Name: &#181;tongue: a microfluidics-based functional imaging platform for the tongue in vivo
Uploaded: 2021-04-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ã‚ÂµTongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het Institute of Basic Science (IBS-R015-D1), de National Research Foundation of Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT) (nr. 2019M3A9E2061789), en door de National Research Foundation of Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT) (nr. 2019M3E5D2A01058329). We zijn Eunsoo Kim en Eugene Lee dankbaar voor hun technische assistentie.

Alle chirurgische ingrepen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Sungkyunkwan University en Seoul National University.
1. Bereiding van oplossingen: kunstmatig speeksel en smaakstoffen
<ol><li>Bereid kunstmatig speeksel door 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3,3 mM KHCO3,0,25 mM CaCl2,0,25 mM MgCl2,0,12 mM K2HPO4,0,12 mM KH2PO4en 1,8 mM HCl in gedestilleerd water ...

<ol>
	<li>Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+subcellular+targeting+of+GCaMP-type+genetically-encoded+calcium+indicators.">Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators.</a> PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain.">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).</li><li>Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence+microscopy:+Lessons+from+observing+cell+behavior+in+their+native+environment.">In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment.</a> Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).</li><li>Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Ca2++imaging+reveals+neurotransmitter+receptors+for+glutamate+in+taste+receptor+cells.">In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells.</a> Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).</li><li>Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+and+taste+coding+in+mammalian+taste+buds.">Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds.</a> Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).</li><li>Dando, R., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+communication+in+intact+taste+buds+through+ATP+signalling+from+pannexin+1+gap+junction+hemichannels.">Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels.</a> The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).</li><li>Chandrashekar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cells+and+peripheral+representation+of+sodium+taste+in+mice.">The cells and peripheral representation of sodium taste in mice.</a> Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).</li><li>Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+salt+recruits+aversive+taste+pathways.">High salt recruits aversive taste pathways.</a> Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).</li><li>Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopic+interrogation+of+peripheral+taste+sensation.">Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation.</a> Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).</li><li>Han, J., Choi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+functional+screening+of+taste+sensation+in+vivo.">Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo.</a> bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).</li><li>Thestrup, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+ratiometric+calcium+sensors+for+functional+in+vivo+imaging+of+neurons+and+T+lymphocytes.">Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes.</a> Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).</li><li>Danilova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glossopharyngeal+nerves+to+taste+stimuli+in+C57BL+/+6J+mice.">Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice.</a> BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Tan, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut-brain+axis+mediates+sugar+preference.">The gut-brain axis mediates sugar preference.</a> Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).</li><li>Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+anion+in+salt+(NaCl)+detection+by+mouse+taste+buds.">The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).</li><li>Kusuhara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taste+responses+in+mice+lacking+taste+receptor+subunit+T1R1.">Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1.</a> Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).</li></ol>

Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven om μTongue toe te passen op het onderzoek naar functionele activiteiten van smaakcellen in vivo. In dit protocol wordt de functionele beeldvorming op de smaakcellen met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren uitgevoerd. Naast het gebruik van transgene muizen kan de elektroforetische belasting van calciumkleurstoffen (of spanningsgevoelige kleurstoffen) op de smaakcellen een alternatieve optie zijn.
Alle smaakoplossingen van...

De intravitale fluorescentiemicroscoop wordt veel gebruikt om de spatiotemporale dynamiek op levende weefsels te bestuderen. Onderzoekers ontwikkelen snel genetisch gecodeerde sensoren die specifieke en gevoelige transformaties van de biologische processen in fluorescentiesignalen bieden - die gemakkelijk kunnen worden geregistreerd met behulp van fluorescentiemicroscopen die op grote schaal beschikbaar zijn1,2. Hoewel de meeste inwendige organen bij knaagdieren zijn onderzocht met behulp van de microscoop, is de succesvolle toepassing ervan op de tong nog niet succesvol geweest3.
Eerdere studies naar de calciumbeeldvorming van smaakcellen werden ex vivo uitgevoerd door een tongweefsel dun te sectien om circumvallaat smaakpapillen te verkrijgen4,5,6 of door het smaakepitheel af te pellen om fungiforme smaakpapillen te verkrijgen7,8. De voorbereiding van deze monsters was onvermijdelijk invasief, dus de natuurlijke micro-omgevingen zoals zenuwinnervatie, permeabiliteitsbarrières en bloedcirculatie werden grotendeels verstoord. Het eerste intravitale tongbeeldvormingsvenster werd in 2015 gerapporteerd door Choi et al., maar betrouwbare functionele opname was niet haalbaar vanwege de beweging en optische artefacten veroorzaakt door fluïde smaakstofstimuli9.
Onlangs werd microfluïdica-op-een-tong (μTongue) geïntroduceerd10. Dit apparaat integreert een microfluïdisch systeem met een beeldvenster op de muizentong. Door gedurende de hele beeldvormingsperiode een quasi-steady-state stroom van smakelijke stimuli te bereiken, konden artefacten van vloeiende bewegingen worden geminimaliseerd(figuur 1). De ingangspoort wordt gevoed door een reeks meerkanaals drukregelaars, terwijl de uitgangspoort is aangesloten op een spuitpomp, die 0,3 ml / min behoudt. Bovendien werden optische artefacten veroorzaakt door het verschil in brekingsindices van smaakoplossingen geminimaliseerd door ratiometrische analyse die een calciumongevoelige indicator (tdTomato) en de calciumindicator (GCaMP6) introduceerde11. Dit ontwerp zorgde voor microscopische stabiliteit van smaakcellen in vivo, zelfs bij abrupt schakelen tussen vloeistofkanalen. Bijgevolg implementeert de μTongue een betrouwbare functionele screening van meerdere smaakstoffen op de smaakpapillen van de muis in vivo.
In dit protocol worden de experimentele procedures in detail uitgelegd voor calciumbeeldvorming van de fungiforme smaakpapillen van muizen in vivo met behulp van μTongue. Eerst wordt de bereiding van kunstmatig speeksel en smakelijke oplossingen beschreven. Ten tweede wordt het opzetten van het microfluïdische systeem geïntroduceerd om de quasi-steady-state flow te bereiken. Ten derde worden de procedures die worden gebruikt om de muizentong op de μTongue te monteren om beeldacquisitie mogelijk te maken, afgebakend. Ten slotte wordt elke stap voor beeldanalyse, inclusief correctie van laterale bewegingsartefacten en ratiometrie, gespecificeerd. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan elk onderzoekslaboratorium met een muisfaciliteit en een microscoop met twee fotonen of gelijkwaardige apparatuur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>acesulfame K</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>04054-25G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>21115-100ML</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0759-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>01810-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>denatonium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5765-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental glue</td>
			<td>Denkist</td>
			<td>P0000CJT-A2</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>57510-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>Loctite 4161, Henkel</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3786-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Yuhan</td>
			<td>Ketamine 50</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0662-25G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>237205-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathwork</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49601-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutiphoton microscope</td>
			<td>Thorlab</td>
			<td>&#160;Bergamo II</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>792519-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N16XLWD-PF</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octaflow</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>OCTAFLOW II</td>
			<td>Fluidic control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC</td>
			<td>LG</td>
			<td>Lg15N54</td>
			<td>Fluidic control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH meter</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>ORION STAR AZ11</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>806562</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quinine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Q1125-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Havard Apparatus</td>
			<td>PHD ULTRA 4400</td>
			<td>Fluidic control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>52194-1G</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafast fiber laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>FFultra920 01042</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer Korea</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

&#181;tongue: a microfluidics-based functional imaging platform for the tongue in vivo

Intravitale fluorescentiemicroscopie is een hulpmiddel dat op grote schaal wordt gebruikt om meercellige dynamica in een levend dier te bestuderen. Het is echter niet met succes gebruikt in het smaaksensorische orgaan. Door microfluïdica te integreren in het intravitale tongbeeldvormingsvenster, biedt de μTongue betrouwbare functionele beelden van smaakcellen in vivo bij gecontroleerde blootstelling aan meerdere smaakstoffen. In dit artikel wordt een gedetailleerde stapsgewijze procedure gepresenteerd om het μTongue-systeem te gebruiken. Er zijn vijf subsecties: voorbereiden van smakelijke oplossingen, opzetten van een microfluïdische module, monstermontage, verkrijgen van functionele beeldgegevens en gegevensanalyse. Enkele tips en technieken om de praktische problemen op te lossen die zich kunnen voordoen bij het gebruik van de μTongue worden ook gepresenteerd.

De Pirt-GCaMP6f-tdTomato muis werd gebruikt om een smaakpapillenbeeld te verkrijgen. Het oppervlak van de muizentong was bedekt met autofluorescente filiforme papillen. Smaakpapillen worden schaars verspreid over het oppervlak van de tong(figuur 4A). De beelden van de smaakpapillen en zijn structuur werden verkregen met behulp van drie verschillende filterdetectoren. Met behulp van de 607/70 nm filterset werd het tdTomato signaal van de smaakcellen verkregen voor ratiometrische analyse<stron...

Watch this Scientific Journal Video about Ã‚ÂµTongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo at JoVE.com

Ãƒâ€šÃ‚ÂµTongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

Het artikel introduceert het μTongue (microfluidics-on-a-tongue) apparaat voor functionele smaakcelbeeldvorming in vivo door microfluïdica te integreren in een intravitaal beeldvormingsvenster op de tong.

μTongue: een op microfluïdica gebaseerd functioneel beeldvormingsplatform voor de tong in vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...

Dit protocol maakt het mogelijk om de functies van smaakcellen in een natuurlijke micro-omgeving te observeren, waarbij neurale verbindingen en bloedcirculatie intact blijven. Met behulp van deze techniek kan cel-naar-cel communicatie in vivo worden onderzocht. Vul om te beginnen de reservoirs van het onder druk staande stroomperfusiesysteem met kunstmatig speeksel en smaakstoffen.Sluit de persluchtleiding aan op de ingang van de regelaar en stel de luchtdruk in het vloeistoftoevoersysteem in op 30 tot 50 pond per vierkante inch. Stel de uitgangsdruk van de regelaar in op 0,4 pond per vierkante inch en controleer of er vloeistof uit de buis begint te stromen. Sluit het spruitstuk van de reservoirs aan op de ingangspoort van de microtong, sluit vervolgens de uitgangspoort van de microtong aan op een spuitpomp en zuig vloeistof op met ongeveer 300 microliter per minuut om een steady state-toestand vast te stellen.Controleer of het volume van de druppel die onder de microtong hangt constant blijft en pas de luchtdruk en het debiet aan om de gewenste monsterhoogte te verkrijgen. Zodra het microfluïdische systeem is ingesteld, koppelt u de persluchtleiding los en schakelt u de spuitpomp uit totdat de muis is voorbereid op in vivo beeldvorming. Na toediening van anesthesie aan de muis, intraveneus injecteren TRITC-dextran via een retro-orbitale route om de bloedcirculatie tijdens de beeldvorming te observeren.Met de muis in rugligging spuit je 70% ethanol op zijn kop. Gebruik een tang om de hoofdhuid licht op te tillen en gebruik vervolgens een schaar om ongeveer zeven vierkante millimeter huid af te knippen. Na het reinigen van het haar rond de hoofdhuid, verwijdert u het botvlies van onder de huid en brengt u een onmiddellijke lijm aan op de schedel.Bevestig vervolgens de op maat gemaakte hoofdfixer. Zodra de instantlijm is uitgehard, breng je tandlijm aan rond de hoofdfixer en stolt je deze door verlichting met een blauw licht. Gebruik instantlijm om de onderlip van de muis aan de onderkant van de microtong te lijmen, plaats de muis vervolgens op het muisvoorbereidingsbord en bevestig de onderste eenheid bij de microtong aan de houdpalen door de gaten aan de rand van de microtong uit te lijnen met de palen.Draai de muiskopfixer vast aan de hoofdfixerhouder op het bord en pas de afstand tussen de muiskop en het apparaat aan. Gebruik vervolgens de hoofdfixerhouder en draai de muiskop ongeveer 45 graden soepel. Nadat je de muis aan het bord hebt vastgepind, gebruik je een plastic pincet om zijn tong voorzichtig te trekken.Bevestig vervolgens met behulp van instantlijm de ventrale kant van de tong aan de bovenkant van de onderste eenheid van de microtong. Om de tong vochtig te houden, veegt u het oppervlak af met een nat wattenstaafje en plaatst u vervolgens een stuk weefsel gedrenkt in kunstmatig speeksel op het blootgestelde oppervlak van de tong. Plaats de gebogen ringen op de palen, houd het onderste deel van de microtong vast en verplaats vervolgens de muisvoorbereiding naar de microscoopfase.Plaats de blootgestelde tong van de muis onder het geschatte midden van het microscoopobject, zorg ervoor dat u niet afwijkt van het dynamische bereik van het podium en draai vervolgens de schroeven aan om het muisbord stevig op het podium te bevestigen. Plaats een verwarmingskussen onder de muis om de lichaamstemperatuur tussen 36,5 en 37,5 graden Celsius te houden. Om te voorkomen dat vloeistof de luchtpijp van de muis binnendringt, plaatst u een dun stuk gedraaid papier in de mond van de muis, verwijdert u vervolgens het natte weefsel dat op het oppervlak van de tong is geplaatst en plaatst u de voorbereide microtong op de muizentong, zodat het oppervlak van de tong zichtbaar is door het beeldvormingsvenster.Zet de microtong vast door beide uiteinden voorzichtig te schroeven met minimale drukdruk. Om te beginnen met het verkrijgen van afbeeldingen, opent u de microscoopsoftware en schakelt u vervolgens de 920 nanometer tweefotonlaser in. Monteer het onderdompelingsobject objectief op de microscoop, laat het objectief vervolgens op het beeldvenster van de microtong zakken en dompel het objectief onder.Verlicht in de cameramodus het oppervlak van de tong door het blauwe licht van een kwiklamp in te schakelen. Om het geschatte brandpuntsvlak te vinden, past u de Z-as aan en zoekt u naar een autofluorescentiesignaal van de filiforme papillen. Gebruik vervolgens de X- en Y-instelknop om een smaakpapillen te vinden.Schakel over naar de multi-fotonmodus en stel vervolgens de excitatiegolflengte, de emissiesfilterset, de scanmodus en de framegrootte in voor beeldacquisitie. Met de smaakpapillen in het midden van het beeldvormingsvenster, lokaliseer je de bloedvaten rond de smaakpapillen op ongeveer tweederde van de hoogte van de smaakpapillen en visualiseer je de bloedcirculatie. Als de bloedstroom verstopt is, maak dan de bevestigingsschroeven iets los om de bloedstroom te hervatten.Pas de Z-as aan om het Z-vlak van een smaakpapillen te vinden die een voldoende aantal smaakcellen bevat en ga vervolgens verder met calciumbeeldvorming bij twee tot zes Hertz gedurende 80 seconden. Nadat de beeldvorming is gestart, schakelt u het reservoir van het vloeistofsysteem in om gedurende 20 seconden een smaakoplossing te bieden. Schakel na 20 seconden smaakstimulatie het reservoir terug naar kunstmatig speeksel.Wacht tijdens het afbeelden ongeveer drie tot vier minuten tussen de sessies en geef consequent kunstmatig speeksel om de tong vochtig te houden en het smakelijke dat overblijft van de vorige sessie weg te spoelen. Het tongoppervlak van de Pirt-GCaMP6f-tdTomato-muis is bedekt met autofluorescente filiforme papillen en dun gespreide smaakpapillen. De filiforme papillen in geel worden vastgelegd met behulp van een fotodetector op 500 tot 550 nanometer en kunnen worden waargenomen vanaf het oppervlak van de tong tot ongeveer 25 micrometer diep.De GCaMP-signalen in het groen gedetecteerd door het 500 tot 550 nanometer filter en de tdTomato-signalen in rood, gedetecteerd door het 607 tot 670 nanometer filter, vertegenwoordigen de smaakcellen. Het tdTomato-signaal wordt verkregen voor ratiometrische analyse. De bloedvaten die de smaakpapillen omringen, worden verkregen met behulp van de 500 tot 550 nanometer filterset in het collageen bindweefsel, dat de smaakpapillen structureel ondersteunt, wordt verkregen met behulp van de 447 tot 460 nanometer filterset.In dit representatieve voorbeeld van in-vivo smaakscreening met behulp van calciumbeeldvorming wordt elke smaakcel afgebakend door stippellijnen. In deze proef reageerde cel 2 op zowel zoete als umami-smaakstoffen. En cel 3 reageerde op zowel laag als hoog zout.Geen van de cellen in deze smaakpapillen reageerde op zure smaken. Omdat het doel van dit experiment is om de smaakcelfunctie in de natuurlijke omgeving te observeren, is het belangrijk om de fluorescentiestoffen tijdens de bereidingsstap in de bloedvaten af te geven en de circulatie tijdens het experiment te bevestigen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

Functionele Mapping met gelijktijdige MEG en EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Hoge resolutie functionele magnetische resonantie imaging methoden voor Human middenhersenen

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Functionele neuroimaging Met behulp van ultrasone bloed-hersen barrière verstoring en mangaan-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex vivo beeldvorming van postnatale cerebellaire Korrel Cell Migration met behulp van confocale Macroscopie

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaan<em&gt; Ex vivo</em&gt; Functioneel testen van Two netvliezen door<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Hoge-resolutie structurele Magnetic Resonance Imaging van de Human subcortex<I&gt; In Vivo</I&gt; En Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In vivo Functional Brain Imaging aanpak op basis van Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorine

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Een volumetrische methode voor de kwantificering van cerebrale Vasospasm in een lymfkliertest Model van subarachnoïdale bloeding

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Twee-foton beeldvorming van corticale neuronen in neonatale muizen

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

In vivo beeldvorming van cerebrospinale vloeistof transport door de intact Mouse schedel met behulp van fluorescentie Macroscopie

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...