Name: &#181;tongue: a microfluidics-based functional imaging platform for the tongue in vivo
Uploaded: 2021-04-22T15:00:00
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Ce travail a été soutenu par l’Institut des sciences fondamentales (IBS-R015-D1), la subvention de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIT) (n° 2019M3A9E2061789) et par la subvention de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIT) (n° 2019M3E5D2A01058329). Nous sommes reconnaissants à Eunsoo Kim et Eugene Lee pour leur assistance technique.

Toutes les interventions chirurgicales ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université Sungkyunkwan et de l’Université nationale de Séoul.
1. Préparation des solutions: salive artificielle et tastants
<ol><li>Préparer la salive artificielle en dissolvant 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3, 3 mM KHCO3, 0,25 mM CaCl2, 0,25 mM MgCl2, 0,12 mM K2HPO4, 0,12 mM KH2PO...

<ol>
	<li>Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+subcellular+targeting+of+GCaMP-type+genetically-encoded+calcium+indicators.">Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators.</a> PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain.">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).</li><li>Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence+microscopy:+Lessons+from+observing+cell+behavior+in+their+native+environment.">In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment.</a> Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).</li><li>Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Ca2++imaging+reveals+neurotransmitter+receptors+for+glutamate+in+taste+receptor+cells.">In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells.</a> Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).</li><li>Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+and+taste+coding+in+mammalian+taste+buds.">Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds.</a> Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).</li><li>Dando, R., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+communication+in+intact+taste+buds+through+ATP+signalling+from+pannexin+1+gap+junction+hemichannels.">Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels.</a> The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).</li><li>Chandrashekar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cells+and+peripheral+representation+of+sodium+taste+in+mice.">The cells and peripheral representation of sodium taste in mice.</a> Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).</li><li>Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+salt+recruits+aversive+taste+pathways.">High salt recruits aversive taste pathways.</a> Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).</li><li>Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopic+interrogation+of+peripheral+taste+sensation.">Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation.</a> Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).</li><li>Han, J., Choi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+functional+screening+of+taste+sensation+in+vivo.">Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo.</a> bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).</li><li>Thestrup, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+ratiometric+calcium+sensors+for+functional+in+vivo+imaging+of+neurons+and+T+lymphocytes.">Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes.</a> Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).</li><li>Danilova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glossopharyngeal+nerves+to+taste+stimuli+in+C57BL+/+6J+mice.">Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice.</a> BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Tan, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut-brain+axis+mediates+sugar+preference.">The gut-brain axis mediates sugar preference.</a> Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).</li><li>Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+anion+in+salt+(NaCl)+detection+by+mouse+taste+buds.">The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).</li><li>Kusuhara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taste+responses+in+mice+lacking+taste+receptor+subunit+T1R1.">Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1.</a> Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).</li></ol>

Décrit ici est un protocole détaillé pour appliquer μTongue à l’étude des activités fonctionnelles des cellules gustatives in vivo. Dans ce protocole, l’imagerie fonctionnelle sur les cellules gustatives à l’aide d’indicateurs de calcium génétiquement codés est effectuée. En plus de l’utilisation de souris transgéniques, la charge électrophorétique de colorants calciques (ou colorants à détection de tension) sur les cellules gustatives peut être une option alternative.
<p class="j...

Le microscope à fluorescence intravitale est largement utilisé pour étudier la dynamique spatio-temporelle sur les tissus vivants. Les chercheurs développent rapidement des capteurs génétiquement codés qui fournissent des transformations spécifiques et sensibles des processus biologiques en signaux de fluorescence - qui peuvent être enregistrés facilement à l’aide de microscopes à fluorescence largement disponibles1,2. Bien que la plupart des organes internes chez les rongeurs aient été étudiés au microscope, son application réussie sur la langue n’a pas encore été couronnée de succès3.
Des études antérieures sur l’imagerie calcique des cellules gustatives ont été menées ex vivo en sectionnant finement un tissu de la langue pour obtenir des papilles gustatives circumvallates4,5,6 ou en décollant l’épithélium gustatif pour obtenir des papilles gustatives fongiformes7,8. La préparation de ces échantillons était inévitablement invasive, de sorte que les microenvironnements naturels tels que l’innervation des nerfs, les barrières de perméabilité et la circulation sanguine étaient largement perturbés. La première fenêtre d’imagerie intravitale de la langue a été rapportée en 2015 par Choi et al., mais un enregistrement fonctionnel fiable n’était pas réalisable en raison du mouvement et des artefacts optiques causés par les stimuli de tastant fluidique9.
Récemment, la microfluidique sur langue (μTongue) a été introduite10. Cet appareil intègre un système microfluidique avec une fenêtre d’imagerie sur la langue de la souris. En atteignant un flux quasi stable de stimuli tastant tout au long de la période d’imagerie, les artefacts du mouvement fluidique pourraient être minimisés (Figure 1). Le port d’entrée est alimenté par une série de régulateurs de pression multicanaux, tandis que le port de sortie est connecté à une pompe à seringue, qui maintient 0,3 mL / min. De plus, les artefacts optiques causés par la différence dans les indices de réfraction des solutions de tastant ont été minimisés par une analyse ratiométrique introduisant un indicateur insensible au calcium (tdTomato) ainsi que l’indicateur de calcium (GCaMP6)11. Cette conception a fourni une stabilité microscopique des cellules gustatives in vivo, même avec une commutation brusque entre les canaux fluidiques. Par conséquent, le μTongue met en œuvre un criblage fonctionnel fiable de plusieurs tastants aux papilles gustatives de la souris in vivo.
Dans ce protocole, les procédures expérimentales sont expliquées en détail pour l’imagerie calcique des papilles gustatives fongiformes de souris in vivo à l’aide de μTongue. Tout d’abord, la préparation de salive artificielle et de solutions savoureuses est décrite. Deuxièmement, la mise en place du système microfluidique pour atteindre le flux quasi-stable est introduite. Troisièmement, les procédures utilisées pour monter la langue de la souris sur le μTongue afin de permettre l’acquisition d’images sont délimitées. Enfin, chaque étape de l’analyse d’image, y compris la correction des artefacts de mouvement latéral et de la ratiométrie, est spécifiée. Ce protocole peut être facilement adapté à n’importe quel laboratoire de recherche avec une installation de souris et un microscope à deux photons ou un équipement équivalent.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>acesulfame K</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>04054-25G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>21115-100ML</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0759-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>01810-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>denatonium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5765-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental glue</td>
			<td>Denkist</td>
			<td>P0000CJT-A2</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>57510-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>Loctite 4161, Henkel</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3786-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Yuhan</td>
			<td>Ketamine 50</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0662-25G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>237205-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathwork</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49601-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutiphoton microscope</td>
			<td>Thorlab</td>
			<td>&#160;Bergamo II</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>792519-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N16XLWD-PF</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octaflow</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>OCTAFLOW II</td>
			<td>Fluidic control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC</td>
			<td>LG</td>
			<td>Lg15N54</td>
			<td>Fluidic control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH meter</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>ORION STAR AZ11</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>806562</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quinine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Q1125-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Havard Apparatus</td>
			<td>PHD ULTRA 4400</td>
			<td>Fluidic control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>52194-1G</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafast fiber laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>FFultra920 01042</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer Korea</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

&#181;tongue: a microfluidics-based functional imaging platform for the tongue in vivo

La microscopie à fluorescence intravitale est un outil largement utilisé pour étudier la dynamique multicellulaire chez un animal vivant. Cependant, il n’a pas été utilisé avec succès dans l’organe sensoriel du goût. En intégrant la microfluidique dans la fenêtre d’imagerie intravitale de la langue, le μTongue fournit des images fonctionnelles fiables des cellules gustatives in vivo sous exposition contrôlée à de multiples tastants. Dans cet article, une procédure détaillée étape par étape pour utiliser le système μTongue est présentée. Il y a cinq sous-sections : préparation de solutions tastantes, mise en place d’un module microfluidique, montage d’échantillons, acquisition de données d’images fonctionnelles et analyse de données. Quelques conseils et techniques pour résoudre les problèmes pratiques qui peuvent survenir lors de l’utilisation de la μTongue sont également présentés.

La souris Pirt-GCaMP6f-tdTomato a été utilisée pour obtenir une image de papille gustative. La surface de la langue de la souris était recouverte de papilles filiformes autofluorescentes. Les papilles gustatives sont éparpillées sur la surface de la langue (Figure 4A). Les images de la papille gustative et de sa structure ont été acquises à l’aide de trois détecteurs de filtres différents. En utilisant l’ensemble de filtres 607/70 nm, le signal tdTomato des cellules gustatives...

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Ãƒâ€šÃ‚ÂµTongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

L’article présente le dispositif μTongue (microfluidique sur langue) pour l’imagerie fonctionnelle des cellules gustatives in vivo en intégrant la microfluidique dans une fenêtre d’imagerie intravitale sur la langue.

μTongue : une plateforme d’imagerie fonctionnelle basée sur la microfluidique pour la langue in vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...

Ce protocole permet d’observer les fonctions des cellules gustatives dans un microenvironnement naturel avec des connexions neuronales et une circulation sanguine restant intactes. Grâce à cette technique, la communication de cellule à cellule peut être étudiée in vivo. Pour commencer, remplissez les réservoirs du système de perfusion à flux pressurisé avec de la salive artificielle et des tastants.Connectez la conduite d’air comprimé à l’entrée du régulateur et réglez la pression d’air dans le système de distribution fluidique à 30 à 50 livres par pouce carré. Réglez la pression de sortie du régulateur à 0,4 livre par pouce carré et vérifiez si du liquide commence à s’écouler du tube. Connectez le collecteur des réservoirs au port d’entrée de la micro-langue, puis connectez l’orifice de sortie de la micro-langue à une pompe à seringue et retirez le liquide à environ 300 microlitres par minute pour établir une condition d’état d’équilibre.Confirmez que le volume de la gouttelette suspendue sous la micro languette reste constant et ajustez la pression d’air et le débit pour obtenir la hauteur d’échantillon souhaitée. Une fois le système microfluidique installé, débranchez la conduite d’air comprimé et éteignez la pompe à seringue jusqu’à ce que la souris soit préparée pour l’imagerie in vivo. Après avoir administré l’anesthésie à la souris, injecter par voie intraveineuse TRITC-dextran par une voie rétro-orbitale pour observer la circulation sanguine pendant l’imagerie.Avec la souris placée en position couchée, vaporisez 70% d’éthanol sur sa tête. Utilisez des pinces pour soulever légèrement la peau de la tête, puis utilisez des ciseaux pour couper environ sept millimètres carrés de peau. Après avoir nettoyé les cheveux autour du cuir chevelu, retirez le périoste sous la peau et appliquez un adhésif instantané sur le crâne.Fixez ensuite le fixateur de tête personnalisé. Une fois l’adhésif instantané durci, appliquez de la colle dentaire autour du fixateur de tête et solidifiez-le par un éclairage avec une lumière bleue. En utilisant un adhésif instantané pour coller la lèvre inférieure de la souris à l’unité inférieure de la micro langue, puis placez la souris sur la planche de préparation de la souris et fixez l’unité inférieure à la micro langue aux poteaux de maintien en alignant les trous au bord de la micro langue avec les poteaux.Serrez le fixateur de tête de souris sur le support de fixation de tête sur la carte et ajustez la distance entre la tête de souris et l’appareil. Ensuite, à l’aide du support de fixation de la tête, faites pivoter la tête de la souris en douceur d’environ 45 degrés. Après avoir attaché la souris à la planche, utilisez une pince à épileuse en plastique pour tirer doucement sa langue.Ensuite, à l’aide d’un adhésif instantané, fixez la face ventrale de la langue à la face supérieure de l’unité inférieure de la micro langue. Pour garder la langue humide, essuyez la surface avec un coton-tige humide, puis placez un morceau de tissu imbibé de salive artificielle sur la surface exposée de la langue. Placez les rondelles incurvées sur les poteaux, en tenant la partie inférieure de la micro langue, puis déplacez la préparation de la souris à l’étape du microscope.Placez la langue exposée de la souris sous le centre approximatif de la zone d’objectif du microscope, en veillant à ne pas vous écarter de la plage dynamique de la scène, puis serrez les vis pour fixer fermement la carte de la souris sur la scène. Placez un coussin chauffant sous la souris pour maintenir sa température corporelle entre 36,5 et 37,5 degrés Celsius. Pour empêcher le liquide de pénétrer dans la trachée de la souris, placez un mince morceau de papier torsadé dans la bouche de la souris, puis retirez le tissu humide placé à la surface de la langue et placez la micro-langue préparée sur la langue de la souris, de sorte que la surface de la langue soit visible à travers la fenêtre d’imagerie.Fixez la micro langue en vissant doucement les deux extrémités avec une pression de compression minimale. Pour commencer à acquérir des images, ouvrez le logiciel du microscope, puis allumez le laser à deux photons de 920 nanomètres. Montez l’objectif d’immersion dans l’eau sur le microscope, puis abaissez l’objectif sur la fenêtre d’imagerie de la micro langue et immergez l’objectif.En mode caméra, illuminez la surface de la langue en allumant la lumière bleue d’une lampe au mercure. Pour trouver le plan focal approximatif, ajustez l’axe Z et recherchez un signal d’autofluorescence provenant des papilles filiformes. Ensuite, à l’aide du bouton de réglage X et Y, localisez une papille gustative.Passez en mode multiphoton, puis définissez la longueur d’onde d’excitation, le jeu de filtres d’émission, le mode de balayage et la taille de l’image pour l’acquisition d’images. Avec la papille gustative au centre de la fenêtre d’imagerie, localisez les vaisseaux sanguins entourant la papille gustative à environ deux tiers de la hauteur de la papille gustative et visualisez la circulation sanguine. Si le flux sanguin est bouché, desserrer légèrement les vis de fixation pour reprendre le flux sanguin.Ajustez l’axe Z pour trouver le plan Z d’une papille gustative contenant un nombre suffisant de cellules gustatives, puis procédez à l’imagerie calcique à deux à six Hertz pendant 80 secondes. Après le début de l’imagerie, allumez le réservoir du système fluidique pour fournir une solution de goût pendant 20 secondes. Après 20 secondes de stimulation du goût, revenir au réservoir en salive artificielle.Pendant l’imagerie, attendez environ trois à quatre minutes entre les séances en fournissant constamment de la salive artificielle pour garder la langue humide et laver le tastant restant de la séance précédente. La surface de la langue de la souris Pirt-GCaMP6f-tdTomato est recouverte de papilles filiformes autofluorescentes et de papilles gustatives peu étalées. Les papilles filiformes en jaune sont capturées à l’aide d’un photodétecteur de 500 à 550 nanomètres et peuvent être observées de la surface même de la langue jusqu’à environ 25 micromètres de profondeur.Les signaux GCaMP en vert détectés par le filtre de 500 à 550 nanomètres et les signaux tdTomato en rouge, détectés par le filtre de 607 à 670 nanomètres, représentent les cellules gustatives. Le signal tdTomato est obtenu pour l’analyse métrique du ratio. Les vaisseaux sanguins qui entourent la papille gustative sont acquis à l’aide du filtre de 500 à 550 nanomètres situé dans le tissu conjonctif de collagène, qui soutient structurellement la papille gustative, est acquis à l’aide de l’ensemble de filtres de 447 à 460 nanomètres.Dans cet exemple représentatif de dépistage du goût in vivo à l’aide de l’imagerie calcique, chaque cellule gustative est délimitée par des lignes pointillées. Dans cet essai, la cellule 2 a répondu à la fois aux tastants sucrés et umami. Et la cellule 3 a répondu à la fois à des tastants à faible et à haute teneur en sel.Aucune des cellules de cette papille gustative n’a répondu aux goûts acides. Étant donné que le but de cette expérience est d’observer le goût de la fonction cellulaire dans l’environnement naturel, il est important de délivrer les fluorescents dans les vaisseaux sanguins à l’étape de préparation et de confirmer leur circulation pendant l’expérience.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

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Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy In Vivo

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...