Name: a magnetic-bead-based mosquito dna extraction protocol for next-generation sequencing
Uploaded: 2021-04-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

ABD Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (Kooperatif Anlaşması 1U01CK000516), CDC hibeSI NU50CK000420-04-04 tarafından finanse edilen Pasifik Güneybatı Vektör Kaynaklı Hastalıklar Bölgesel Mükemmeliyet Merkezi'nden fon desteğini kabul ediyoruz, USDA Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü (Hatch projesi 1025565), Tse-Yu Chen'e UF/IFAS Florida Tıbbi Entomoloji Laboratuvarı bursu, NSF CAMTech IUCRC Faz II hibesi (AWD05009_MOD0030) ve Florida Sağlık Bakanlığı (Sözleşmeli CODQJ). Bu makaledeki bulgular ve sonuçlar yazar(lar)ın bulgularıdır ve abd Balık ve Yaban Hayatı Servisi'nin görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

1. DNA ekstraksiyonu öncesinde genel numune depolama ve hazırlıklar
<ol><li>Numune, dokuyu yumuşatmak için % 70 alkol > depolanmışsa, numuneyi 4 °C'de 1 saat (veya gece boyunca) 100 μL PCR sınıfı suda nemlendirin.</li>
</ol>2. Örnek bozulması
<ol><li>56 °C'de bir inkübatör veya sallama ısı bloğu ayarlayın.</li>
	<li>Proteinaz K (PK) tampon/enzim karışımı yapın. Her bir sivrisinek ekstraksiyonu için 2 μL Proteinaz K (100 mg/mL) ve 98 μL Proteinaz K Tamponu (toplam 1...

<ol>
	<li>Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+extraction+protocol+for+improved+DNA+yield+from+individual+mosquitoes.">A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes.</a> F1000Research. 4, 1314 (2015).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+divergence+among+invasive+populations+of+Aedes+aegypti+in+California.">Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California.</a> BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance+of+conserved+CRISPR-Cas9+target+sites+within+the+highly+polymorphic+genomes+of+Anopheles+and+Aedes+mosquitoes.">Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes.</a> Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcontinental+dispersal+of+Anopheles+gambiae+occurred+from+West+African+origin+via+serial+founder+events.">Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events.</a> Communications Biology. 2, 473 (2019).</li><li>Norris, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+introgression+in+an+African+malaria+mosquito+coincident+with+the+increased+usage+of+insecticide-treated+bed+nets.">Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).</li><li>Main, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+of+host+preference+and+resting+behavior+in+the+major+african+malaria+vector,+Anopheles+arabiensis.">The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis.</a> Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).</li><li>Yamasaki, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+genomic+DNA+library+construction+of+small+insects.">Improved tools for genomic DNA library construction of small insects.</a> F1000Research. 5, 211 (2016).</li><li>Tabuloc, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+of+Tuta+absoluta+genome+to+develop+SNP+genotyping+assays+for+species+identification.">Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification.</a> Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).</li><li>Campos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+mitogenome+sequence+of+Anopheles+coustani+from+S&#227;o+Tom&#233;+island.">Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from S&#227;o Tom&#233; island.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).</li><li>Cornel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+mitogenome+sequences+of+Aedes+(Howardina)+busckii+and+Aedes+(Ochlerotatus)+taeniorhynchus+from+the+Caribbean+Island+of+Saba.">Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).</li><li>Lucena-Aguilar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+source+selection+for+downstream+applications+based+on+dna+quality+indicators+analysis.">DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis.</a> Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).</li></ol>

Burada açıklanan protokol diğer böcek türleri için uyarlanabilir. Nieman ve ark.1'de sunulan protokolün orijinal versiyonu, Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, dahil olmak üzere birden fazla tür üzerinde test edilmiştir. An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta ve Keiferia ...

Geliştirilmiş bir DNA ekstraksiyon protokolü1'in son gelişimi, tüm genom dizilimini içeren birçok yüksek etkili aşağı akış çalışmasına izin verdi2,3,4,5,6. Bu manyetik boncuk bazlı DNA ekstraksiyon protokolü, bireysel sivrisinek örneklerinden güvenilir DNA verimi sağlar ve bu da alan koleksiyonlarından yeterli sayıda örnek elde etmekle ilgili maliyet ve zamanı azaltır.
Nüfus ve peyzaj genomiklerindeki son gelişmeler, tüm genom diziliminin azalan maliyetleri ile doğrudan ilişkilidir. Önceki DNA ekstraksiyon protokolü1, yüksek verim sıralaması ile ilişkili verimliliği artırsa da, fonlar olmadan daha küçük laboratuvarlar / çalışmalar, protokolün uygulanması maliyetleri (örneğin, özel aletlerin maliyetleri) nedeniyle bu yeni güçlü peyzaj ve popülasyon genomik araçlarını kullanmaktan vazgeçebilir.
Burada, yüksek saflıkta DNA elde etmek için Neiman ve ark.1 ile benzer bir manyetik boncuk ekstraksiyon adımı kullanan ancak doku lizisi ve DNA ekstraksiyonu için yüksek maliyetli araçlara dayanmayan değiştirilmiş bir DNA ekstraksiyon protokolü sunulmuştur. Bu protokol, >10 ng yüksek kaliteli DNA gerektiren deneyler için uygundur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19077</td>
			<td>Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AL Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19075</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW1 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19081</td>
			<td>Washing buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW2 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19072</td>
			<td>Washing buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagAttract Suspension G</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1026901</td>
			<td>magnetic bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead separator</td>
			<td>Epigentek</td>
			<td>Q10002-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>microvolume spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PK Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4489111</td>
			<td>Proteinase K buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td>fluorometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a magnetic-bead-based mosquito dna extraction protocol for next-generation sequencing

Manyetik boncuklar ve otomatik bir DNA ekstraksiyon cihazı kullanılarak yakın zamanda yayınlanan bir DNA ekstraksiyon protokolü, tüm genom dizilimleri için yeterli olan iyi korunmuş bir bireysel sivrisinekten yüksek kalite ve miktar DNA'sı çıkarmanın mümkün olduğunu öne sürdü. Bununla birlikte, pahalı bir otomatik DNA çıkarma cihazına güvenmek birçok laboratuvar için yasaklayıcı olabilir. Burada, çalışma düşük ila orta verim için uygun olan bütçe dostu manyetik boncuk bazlı BIR DNA ekstraksiyon protokolü sağlar. Burada açıklanan protokol, bireysel Aedes aegypti sivrisinek örnekleri kullanılarak başarıyla test edildi. Yüksek kaliteli DNA ekstraksiyonu ile ilişkili düşük maliyetler, kaynak sınırlı laboratuvarlara ve çalışmalara yüksek verim diziliminin uygulanmasını artıracaktır.

Bireysel sivrisinek başı/toraks dokusu başına ortalama DNA verimi 100 μL elüasyon tamponu kullanılarak elde edildiğinde florometre kullanılarak ölçülen 4.121 ng/μL (N = 92, standart sapma 3.513) idi. Bu, tüm genom kütüphanesi yapımı için gerekli olan 10-30 ng genomik DNA giriş gereksinimleri için yeterlidir1,7. DNA miktarı, sivrisinek vücut büyüklüğüne ve koruma koşullarına bağlı olarak 0,3-29,7 ng/μL arasında değişebilir. Yük...

Watch this Scientific Journal Video about A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

Burada, sivrisineklerden yüksek kaliteli DNA ekstraksiyonları üretmek için manyetik boncuklar kullanan bir DNA ekstraksiyon protokolü açıklanmıştır. Bu ekstraksiyonlar, aşağı akış yeni nesil sıralama yaklaşımı için uygundur.

Yeni Nesil Sıralama için Manyetik Boncuk Bazlı Sivrisinek DNA Ekstraksiyon Protokolü

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...

Bu bütçe dostu manyetik boncuk bazlı DNA ekstraksiyon protokolü, yüksek verim sıralamasını kaynak sınırlı laboratuvarları ve çalışmaları için erişilebilir hale getirir. Bu protokol, yüksek kaliteli DNA ekstraksiyonu için pahalı ekipman gerektirmez ve yüksek verim sıralaması için kaliteli yeterli miktarda DNA elde etmenin zor olduğu belirli tanı veya araştırma durumlarında yardımcı olabilir. Bu protokolün tek seferlik bir gösterimle çoğaltılması kolaydır.İş akışını tanımak için önce az sayıda örnekle denenmelidir. Başlamak için, 100 mikrolitre PCR sınıfı su ekleyerek ve dokuyu yumuşatmak için dört santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırarak% 70'ten fazla alkolde depolanan sivrisinek dokusu örneklerini nemlendirin. Kuluçkadan sonra, suyu atın ve 100 mikrolitre Proteinaz K tampon enzim karışımı ekleyin.Daha sonra dokuyu homojenize etmek için bir mikrosantrifüj tüp pestle kullanın. Homojenizasyondan sonra, doku lisatını santrifüj edin ve 56 santigrat derecede iki ila üç saat kuluçkaya yatırın. DNA'yı çıkarmak için, pipet 100 mikrolitre doku yeni bir temiz mikrosantrifüj tüpüne dökülür.Ardından manyetik boncuk ana karışımının 215 mikrolitresini ekleyin. Bir pipet kullanarak, lisat ve manyetik boncuk karışımını 10 ila 20 saniye karıştırın, ardından oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. Kuluçka sırasında, DNA'nın manyetik boncuklara bağlanmasını en üst düzeye çıkarmak için tüpü ara sıra hafifçe sallayın.Daha sonra, çözelti netleşene kadar tüpü manyetik boncuk ayırıcıya yerleştirin. Daha sonra bir pipet kullanarak, DNA'yı tutan manyetik boncukları bozmadan sıvıyı tüpten hafifçe emiş edin. Tüpü manyetik boncuk ayırıcıdan uzaklaştırın ve 325 mikrolitre yıkama tamponu ekleyerek boncukları yıkayın.Pipetleme ile iyice karıştırın ve oda sıcaklığında bir dakika kuluçkaya yatırarak karıştırın. Kuluçkadan sonra, tüpü manyetik boncuk ayırıcıya yerleştirin ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı çıkarın, ardından tüpü manyetik boncuk ayırıcıdan uzaklaştırın ve boncukları bir kez yıkama tamponu ile yıkayın. Tampon bir ile ikinci yıkamadan sonra, boncukları aynı şekilde 250 mikrolitre yıkama tamponu iki ile iki kez yıkayın.Son yıkamadan sonra, tüpü manyetik boncuk ayırıcıdan uzaklaştırın ve 100 mikrolitre elüasyon tamponu ekleyin. Pipetleme ile iyice karıştırın ve ardından tüpü manyetik ayırıcıya geri yerleştirmeden önce oda sıcaklığında iki dakika kuluçkaya yatırın. Çözelti netleştiğinde, süpernatantı yeni, temiz 0,5 mililitre mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve uygun şekilde saklayın.Burada, 0,5 milimolar EDTA içeren bir elüasyon tamponunda sivrisinek DNA'sının tipik bir mikrovolum florometre okuması olarak gösterilmiştir. Ortalama 260 ila 280 nanometre absorbans oranı 2,3'dür. Bu tabloda, farklı ayıklama yöntemleri için bir iş gününde işlenen maliyetler ve numune sayısı gösterilmiştir.Bu protokolle bir ekstraksiyon için tipik reaktif ve sarf malzemesi maliyeti örnek başına yaklaşık 9,50'dir. Bu maliyet, tipik manyetik boncuk bazlı ekstraksiyon yöntemine eşdeğerdir. Bu protokolün en büyük maliyet avantajı, otomatik DNA çıkarma cihazı gerektirmemekten kaynaklanır.Birden fazla örnekle çalışırken DNA'nın çapraz kirlenmesini önlemek için numuneler arasındaki pipet uçlarını değiştirdiğinizi unutmayın. Bu yöntem kullanılarak çıkarılan yüksek kaliteli DNA'yı tüm genom dizilimleri için kullanıyoruz. Şu anda insektisit direncindeki yeni mutasyonları veya halk sağlığı ve hastalık kontrolünde endişe verici bağışıklık genlerini tanımlamak için sıralama verilerini kullanıyoruz.Yüksek verimli dizileme için uygun fiyatlı çözümlere sahip olmak, birçok yeni genetik kontrol stratejisinin başarısını etkileyen sivrisinek dağılımını ve gen akışını anlamayı amaçlayan popülasyon genomikleri ve peyzaj genomikleri için heyecan verici kapılar açar.

Research

JoVE Journal

Biology

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

Sivrisinek Yetiştirme Protokolü (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

16S Ribozomal RNA Gen amplikonlarının nesil Sıralama

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

DNA Metilasyon Analizi nesil Dizilimine tarafından hedef

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

Bakteriyel Topluluk Karakterizasyonu Verimli Nükleik Asit Ekstraksiyonu ve 16S rRNA gen Sıralama

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interactome-Seq: Domainome kitaplığı inşaat, doğrulama ve seçim fajının görüntü ve sonraki nesil sıralama için bir protokol

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Kene Microbiome karakterizasyonu tarafından yeni nesil 16S rRNA Amplicon sıralama

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

İki adımlı PCR ve Yeni Nesil 16S rRNA Gen Sıralaması Kullanarak Mikrobiyota Analizi

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Creating Robust Bisulfite-mRNA Libraries for Transcriptome-Wide Mapping

Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing

Decoding RNA Methylation's Role in Pancreatic Cancer - A Single-Base Resolution Study (Video) | JoVE

Yeni Nesil Dizileme için mRNA ve Bisülfit-mRNA Kütüphanesinin Zenginleştirilmesi Hazırlığı

RNA post-transcriptional modifications in various types of RNA transcripts are associated with diverse RNA regulation in eukaryotic cells. Aberrant RNA ...