Name: &#181;tongue: a microfluidics-based functional imaging platform for the tongue in vivo
Uploaded: 2021-04-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ã‚ÂµTongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Institute of Basic Science (IBS-R015-D1), National Research Foundation of Korea (NRF) tilskud finansieret af Koreas regering (MSIT) (nr. 2019M3A9E2061789) og af National Research Foundation of Korea (NRF) tilskud finansieret af Koreas regering (MSIT) (nr. 2019M3E5D2A01058329). Vi er taknemmelige for Eunsoo Kim og Eugene Lee for deres tekniske bistand.

Alle kirurgiske procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Sungkyunkwan University og Seoul National University.
1. Tilberedning af opløsninger: kunstig spyt og smagsstoffer
<ol><li>Klargør kunstig spyt ved opløsning 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3, 3 mM KHCO3, 0,25 mM CaCl2, 0,25 mM MgCl2, 0,12 mM K2HPO4, 0,12 mM KH 2 PO4og 1,8 mM HCl i destilleret vand (>1 L), og juster...

<ol>
	<li>Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+subcellular+targeting+of+GCaMP-type+genetically-encoded+calcium+indicators.">Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators.</a> PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain.">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).</li><li>Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence+microscopy:+Lessons+from+observing+cell+behavior+in+their+native+environment.">In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment.</a> Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).</li><li>Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Ca2++imaging+reveals+neurotransmitter+receptors+for+glutamate+in+taste+receptor+cells.">In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells.</a> Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).</li><li>Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+and+taste+coding+in+mammalian+taste+buds.">Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds.</a> Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).</li><li>Dando, R., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+communication+in+intact+taste+buds+through+ATP+signalling+from+pannexin+1+gap+junction+hemichannels.">Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels.</a> The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).</li><li>Chandrashekar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cells+and+peripheral+representation+of+sodium+taste+in+mice.">The cells and peripheral representation of sodium taste in mice.</a> Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).</li><li>Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+salt+recruits+aversive+taste+pathways.">High salt recruits aversive taste pathways.</a> Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).</li><li>Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopic+interrogation+of+peripheral+taste+sensation.">Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation.</a> Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).</li><li>Han, J., Choi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+functional+screening+of+taste+sensation+in+vivo.">Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo.</a> bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).</li><li>Thestrup, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+ratiometric+calcium+sensors+for+functional+in+vivo+imaging+of+neurons+and+T+lymphocytes.">Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes.</a> Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).</li><li>Danilova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glossopharyngeal+nerves+to+taste+stimuli+in+C57BL+/+6J+mice.">Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice.</a> BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Tan, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut-brain+axis+mediates+sugar+preference.">The gut-brain axis mediates sugar preference.</a> Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).</li><li>Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+anion+in+salt+(NaCl)+detection+by+mouse+taste+buds.">The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).</li><li>Kusuhara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taste+responses+in+mice+lacking+taste+receptor+subunit+T1R1.">Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1.</a> Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).</li></ol>

Beskrevet her er en detaljeret protokol til at anvende μTongue til undersøgelse af funktionelle aktiviteter af smagsceller in vivo. I denne protokol udføres den funktionelle billeddannelse på smagscellerne ved hjælp af genetisk kodede calciumindikatorer. Ud over brugen af transgene mus kan den elektroforeretiske belastning af calciumfarvestoffer (eller spændingsfølsomfarvestoffer) på smagscellerne være en alternativ mulighed.
Alle smagsløsninger mindre end 1.336 af brydnings...

Intravital fluorescens mikroskop bruges i vid udstrækning til at studere spatiotemporal dynamik på levende væv. Forskere er i rivende udvikling genetisk kodede sensorer, der giver specifikke og følsomme transformationer af de biologiske processer til fluorescenssignaler - som let kan registreres ved hjælp af fluorescensmikroskoper, der er bredt tilgængelige1,2. Selvom de fleste indre organer hos gnavere er blevet undersøgt ved hjælp af mikroskopet, har dets vellykkede anvendelse på tungen endnu ikke været vellykket3.
Tidligere undersøgelser af calcium imaging af smagsceller blev udført ex vivo ved tynd-sektion en tunge væv for at opnå circumvallate smagsløg4,5,6 eller ved peeling off smagen epitel for at opnå fungiforme smagsløg7,8. Forberedelsen af disse prøver var uundgåeligt invasiv, således var de naturlige mikromiljøer såsom nerver innervation, permeabilitet barrierer, og blodcirkulationen, stort set forstyrret. Den første intravital tunge imaging vindue blev rapporteret i 2015 af Choi et al., men pålidelig funktionel optagelse var ikke opnåelig på grund af bevægelse og optiske artefakter forårsaget af fluidictastant stimuli9.
For nylig blev mikrofluidics-on-a-tongue (μTongue) introduceret10. Denne enhed integrerer et mikrofluidisk system med et billedvindue på musetungen. Ved at opnå en kvasi-steady-state strøm af smagsfulde stimuli i hele billeddannelsesperioden, artefakter fra fluidisk bevægelse kunne minimeres (Figur 1). Indgangsporten føres af en række multikanaltrykregulatorer, mens udgangsporten er tilsluttet en sprøjtepumpe, som opretholder 0,3 mL/min. Derudover blev optiske artefakter forårsaget af forskellen i brydningsindekser for smagsopløsninger minimeret ved ratiometrisk analyse, der introducerede en calciumfølsom indikator (tdTomato) samt calciumindikatoren (GCaMP6)11. Dette design gav mikroskopisk stabilitet af smagsceller in vivo selv med pludselige skift mellem fluidic kanaler. Derfor implementerer μTongue en pålidelig funktionel screening af flere smagsstoffer til musens smagsløg in vivo.
I denne protokol forklares forsøgsprocedurerne i detaljer for calciumbilleddannelse af musesvampformsmagetasterne in vivo ved hjælp af μTongue. For det første beskrives forberedelsen af kunstig spyt og velsmagende opløsninger. For det andet indføres oprettelsen af det mikrofluidiske system for at opnå den næsten steady-state-strømning. For det tredje afgrænses de procedurer, der anvendes til at montere musetungen på μTongue for at tillade billedopsamling. Endelig er hvert trin til billedanalyse, herunder korrektion af laterale bevægelsesartefakter og ratiometri, angivet. Denne protokol kan let tilpasses ethvert forskningslaboratorium med en musefacilitet og et to-fotonmikroskop eller tilsvarende udstyr.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>acesulfame K</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>04054-25G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>21115-100ML</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0759-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>01810-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>denatonium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5765-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental glue</td>
			<td>Denkist</td>
			<td>P0000CJT-A2</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>57510-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>Loctite 4161, Henkel</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3786-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Yuhan</td>
			<td>Ketamine 50</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0662-25G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>237205-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathwork</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49601-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutiphoton microscope</td>
			<td>Thorlab</td>
			<td>&#160;Bergamo II</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>792519-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N16XLWD-PF</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octaflow</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>OCTAFLOW II</td>
			<td>Fluidic control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC</td>
			<td>LG</td>
			<td>Lg15N54</td>
			<td>Fluidic control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH meter</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>ORION STAR AZ11</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>806562</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quinine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Q1125-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Havard Apparatus</td>
			<td>PHD ULTRA 4400</td>
			<td>Fluidic control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>52194-1G</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafast fiber laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>FFultra920 01042</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer Korea</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

&#181;tongue: a microfluidics-based functional imaging platform for the tongue in vivo

Intravital fluorescensmikroskopi er et værktøj, der i vid udstrækning anvendes til at studere flercellet dynamik i et levende dyr. Det er dog ikke blevet anvendt med succes i smagssensororganet. Ved at integrere mikrofluidics i intravital tunge billeddannelse vindue, μTongue giver pålidelige funktionelle billeder af smagsceller in vivo under kontrolleret eksponering for flere smagsmidler. I dette papir præsenteres en detaljeret trinvis procedure for at udnytte μTongue-systemet. Der er fem underafsnit: udarbejdelse af lækre løsninger, opsætning af et mikrofluidisk modul, prøvemontering, erhvervelse af funktionelle billeddata og dataanalyse. Nogle tips og teknikker til at løse de praktiske problemer, der kan opstå, når du bruger μTongue er også præsenteret.

Pirt-GCaMP6f-tdTomato musen blev brugt til at opnå en smagsløg billede. Overfladen af musetungen var dækket af autofluorescent filiform papillae. Smagsløg spredes sparsomt over tungens overflade (Figur 4A). Billederne af smagsløget og dens struktur blev erhvervet ved hjælp af tre forskellige filterdetektorer. Ved hjælp af filtersættet på 607/70 nm blev tdTomato-signalet fra smagscellerne opnået til ratiometrisk analyse (Figur 4B). Ved hjælp af 525/50 ...

Watch this Scientific Journal Video about Ã‚ÂµTongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo at JoVE.com

Ãƒâ€šÃ‚ÂµTongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

Artiklen introducerer μTongue (microfluidics-on-a-tongue) enhed til funktionel smag celle imaging in vivo ved at integrere mikrofluidics i en intravital billeddannelse vindue på tungen.

μTongue: En mikrofluidics-baseret funktionel billeddannelse platform for tungen In Vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...

Denne protokol gør det muligt at observere funktionerne i smagsceller i et naturligt mikromiljø med neurale forbindelser og blodcirkulation forbliver intakt. Ved hjælp af denne teknik kan celle-til-celle kommunikation undersøges in vivo. Til at begynde med fylde reservoirerne i det tryksatte flowperfusionssystem med kunstig spyt og smagsmidler.Tilslut trykluftledningen til regulatorens indgang, og indstil lufttrykket i det fluidiske leveringssystem til 30 til 50 pund pr. Kvadrattomme. Indstil udgangstrykket af regulatoren til 0,4 pounds per kvadrattomme og kontrollere, om væsken begynder at flyde ud fra røret. Tilslut manifolden fra reservoirerne til mikrotungens indgangsport, og tilslut derefter mikrotungens udgangsport til en sprøjtepumpe og træk væsken tilbage med ca. 300 mikroliter i minuttet for at etablere en stabil tilstand.Bekræft, at dråbens volumen, der hænger under mikrotungen, forbliver konstant, og juster lufttrykket og strømningshastigheden for at opnå den ønskede prøvehøjde. Når det mikrofluidiske system er sat op, skal du afbryde trykluftledningen og slukke for sprøjtepumpen, indtil musen er forberedt til in vivo-billeddannelse. Efter administration af anæstesi til musen, intravenøst injicere TRITC-dextran gennem en retro-orbital rute for at observere blodcirkulationen under billeddannelse.Med musen placeret i en liggende position, spray 70% ethanol på hovedet. Brug sammentak til at løfte hovedet huden let, derefter bruge en saks til at klippe omkring syv kvadrat millimeter hud. Efter rengøring af håret omkring hovedbunden, fjerne periosteum fra under huden og anvende en øjeblikkelig klæbemiddel til kraniet.Fastgør derefter den tilpassede hovedfikser. Når det øjeblikkelige klæbemiddel er hærdet, skal du anvende tandlim omkring hovedfikseren og størkne det ved belysning med blåt lys. Ved hjælp af øjeblikkelig lim til at lime underlæben af musen til den nederste enhed af mikro tungen, derefter placeret musen på musen forberedelse bord og fastgør den nederste enhed på mikro tungen til hold stillinger ved at justere hullerne på kanten af mikro tungen med stolperne.Stram musehovedets fixer til hovedfikserholderen på brættet, og juster afstanden mellem musehovedet og enheden. Derefter skal du bruge hovedfikserholderen, rotere musehovedet jævnt med ca. 45 grader. Når du har sikret musen til brættet, skal du bruge plastik pincet til at trække tungen forsigtigt.Derefter ved hjælp af instant lim, vedhæfte den ventrale side af tungen til oversiden af den nederste enhed af mikro tungen. For at holde tungen fugtig, tør overfladen med en våd vatpind, og læg derefter et stykke væv gennemblødt i kunstig spyt på tungens udsatte overflade. Placer de buede skiver på stolperne, hold den nederste del af mikrotungen, og flyt derefter museforberedelsen til mikroskopstadiet.Placer musens udsatte tunge under det omtrentlige centrum af mikroskopmålområdet, og sørg for ikke at afvige fra scenens dynamiske område, og stram derefter skruerne for fast at fastgøre musebrættet på scenen. Placer en varmepude under musen for at opretholde sin kropstemperatur mellem 36,5 og 37,5 grader Celsius. For at forhindre væske i at komme ind i muserøret, skal du placere et tyndt stykke snoet papir inde i musens mund, derefter fjerne det våde væv, der er placeret på tungens overflade og placere den forberedte mikrotunge på musetungen, så tungens overflade er synlig gennem billedvinduet.Fastgør mikrotungen ved forsigtigt at skrue begge ender med minimalt tryktryk. For at begynde at erhverve billeder skal du åbne mikroskopsoftwaren og derefter tænde for 920 nanometer to-foton laser. Monter målet for nedsænkning af vand på mikroskopet, sænk derefter målet på mikrotungens billedvindue, og sænk målet.I kameratilstand skal du belyse tungens overflade ved at tænde for det blå lys fra en kviksølvlampe. For at finde det omtrentlige fokale plan skal du justere Z-aksen og søge efter et autofluorescence-signal fra filiformpapilleren. Derefter ved hjælp af X og Y justering drejeknap, finde en smagsløg.Skift til multi-foton-tilstand, og indstil derefter excitationsbølgelængden, emissionsfiltersættet, scanningstilstanden og rammestørrelsen til billedopsamling. Med smagsløget i midten af billedvinduet skal blodkarrene omkring smagsløget placeres på omkring to tredjedele af smagsløgets højde og visualisere blodcirkulationen. Hvis blodgennemstrømningen er tilstoppet, løsnes fastgørelsesskruerne lidt for at genoptage blodgennemstrømningen.Juster Z-aksen for at finde Z-flyet af en smagsløg, der indeholder et passende antal smagsceller, og fortsæt derefter med calciumbilleddannelse ved to til seks Hertz i 80 sekunder. Når billeddannelsen er startet, skal du tænde for det fluidiske systems reservoir for at give en smagsopløsning i 20 sekunder. Efter 20 sekunders smagsstimulering skal du skifte reservoiret tilbage til kunstig spyt.Under billeddannelse, vente i omkring tre til fire minutter mellem sessioner konsekvent giver kunstig spyt til at holde tungen fugtig og vaske væk den smagsvæske resterende fra den foregående session. Tungen overfladen af Pirt-GCaMP6f-tdTomato mus er dækket med autofluorescent filiform papillae og sparsomt spredte smagsløg. Filiformen papillae i gult fanges ved hjælp af en fotodetektor ved 500 til 550 nanometer og kan observeres fra selve overfladen af tungen op til ca. 25 mikrometer i dybden.GCaMP-signalerne i grønt, der registreres af 500 til 550 nanometrefilteret og tdTomato-signalerne i rødt, som detekteres af 607 til 670 nanometerfilteret, repræsenterer smagscellerne. TdTomato-signalet opnås til analyse af forholdet metriske. Blodkarrene, der omgiver smagsløget, erhverves ved hjælp af 500 til 550 nanometerfilteret, der er indstillet i kollagen bindevævet, som strukturelt understøtter smagsløget, erhverves ved hjælp af 447 til 460 nanometerfiltersættet.I dette repræsentative eksempel på in-vivo smag screening ved hjælp af calcium imaging, hver smag celle er afgrænset af stiplede linjer. I dette forsøg reagerede celle 2 på både søde og umamitastanter. Og celle 3 reagerede på både lav og højt salttastanter.Ingen af cellerne i denne smagsløg reagerede på sur smag. Da formålet med dette eksperiment er at observere smagscellefunktion i det naturlige miljø, er det vigtigt at levere fluorescerende i blodkarrene ved forberedelsestrinnet og bekræfte dets cirkulation under eksperimentet.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Høj opløsning funktionel magnetisk resonans Metoder til human midthjernen

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionel Neuroimaging Med Ultrasonic blod-hjerne barrieren forstyrrelser og mangan-forstærket MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging af Postnatal cerebellare Granule Cell Migration Brug Konfokal makroskopi

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidige<em&gt; Ex vivo</em&gt; Functional Test af to nethinder af<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogrammet System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Høj opløsning Strukturel Magnetic Resonance Imaging af Human subcortex<I&gt; In vivo</I&gt; Og Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In vivo Funktionel Brain Imaging tilgang baseret på Bioluminescent Calcium Indikator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

En volumetriske metode til kvantificering af Cerebral vasospasme i en Murine Model af subaraknoid blødning

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo To-foton billeddannelse af kortikale neuroner i Neonatal mus

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

In vivo billeddannelse af cerebrospinalvæske transport gennem intakt mus kraniet ved hjælp af fluorescens makroskopi

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...