Name: a magnetic-bead-based mosquito dna extraction protocol for next-generation sequencing
Uploaded: 2021-04-15T14:00:00
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Reconhecemos o apoio financeiro do Centro Regional de Excelência para Doenças Transmitidas por Vetores do Pacífico financiado pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças dos EUA (Acordo Cooperativo 1U01CK000516), cdc conceder NU50CK000420-04-04, o USDA National Institute of Food and Agriculture (Projeto Hatch 1025565), uf/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory fellowship to Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC Phase II grant (AWD05009_MOD0030) e Florida Department of Health (Contract CODQJ). As conclusões e conclusões deste artigo são dos autores e não representam necessariamente as opiniões do Serviço de Pesca e Vida Selvagem dos EUA.

1. Armazenamento geral de amostras e preparações antes da extração de DNA
<ol><li>Hidrate a amostra em 100 μL de água de grau PCR por 1h (ou durante a noite) a 4 °C se a amostra tiver sido armazenada em >70% de álcool para suavizar o tecido.</li>
</ol>2. Interrupção da amostra
<ol><li>Coloque uma incubadora ou bloco de calor tremendo a 56 °C.</li>
	<li>Faça a mistura tampão/enzima proteinase K (PK). 2 μL de Proteinase K (100 mg/mL) e 98 μL de Proteinase K Buffer (total de 100 μ...

<ol>
	<li>Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+extraction+protocol+for+improved+DNA+yield+from+individual+mosquitoes.">A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes.</a> F1000Research. 4, 1314 (2015).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+divergence+among+invasive+populations+of+Aedes+aegypti+in+California.">Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California.</a> BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance+of+conserved+CRISPR-Cas9+target+sites+within+the+highly+polymorphic+genomes+of+Anopheles+and+Aedes+mosquitoes.">Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes.</a> Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcontinental+dispersal+of+Anopheles+gambiae+occurred+from+West+African+origin+via+serial+founder+events.">Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events.</a> Communications Biology. 2, 473 (2019).</li><li>Norris, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+introgression+in+an+African+malaria+mosquito+coincident+with+the+increased+usage+of+insecticide-treated+bed+nets.">Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).</li><li>Main, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+of+host+preference+and+resting+behavior+in+the+major+african+malaria+vector,+Anopheles+arabiensis.">The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis.</a> Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).</li><li>Yamasaki, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+genomic+DNA+library+construction+of+small+insects.">Improved tools for genomic DNA library construction of small insects.</a> F1000Research. 5, 211 (2016).</li><li>Tabuloc, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+of+Tuta+absoluta+genome+to+develop+SNP+genotyping+assays+for+species+identification.">Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification.</a> Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).</li><li>Campos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+mitogenome+sequence+of+Anopheles+coustani+from+S&#227;o+Tom&#233;+island.">Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from S&#227;o Tom&#233; island.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).</li><li>Cornel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+mitogenome+sequences+of+Aedes+(Howardina)+busckii+and+Aedes+(Ochlerotatus)+taeniorhynchus+from+the+Caribbean+Island+of+Saba.">Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).</li><li>Lucena-Aguilar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+source+selection+for+downstream+applications+based+on+dna+quality+indicators+analysis.">DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis.</a> Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).</li></ol>

O protocolo descrito aqui pode ser adaptado para outras espécies de insetos. A versão original do protocolo introduzido em Nieman et al.1 foi testada em várias espécies, incluindo Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta, e Keiferia lycopersicel...

O desenvolvimento recente de um protocolo de extração de DNAmelhorado 1 permitiu muitos estudos de alto impacto a jusante envolvendo sequenciamento de genoma inteiro2,3,4,5,6. Este protocolo de extração de DNA baseado em contas magnéticas fornece um rendimento de DNA confiável de amostras individuais de mosquitos, o que, por sua vez, reduz o custo e o tempo associados à aquisição de um número suficiente de amostras de coleções de campo.
Os recentes avanços na genômica populacional e paisagística estão diretamente correlacionados com a diminuição dos custos de sequenciamento de genomas inteiros. Embora o protocolo anterior de extração de DNA1 aumente a eficiência associada ao sequenciamento de alto rendimento, laboratórios/estudos menores sem os fundos podem optar por não usar essas novas poderosas ferramentas de genômica paisagística e populacional devido aos custos de implementação do protocolo (por exemplo, custos de instrumentos especializados).
Aqui, é apresentado um protocolo de extração de DNA modificado que usa um passo de extração de contas magnéticas semelhante ao Neiman et al.1 para obter DNA de alta pureza, mas não conta com instrumentos de alto custo para lise tecidual e extração de DNA. Este protocolo é adequado para experimentos que exigem >10 ng de DNA de alta qualidade.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19077</td>
			<td>Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AL Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19075</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW1 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19081</td>
			<td>Washing buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW2 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19072</td>
			<td>Washing buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagAttract Suspension G</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1026901</td>
			<td>magnetic bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead separator</td>
			<td>Epigentek</td>
			<td>Q10002-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>microvolume spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PK Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4489111</td>
			<td>Proteinase K buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td>fluorometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a magnetic-bead-based mosquito dna extraction protocol for next-generation sequencing

Um protocolo de extração de DNA recentemente publicado usando contas magnéticas e um instrumento automatizado de extração de DNA sugeriu que é possível extrair DNA de alta qualidade e quantidade de um mosquito individual bem preservado suficiente para sequenciamento de genoma a jusante. No entanto, a dependência de um caro instrumento automatizado de extração de DNA pode ser proibitiva para muitos laboratórios. Aqui, o estudo fornece um protocolo de extração de DNA baseado em contas magnéticas, que é adequado para baixo a médio rendimento. O protocolo descrito aqui foi testado com sucesso utilizando amostras individuais do mosquito Aedes aegypti. Os custos reduzidos associados à extração de DNA de alta qualidade aumentarão a aplicação de sequenciamento de alto rendimento a laboratórios e estudos limitados de recursos.

O rendimento médio de DNA por tecido de cabeça/tórax de mosquito individual foi de 4,121 ng/μL (N = 92, desvio padrão 3.513) medido utilizando um fluorômetro quando eluido usando 100 μL de tampão de elução. Isso é suficiente para os requisitos de entrada de DNA genômico de 10-30 ng necessários para toda a construção da biblioteca degenomas 1,7. A quantidade de DNA pode variar entre 0,3-29,7 ng/μL, dependendo do tamanho do corpo do mosquito e das c...

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A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

Descrito aqui é um protocolo de extração de DNA usando contas magnéticas para produzir extrações de DNA de alta qualidade de mosquitos. Essas extrações são adequadas para uma abordagem de sequenciamento de próxima geração a jusante.

Um protocolo de extração de DNA de mosquito baseado em contas magnéticas para sequenciamento de próxima geração

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...

Este protocolo de extração de DNA baseado em contas magnéticas amigável ao orçamento torna o sequenciamento de alto rendimento acessível a laboratórios e estudos limitados de recursos. Este protocolo não requer equipamentos caros para extração de DNA de alta qualidade e pode ser útil em certas situações de diagnóstico ou pesquisa onde a obtenção de uma quantidade suficiente de DNA com uma qualidade para sequenciamento de alto rendimento é um desafio. Este protocolo é fácil de replicar com uma demonstração única.Ele deve ser experimentado com um pequeno número de amostras primeiro para se familiarizar com o fluxo de trabalho. Para começar, hidrate as amostras de tecido do mosquito armazenadas em mais de 70% de álcool adicionando 100 microliters de água de grau PCR e incubando por uma hora a quatro graus Celsius para suavizar o tecido. Após a incubação, descarte a água e adicione 100 microliters de proteinase K mistura de enzima tampão.Em seguida, use um pilão de tubo de microcentrifuge para homogeneizar o tecido. Após a homogeneização, centrifugar o tecido lise e incubar por duas a três horas a 56 graus Celsius. Para extrair DNA, pipetas 100 microliters do tecido lysate em um novo tubo de microcentrifuge limpo.Em seguida, adicione 215 microliters da mistura mestre de contas magnéticas. Com uma pipeta, misture o liseto e a mistura de contas magnéticas por 10 a 20 segundos e deixe-a descansar por 10 minutos em temperatura ambiente. Durante a incubação, agite suavemente o tubo ocasionalmente para maximizar a ligação do DNA às contas magnéticas.Em seguida, coloque o tubo no separador de contas magnéticas até que a solução fique clara. Em seguida, usando uma pipeta, aspire suavemente o líquido do tubo sem perturbar as contas magnéticas que seguram o DNA. Mova o tubo para longe do separador de contas magnéticas e lave as contas adicionando 325 microliters de tampão de lavagem um.Misture bem por pipetar e incubar por um minuto à temperatura ambiente. Após a incubação, coloque o tubo no separador de contas magnéticas e remova o supernatante como demonstrado anteriormente, em seguida, mova o tubo para longe do separador de contas magnéticas e lave as contas uma vez com tampão de lavagem. Após a segunda lavagem com tampão, lave as contas duas vezes com 250 microliters de tampão de lavagem dois da mesma maneira.Após a última lavagem, mova o tubo para longe do separador de contas magnéticas e adicione 100 microliters de tampão de elução. Misture bem por pipetar e, em seguida, incubar o tubo por dois minutos à temperatura ambiente antes de colocá-lo de volta no separador magnético. Quando a solução ficar clara, transfira o supernante para um novo tubo de microcentrífugo de 0,5 mililitro e armazene adequadamente.Mostrado aqui como uma leitura típica do fluorômetro de microvolume do DNA do mosquito em um tampão de elução contendo 0,5 milimólares EDTA. A taxa média de absorção de 260 a 280 nanômetros é de 2,3. Esta tabela mostra os custos e o número de amostras processadas em um dia útil para diferentes métodos de extração.O custo típico de reagente e consumível para uma extração por este protocolo é de cerca de 9,50 por amostra. Este custo é equivalente a qualquer método típico de extração baseada em contas magnéticas. O maior custo benefício deste protocolo vem da não exigência do instrumento automatizado de extração de DNA.Certifique-se de alterar as pontas da pipeta entre as amostras para evitar a contaminação cruzada do DNA ao trabalhar com várias amostras. Usamos o DNA de alta qualidade extraído usando este método para sequenciamento de genoma inteiro. Atualmente estamos usando os dados de sequenciamento para identificar novas mutações na resistência a inseticidas ou genes imunológicos de preocupação na saúde pública e no controle de doenças.Ter soluções acessíveis para sequenciamento de alto rendimento abre portas emocionantes para a genômica populacional e genômica da paisagem destinada a entender a dispersão de mosquitos e o fluxo genético que influencia o sucesso de muitas novas estratégias de controle genético.

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