Name: a magnetic-bead-based mosquito dna extraction protocol for next-generation sequencing
Uploaded: 2021-04-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

Мы признаем финансовую поддержку со стороны Тихоокеанского юго-западного регионального центра передового опыта по трансмиссивным заболеваниям, финансируемого Центрами США по контролю и профилактике заболеваний (Соглашение о сотрудничестве 1U01CK000516), грантОМ CDC NU50CK00420-04-04, Национальным институтом продовольствия и сельского хозяйства Министерства сельского хозяйства США (проект Хэтча 1025565), стипендией UF / IFAS Флоридской медицинской энтомологической лаборатории Це-Ю Чен, грантом NSF CAMTech IUCRC Фаза II (AWD05009_MOD0030) и Департаментом здравоохранения Флориды (контракт CODQJ). Выводы и заключения в этой статье являются выводами автора (авторов) и не обязательно отражают точку зрения Службы охраны рыбных ресурсов и дикой природы США.

1. Общее хранение образцов и подготовка перед извлечением ДНК
<ol><li>Гидратировать образец в воде ПЦР-класса 100 мкл в течение 1 ч (или на ночь) при 4 °C, если образец хранился в >70% спирте для размягчения ткани.</li>
</ol>2. Нарушение выборки
<ol><li>Установите инкубатор или встряхиватель...

<ol>
	<li>Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+extraction+protocol+for+improved+DNA+yield+from+individual+mosquitoes.">A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes.</a> F1000Research. 4, 1314 (2015).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+divergence+among+invasive+populations+of+Aedes+aegypti+in+California.">Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California.</a> BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance+of+conserved+CRISPR-Cas9+target+sites+within+the+highly+polymorphic+genomes+of+Anopheles+and+Aedes+mosquitoes.">Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes.</a> Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcontinental+dispersal+of+Anopheles+gambiae+occurred+from+West+African+origin+via+serial+founder+events.">Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events.</a> Communications Biology. 2, 473 (2019).</li><li>Norris, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+introgression+in+an+African+malaria+mosquito+coincident+with+the+increased+usage+of+insecticide-treated+bed+nets.">Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).</li><li>Main, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+of+host+preference+and+resting+behavior+in+the+major+african+malaria+vector,+Anopheles+arabiensis.">The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis.</a> Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).</li><li>Yamasaki, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+genomic+DNA+library+construction+of+small+insects.">Improved tools for genomic DNA library construction of small insects.</a> F1000Research. 5, 211 (2016).</li><li>Tabuloc, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+of+Tuta+absoluta+genome+to+develop+SNP+genotyping+assays+for+species+identification.">Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification.</a> Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).</li><li>Campos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+mitogenome+sequence+of+Anopheles+coustani+from+S&#227;o+Tom&#233;+island.">Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from S&#227;o Tom&#233; island.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).</li><li>Cornel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+mitogenome+sequences+of+Aedes+(Howardina)+busckii+and+Aedes+(Ochlerotatus)+taeniorhynchus+from+the+Caribbean+Island+of+Saba.">Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).</li><li>Lucena-Aguilar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+source+selection+for+downstream+applications+based+on+dna+quality+indicators+analysis.">DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis.</a> Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).</li></ol>

Протокол, описанный здесь, может быть адаптирован для других видов насекомых. Первоначальная версия протокола, представленная в Nieman et al.1, была протестирована на нескольких видах, включая Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannul...

Недавняя разработка улучшенного протокола экстракции ДНК1 позволила пролить много высокоэффективных последующих исследований, включающих секвенирование всего генома2,3,4,5,6. Этот протокол экстракции ДНК на основе магнитных шариков обеспечивает надежный выход ДНК из отдельных образцов комаров, что, в свою очередь, снижает стоимость и время, связанные с приобретением достаточного количества образцов из полевых коллекций.
Последние достижения в популяции и ландшафтной геномике напрямую связаны со снижением затрат на секвенирование всего генома. Хотя предыдущий протокол экстракции ДНК1 повышает эффективность, связанную с высокопроизводительный секвенированием, небольшие лаборатории / исследования без средств могут отказаться от использования этих новых мощных инструментов ландшафтной и популяционной геномики из-за затрат на внедрение протокола (например, затраты на специализированные инструменты).
Здесь представлен модифицированный протокол экстракции ДНК, который использует аналогичную магнитную ступень экстракции шариков, как Neiman et al.1, для получения ДНК высокой чистоты, но не полагается на дорогостоящие инструменты для лизиса тканей и экстракции ДНК. Этот протокол подходит для экспериментов, требующих >10 нг высококачественной ДНК.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19077</td>
			<td>Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AL Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19075</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW1 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19081</td>
			<td>Washing buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW2 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19072</td>
			<td>Washing buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagAttract Suspension G</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1026901</td>
			<td>magnetic bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead separator</td>
			<td>Epigentek</td>
			<td>Q10002-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>microvolume spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PK Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4489111</td>
			<td>Proteinase K buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td>fluorometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a magnetic-bead-based mosquito dna extraction protocol for next-generation sequencing

Недавно опубликованный протокол экстракции ДНК с использованием магнитных шариков и автоматизированного инструмента экстракции ДНК предположил, что можно извлечь высококачественную и количественную ДНК из хорошо сохранившегося отдельного комара, достаточного для последующего секвенирования всего генома. Тем не менее, зависимость от дорогостоящего автоматизированного инструмента для извлечения ДНК может быть непомерно высокой для многих лабораторий. Здесь исследование предоставляет бюджетный протокол экстракции ДНК на магнитной основе, который подходит для низкой и средней пропускной способности. Протокол, описанный здесь, был успешно протестирован с использованием отдельных образцов комаров Aedes aegypti. Снижение затрат, связанных с высококачественной экстракцией ДНК, увеличит применение высокопроизводительного секвенирования в лабораториях и исследованиях с ограниченными ресурсами.

Средний выход ДНК на отдельную голову комара / ткань грудной клетки составил 4,121 нг / мкл (N = 92, стандартное отклонение 3,513), измеренный с использованием флуорометра при элюировании с использованием 100 мкл буфера элюации. Этого достаточно для входных требований геномной ДНК в 10-30 нг, необхо...

Watch this Scientific Journal Video about A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

Здесь описан протокол экстракции ДНК с использованием магнитных шариков для получения высококачественной экстракции ДНК от комаров. Эти извлечения подходят для последующего подхода к секвенированию следующего поколения.

Протокол экстракции ДНК комаров на магнитной основе для секвенирования следующего поколения

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...

Этот бюджетный протокол экстракции ДНК на основе магнитных шариков делает высокопроизводительное секвенирование доступным для лабораторий и исследований с ограниченными ресурсами. Этот протокол не требует дорогостоящего оборудования для высококачественной экстракции ДНК и может быть полезен в определенных диагностических или исследовательских ситуациях, когда получение достаточного количества ДНК с качеством для секвенирования с высокой пропускной способностью является сложной задачей. Этот протокол легко воспроизвести с помощью однократной демонстрации.Сначала следует попробовать с небольшим количеством образцов, чтобы ознакомиться с рабочим процессом. Для начала увлажняйте образцы тканей комаров, хранящиеся в спирте более 70%, добавив 100 микролитров воды класса ПЦР и инкубируя в течение одного часа при четырех градусах Цельсия, чтобы смягчить ткань. После инкубации отбросьте воду и добавьте 100 микролитров буферной ферментной смеси протеиназы К.Затем используйте микроцентрифугу трубки для гомогенизации ткани. После гомогенизации центрифугируют тканевый лисат и инкубируют в течение двух-трех часов при 56 градусах Цельсия. Для извлечения ДНК пипетка 100 микролитров ткани листирует в новую чистую микроцентрифужную трубку.Затем добавьте 215 микролитров магнитной бисероплетения. Используя пипетку, смешайте лисат и смесь магнитных шариков в течение 10-20 секунд, затем дайте ей постоять в течение 10 минут при комнатной температуре. Во время инкубации осторожно время от времени встряхивая трубку, чтобы максимизировать связывание ДНК с магнитными шариками.Далее поместите трубку на магнитный сепаратор шариков до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Затем, используя пипетку, осторожно аспирируйте жидкость из трубки, не нарушая магнитные шарики, удерживающие ДНК. Отодвинуть трубку от магнитного сепаратора шариков и промыть бусины, добавив 325 микролитров промывочной буферной.Тщательно перемешайте путем пипетки и инкубируете в течение одной минуты при комнатной температуре. После инкубации поместите трубку на магнитный сепаратор бусин и удалите супернатант, как было показано ранее, затем отодвините трубку от магнитного сепаратора бусин и промыть шарики один раз с помощью промывочной буферной. После второй промывки буферной дважды помойте бусины 250 микролитрами промывки буфера двумя одинаковыми способами.После последней промывки отодвинуть трубку от магнитного сепаратора шариков и добавить 100 микролитров буфера элюирования. Тщательно перемешайте путем пипетки, а затем инкубируете трубку в течение двух минут при комнатной температуре, прежде чем поместить ее обратно на магнитный сепаратор. Когда раствор станет прозрачным, переложите супернатант в новую, чистую 0,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку и храните соответствующим образом.Показан здесь как типичный микрообойный флуорометр, считывая показания ДНК комара в буфере элюирования, содержащем 0,5 миллимоляра ЭДТА. Средний коэффициент поглощения от 260 до 280 нанометров составляет 2,3. В этой таблице показаны затраты и количество образцов, обработанных за один рабочий день для разных методов экстракции.Типичная стоимость реагента и расходных материалов для экстракции по этому протоколу составляет около 9,50 на образец. Эта стоимость эквивалентна любому типичному методу экстракции на основе магнитной бусины. Основная экономическая выгода этого протокола связана с тем, что он не требует автоматизированного инструмента извлечения ДНК.Обязательно меняйте наконечники пипетки между образцами, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение ДНК при работе с несколькими образцами. Мы используем высококачественную ДНК, извлеченную с помощью этого метода, для секвенирования всего генома. В настоящее время мы используем данные секвенирования для выявления новых мутаций в резистентности к инсектицидам или иммунных генах, вызывающих озабоченность в области общественного здравоохранения и борьбы с болезнями.Наличие доступных решений для высокопроизводительного секвенирования открывает захватывающие двери для популяционной геномики и ландшафтной геномики, направленных на понимание рассеивания комаров и потока генов, что влияет на успех многих новых стратегий генетического контроля.

Research

JoVE Journal

Biology

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

Протокол Mosquito воспитание (А. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Флуоресценции микроскопии Скрининг и следующего поколения секвенирования: Полезные инструменты для идентификации генов, вовлеченных в органелл Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Следующее поколение Секвенирование 16S рибосомальной РНК генов ампликонов

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Целевые метилирования ДНК Анализ Следующее поколение Секвенирование

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Amplification, следующего поколения Секвенирование и геномную ДНК Mapping ретровирусных интеграции сайты

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

Эффективное нуклеиновые кислоты Добыча и 16S рРНК генов Секвенирование для Бактериальные сообщества Характеристика

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interactome-Seq: Протокол для строительства Domainome Библиотека, проверки и отбора Фаговые отображения и следующего поколения последовательности

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Характеристика микрофлора клеща, следующего поколения 16S рРНК ампликон последовательности

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Анализ микробиоты с использованием двухступенчатого ПЦР и секвенирования гена нового поколения 16S rRNA

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Creating Robust Bisulfite-mRNA Libraries for Transcriptome-Wide Mapping

Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing

Decoding RNA Methylation's Role in Pancreatic Cancer - A Single-Base Resolution Study (Video) | JoVE

Обогащение мРНК и бисульфит-мРНК Подготовка библиотек для секвенирования нового поколения

RNA post-transcriptional modifications in various types of RNA transcripts are associated with diverse RNA regulation in eukaryotic cells. Aberrant RNA ...