den magnetiske perleseparatoren til løsningen blir klar. Deretter aspirerer du væsken forsiktig fra røret uten å forstyrre de magnetiske perlene som holder DNA-et. Flytt røret bort fra den magnetiske perleseparatoren og vask perlene ved å tilsette 325 mikroliter vaskebuffer en.Bland grundig ved pipettering og inkuber i ett minutt ved romtemperatur. Etter inkubasjonen plasserer du røret på den magnetiske perleseparatoren og fjerner supernatanten som tidligere demonstrert, flytt deretter røret bort fra den magnetiske perleseparatoren og vask perlene en gang med vaskebuffer en. Etter den andre vasken med buffer en, vask perlene to ganger med 250 mikroliter vaskebuffer to på samme måte.Etter den siste vasken, flytt røret bort fra den magnetiske perleseparatoren og tilsett 100 mikroliter elutionbuffer. Bland grundig ved pipettering og inkuber deretter røret i to minutter ved romtemperatur før du setter det tilbake på magnetseparatoren. Når løsningen blir klar, overfør supernatanten til et nytt, rent mikrosenterrør på 0,5 milliliter og oppbevar det på riktig måte.Vist her som en typisk mikrovolum fluorometeravlesning av mygg-DNA i en elutionbuffer som inneholder 0,5 millimolar EDTA. Gjennomsnittlig 260 til 280 nanometerabsorberingsforhold er 2,3. Denne tabellen viser kostnadene og antall prøver som behandles i én arbeidsdag for ulike utvinningsmetoder.Den typiske reagens- og forbrukskostnaden for en utvinning av denne protokollen er rundt 9,50 per prøve. Denne kostnaden tilsvarer enhver typisk magnetisk perlebasert ekstraksjonsmetode. Den største kostnadsfordelen ved denne protokollen kommer fra å ikke kreve det automatiserte DNA-ekstraksjonsinstrumentet.Sørg for å endre pipettespisser mellom prøver for å forhindre krysskontaminering av DNA når du arbeider med flere prøver. Vi bruker DNA av høy kvalitet ekstrahert ved hjelp av denne metoden for hele genomsekvensering. Vi bruker for tiden sekvenseringsdataene til å identifisere nye mutasjoner i insektmiddelresistens eller immungener av bekymring i folkehelse- og sykdomskontroll.Å ha rimelige løsninger for sekvensering med høy gjennomstrømning åpner spennende dører for populasjonsgenomikk og landskapsgenomikk med sikte på å forstå myggspredning og genflyt som påvirker suksessen til mange nye genetiske kontrollstrategier.

Research

JoVE Journal

Biology

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Fluorescens-mikroskopi Screening og neste generasjons sekvensering: Nyttige verktøy for identifikasjon av gener involvert i Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Neste-generasjons sekvensering av 16S ribosomalt RNA Gene amplikonene

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Målrettet DNA Metylering Analyse av Neste-generasjons sekvense

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Forsterkning, Neste generasjons sekvensering, og Genomisk DNA Kartlegging av Retrovirale Integrasjons nettsteder

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

Effektiv Nucleic Acid Utvinning og 16S rRNA Gene Sekvense for Bakteriell Fellesskapet Karakterisering

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interactome-Seq: En protokoll for Domainome biblioteket konstruksjon, validering og utvalg av Phage Display og neste generasjons sekvensering

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Tick Microbiome karakterisering av neste generasjons 16S rRNA Amplicon sekvenser

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Bakterieflora analyse ved hjelp av to-trinns PCR og neste generasjons 16S rRNA Gene sekvensering

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Creating Robust Bisulfite-mRNA Libraries for Transcriptome-Wide Mapping

Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing

Decoding RNA Methylation's Role in Pancreatic Cancer - A Single-Base Resolution Study (Video) | JoVE

Anrikning av mRNA og bisulfitt-mRNA-bibliotekforberedelse for neste generasjons sekvensering

RNA post-transcriptional modifications in various types of RNA transcripts are associated with diverse RNA regulation in eukaryotic cells. Aberrant RNA ...