Name: &#181;tongue: a microfluidics-based functional imaging platform for the tongue in vivo
Uploaded: 2021-04-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ã‚ÂµTongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכון למדע בסיסי (IBS-R015-D1), מענק קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון ממשלת קוריאה (MSIT) (מס '2019M3A9E2061789), ועל ידי מענק קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) הממומן על ידי ממשלת קוריאה (מס '2019M3E5D2A01058329). אנו מודים לאונסו קים ויוג'ין לי על הסיוע הטכני שלהם.

כל ההליכים הכירורגיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת סונגקיונקוואן והאוניברסיטה הלאומית של סיאול.
1. הכנת פתרונות: רוק מלאכותי וטרסמים
<ol><li>הכן רוק מלאכותי על ידי המסת 2 מ"מ NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3, 3 mM KHCO3, 0.25 מ"מ CaCl2, 0.25 מ"מ MgCl<s...

<ol>
	<li>Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+subcellular+targeting+of+GCaMP-type+genetically-encoded+calcium+indicators.">Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators.</a> PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain.">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).</li><li>Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence+microscopy:+Lessons+from+observing+cell+behavior+in+their+native+environment.">In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment.</a> Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).</li><li>Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Ca2++imaging+reveals+neurotransmitter+receptors+for+glutamate+in+taste+receptor+cells.">In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells.</a> Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).</li><li>Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+and+taste+coding+in+mammalian+taste+buds.">Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds.</a> Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).</li><li>Dando, R., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+communication+in+intact+taste+buds+through+ATP+signalling+from+pannexin+1+gap+junction+hemichannels.">Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels.</a> The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).</li><li>Chandrashekar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cells+and+peripheral+representation+of+sodium+taste+in+mice.">The cells and peripheral representation of sodium taste in mice.</a> Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).</li><li>Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+salt+recruits+aversive+taste+pathways.">High salt recruits aversive taste pathways.</a> Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).</li><li>Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopic+interrogation+of+peripheral+taste+sensation.">Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation.</a> Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).</li><li>Han, J., Choi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+functional+screening+of+taste+sensation+in+vivo.">Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo.</a> bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).</li><li>Thestrup, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+ratiometric+calcium+sensors+for+functional+in+vivo+imaging+of+neurons+and+T+lymphocytes.">Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes.</a> Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).</li><li>Danilova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glossopharyngeal+nerves+to+taste+stimuli+in+C57BL+/+6J+mice.">Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice.</a> BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Tan, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut-brain+axis+mediates+sugar+preference.">The gut-brain axis mediates sugar preference.</a> Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).</li><li>Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+anion+in+salt+(NaCl)+detection+by+mouse+taste+buds.">The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).</li><li>Kusuhara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taste+responses+in+mice+lacking+taste+receptor+subunit+T1R1.">Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1.</a> Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).</li></ol>

מתואר כאן פרוטוקול מפורט כדי להחיל μTongue על החקירה של פעילויות פונקציונליות של תאי טעם ב vivo. בפרוטוקול זה, מתבצעת ההדמיה התפקודית על תאי הטעם באמצעות אינדיקטורים לסידן מקודדים גנטית. בנוסף לשימוש בעכברים מהונדסים, טעינה אלקטרופורטית של צבעי סידן (או צבעי חישת מתח) על תאי הטעם יכולה להי...

מיקרוסקופ פלואורסצנטיות תוך-וינטלית נמצא בשימוש נרחב כדי לחקור את הדינמיקה השופעת על רקמות חיות. חוקרים מפתחים במהירות חיישנים מקודדים גנטית המספקים טרנספורמציות ספציפיות ורגישות של התהליכים הביולוגיים לאותות פלואורסצנטיות - אשר ניתן להקליט בקלות באמצעות מיקרוסקופים פלואורסצנטיים הזמינים באופן נרחב1,2. למרות שרוב האיברים הפנימיים במכרסמים נחקרו באמצעות המיקרוסקופ, היישום המוצלח שלה ללשון עדיין לא הצליח3.
מחקרים קודמים על הדמיית סידן של תאי טעם נערכו ex vivo על ידי חתך דק של רקמת לשון כדי לקבל בלוטות טעם להקיף4,5,6 או על ידי קילוף אפיתל הטעם כדי להשיגבלוטות טעםפטרייתיות7,8. הכנת דגימות אלה הייתה פולשנית באופן בלתי נמנע, ולכן המיקרו-סביבה הטבעית כגון פנימיות העצבים, מחסומי החן וזרימת הדם, היו מוטרדות במידה רבה. חלון הדמיית הלשון התוך-ויטלי הראשון דווח בשנת 2015 על ידי Choi et al., אך הקלטה פונקציונלית אמינה לא הייתה ברת השגה בגלל התנועה וממצאים אופטיים הנגרמים על ידי גירויים טעימים נוזלים9.
לאחרונה, microfluidics-על-לשון (μTongue) הוצג10. התקן זה משלב מערכת מיקרופלואידית עם חלון הדמיה על לשון העכבר. על-ידי השגת זרימה מעין-יציבה-יציבה של גירויים טעימים לאורך כל תקופת ההדמיה, ניתן היה למזער חפצים מתנועה נוזלית (איור 1). יציאת הקלט ניזונה מסדרה של בקרי לחץ רב-ערוציים, בעוד שיציאת הפלט מחוברת למשאבת מזרק, השומרת על 0.3 מ"ל/דקה. בנוסף, ממצאים אופטיים שנגרמו על ידי ההבדל במדדים שבירה של פתרונות טעימים צומצמו על ידי ניתוח יחסי המציג אינדיקטור סידן חסר רגישות (tdTomato) כמו גם מחוון סידן (GCaMP6)11. עיצוב זה סיפק יציבות מיקרוסקופית של תאי טעם ב- vivo אפילו עם מעבר פתאומי בין ערוצים נוזליים. כתוצאה מכך, μTongue ליישם הקרנה פונקציונלית אמינה של tastants מרובים בלוטות הטעם של העכבר ב vivo.
בפרוטוקול זה, ההליכים הניסיוניים מוסברים בפירוט עבור הדמיית סידן של בלוטות הטעם פטריות העכבר ב vivo באמצעות μTongue. ראשית, הכנת רוק מלאכותי ופתרונות טעימים מתוארת. שנית, הקמת המערכת המיקרופלואידית להשגת זרימת מצב מעין-יציבה מוצגת. שלישית, ההליכים המשמשים להרכבה של לשון העכבר על μTongue כדי לאפשר רכישת תמונה הם מתויגים. לבסוף, כל שלב לניתוח תמונה, כולל תיקון של ממצאי תנועה לרוחב ויחס, מצוין. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות לכל מעבדת מחקר עם מתקן עכבר ומיקרוסקופ שני פוטון או ציוד שווה ערך.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>acesulfame K</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>04054-25G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>21115-100ML</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0759-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>01810-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>denatonium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5765-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental glue</td>
			<td>Denkist</td>
			<td>P0000CJT-A2</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>57510-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>Loctite 4161, Henkel</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3786-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Yuhan</td>
			<td>Ketamine 50</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0662-25G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>237205-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathwork</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49601-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutiphoton microscope</td>
			<td>Thorlab</td>
			<td>&#160;Bergamo II</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>792519-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N16XLWD-PF</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octaflow</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>OCTAFLOW II</td>
			<td>Fluidic control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC</td>
			<td>LG</td>
			<td>Lg15N54</td>
			<td>Fluidic control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH meter</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>ORION STAR AZ11</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>806562</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quinine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Q1125-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Havard Apparatus</td>
			<td>PHD ULTRA 4400</td>
			<td>Fluidic control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>52194-1G</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafast fiber laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>FFultra920 01042</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer Korea</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

&#181;tongue: a microfluidics-based functional imaging platform for the tongue in vivo

מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות תוך-וינטלית היא כלי המשמש באופן נרחב לחקר דינמיקה רב-תאית בחיה חיה. עם זאת, זה לא נעשה שימוש מוצלח באיבר החושי טעם. על ידי שילוב מיקרופלואידיקה בחלון הדמיית הלשון התוך-ויטלי, ה- μTongue מספק תמונות פונקציונליות אמינות של תאי טעם ב- vivo תחת חשיפה מבוקרת לטעמים מרובים. במאמר זה מוצג הליך מפורט שלב אחר שלב לשימוש במערכת μTongue. קיימות חמש סעיפים: הכנת פתרונות טעימים, הקמת מודול מיקרופלואידי, הרכבה לדוגמה, רכישת נתוני תמונה פונקציונליים וניתוח נתונים. כמה טיפים וטכניקות כדי לפתור את הבעיות המעשיות שעלולות להתעורר בעת שימוש μTongue מוצגים גם.

עכבר Pirt-GCaMP6f-tdTomato שימש להשגת תמונת בלוטות טעם. פני השטח של לשון העכבר היו מכוסים בפפילה פילפורמית אוטופלואורסצנטית. בלוטות הטעם מפוזרות בדלילות על פני הלשון(איור 4A). התמונות של בלוטות הטעם והמבנה שלה נרכשו באמצעות שלושה גלאי מסננים שונים. באמצעות ערכת המסננים 607/70 ננומטר, או...

Watch this Scientific Journal Video about Ã‚ÂµTongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo at JoVE.com

Ãƒâ€šÃ‚ÂµTongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

המאמר מציג את מכשיר μTongue (microfluidics-on-a-tongue) להדמיית תאי טעם פונקציונליים ב- vivo על ידי שילוב מיקרופלואידיקה בחלון הדמיה תוך-וינטלי על הלשון.

μTongue: פלטפורמת הדמיה פונקציונלית מבוססת מיקרופלואידיקה עבור הלשון ב- Vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...

פרוטוקול זה מאפשר התבוננות בתפקודים של תאי טעם במיקרו-סביבה טבעית עם קשרים עצביים וזרימת הדם שנותרה ללא פגע. באמצעות טכניקה זו, תקשורת בין תאים יכולה להיחקר ב- vivo. ראשית, מלאו את המאגרים של מערכת זלוף הזרימה בלחץ ברוק מלאכותי ותירסים.חבר את קו האוויר הדחוס לקלט הווסת והגדר את לחץ האוויר במערכת האספקה הנוזלית ל -30 עד 50 פאונד לאינץ 'מרובע. הגדר את לחץ הפלט של הווסת ל 0.4 פאונד לאינץ 'מרובע ולבדוק אם נוזל מתחיל לזרום מהצינור. חבר את הסעפת מהמאגרים ליציאת הכניסה של הלשון הזעירה, ולאחר מכן חבר את יציאת היציאה של הלשון הזעירה למשאבת מזרק ומשוך נוזל בכ -300 מיקרוליטרים לדקה כדי לקבוע מצב יציב.אשר כי נפח הטיפה התלוי מתחת ללשון המיקרו נשאר קבוע ולהתאים את לחץ האוויר ואת קצב הזרימה כדי לקבל את גובה המדגם הרצוי. לאחר שהמערכת המיקרופלואידית הוקמה, נתק את קו האוויר הדחוס וכבה את משאבת המזרק עד שהעכבר הוכן להדמיית ויוו. לאחר מתן הרדמה לעכבר, תוך ורידי להזריק TRITC-dextran דרך מסלול רטרו-מסלולית כדי לצפות במחזור הדם במהלך הדמיה.עם העכבר ממוקם בתנוחת עלון, לרסס 70% אתנול על ראשו. השתמש במלקחיים כדי להרים את עור הראש בקלילות, ולאחר מכן להשתמש במספריים כדי ללגום כשבעה מילימטרים רבועים של העור. לאחר ניקוי השיער סביב הקרקפת, להסיר את periosteum מתחת לעור ולהחיל דבק מיידי על הגולגולת.לאחר מכן צרף את מתקן הראש המותאם אישית. לאחר הדבקה מיידית הוא התקשה, להחיל דבק דנטלי סביב מתקן הראש ולבסס אותו על ידי תאורה עם אור כחול. באמצעות דבק מיידי כדי להדביק את השפה התחתונה של העכבר ליחידה התחתונה של הלשון הזעירה, ואז הניח את העכבר על לוח ההכנה לעכבר ואבטח את היחידה התחתונה בלשון המיקרו לעמודי האחיזה על ידי יישור החורים בקצה הלשון הזעירה עם העמודים.הדק את מתקן ראש העכבר למחזיק מתקן הראש בלוח והתאם את המרחק בין ראש העכבר להתקן. לאחר מכן, באמצעות מחזיק מתקן הראש, סובב את ראש העכבר בצורה חלקה בכ- 45 מעלות. לאחר אבטחת העכבר ללוח, השתמש פינצטה מפלסטיק כדי לצייר את לשונו בעדינות.לאחר מכן, באמצעות דבק מיידי, חבר את הצד הגחון של הלשון לצד העליון של היחידה התחתונה של הלשון הזעירה. כדי לשמור על הלשון לחה, לנגב את פני השטח עם צמר גפן רטוב, ולאחר מכן מניחים חתיכת רקמה ספוגה ברוק מלאכותי על פני השטח החשופים של הלשון. הנח את מכונות הכביסה המעוקלות על העמודים, החזקת החלק התחתון של הלשון הזעירים, ולאחר מכן הזז את הכנת העכבר לשלב המיקרוסקופ.מקם את הלשון החשופה של העכבר מתחת למרכז המשוער של אזור המטרה של המיקרוסקופ, הקפד לא לסטות מהטווח הדינמי של הבמה, ולאחר מכן הדק את הברגים כדי לחבר בחוזקה את לוח העכבר על הבמה. מניח כרית חימום מתחת לעכבר כדי לשמור על טמפרטורת הגוף שלה בין 36.5 ל 37.5 מעלות צלזיוס. כדי למנוע מנוזל להיכנס קנה הנשימה של העכבר, הנח פיסת נייר מעוותת דקה בתוך פיו של העכבר, ולאחר מכן הסר את הרקמה הרטובה המונחת על פני הלשון והנח את לשון המיקרו המוכנה על לשון העכבר, כך שפני השטח של הלשון נראים דרך חלון ההדמיה.אבטחו את הלשון הזעירה על ידי עדין של שני הקצוות בלחץ דחיסה מינימלי. כדי להתחיל לרכוש תמונות, פתח את תוכנת המיקרוסקופ ולאחר מכן הפעל את לייזר 920 ננומטר שני פוטון. הר את המטרה טבילת מים על המיקרוסקופ, ולאחר מכן להוריד את המטרה על חלון ההדמיה של לשון מיקרו ולטבול את המטרה.במצב מצלמה, האר את פני השטח של הלשון על ידי הפעלת האור הכחול מנורת כספית. כדי למצוא את מישור המוקד המשוער, התאם את ציר Z וחפש אות פלואורסצנטיות אוטומטית מהפאפילה הפיליבפורמית. לאחר מכן, בעזרת ידית ההתאמה X ו-Y, אתר בלוטות טעם.עבור למצב ריבוי פוטונים ולאחר מכן הגדר את אורך הגל של העירור, ערכת מסנני הפליטה, מצב הסריקה וגודל המסגרת לרכישת תמונה. כאשר בלוטות הטעם במרכז חלון ההדמיה, אתר את כלי הדם המקיפים את בלוטות הטעם כשני שלישים מגובה בלוטות הטעם ודמיין את זרימת הדם. אם זרימת הדם סתומה, שחררו מעט את הברגים לתיקון כדי לחדש את זרימת הדם.התאימו את ציר Z כדי למצוא את מישור Z של בלוטות טעם המכילות מספר מספיק של תאי טעם, ולאחר מכן המשיכו עם הדמיית סידן בשתיים עד שש הרץ למשך 80 שניות. לאחר תחילת ההדמיה, יש להפעיל את המאגר של המערכת הנוזלית כדי לספק פתרון טעם למשך 20 שניות. לאחר 20 שניות של גירוי טעם, להעביר את המאגר בחזרה לרוק מלאכותי.במהלך ההדמיה, המתינו כשלוש עד ארבע דקות בין מפגשים המספקים בעקביות רוק מלאכותי כדי לשמור על הלשון לחה ולשטוף את הטעים שנותרו מהפגישה הקודמת. משטח הלשון של עכבר Pirt-GCaMP6f-tdTomato מכוסה בפפילה פילפורמית פלואורסצנטית ומופצת בדלילות בלוטות טעם. הפפילה filiform בצהוב נתפסים באמצעות גלאי צילום ב 500 עד 550 ננומטר וניתן לראות מפני השטח של הלשון עד כ 25 מיקרומטר לעומק.אותות GCaMP בירוק שזוהו על ידי מסנן 500 עד 550 ננומטר ואותות tdTomato באדום, שזוהו על ידי מסנן 607 עד 670 ננומטר, מייצגים את תאי הטעם. אות tdTomato מתקבל לניתוח מטרי יחס. כלי הדם המקיפים את בלוטות הטעם נרכשים באמצעות מסנן 500 עד 550 ננומטר שנקבע ברקמת חיבור הקולגן, התומכת מבחינה מבנית בבלוטות הטעם, נרכש באמצעות ערכת המסננים 447 עד 460 ננומטר.בדוגמה מייצגת זו של הקרנת טעם in-vivo באמצעות הדמיית סידן, כל תא טעם הוא תוחם על ידי קווים מקווקווים. במשפט זה, תא 2 הגיב הן לתמיסות מתוקות והן לתמיסות אומאמי. ותא 3 הגיב לתהלי מלח נמוכים וגבוהים כאחד.אף אחד מהתאים בבלוטות הטעם הזו לא הגיב לטעמים חמוצים. מכיוון שמטרת ניסוי זה היא להתבונן בתפקוד התאים הטעמים בסביבה הטבעית, חשוב להעביר את הפלואורסצנטים לכלי הדם בשלב ההכנה ולאשר את זרימת הדם במהלך הניסוי.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

מיפוי פונקציונלית עם מג סימולטני EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

ברזולוציה גבוהה תהודה מגנטית פונקציונלית שיטות המוח התיכון האדם

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo הדמיה של נדידת תאי המוח הקטן אחרי הלידה גרגיר שימוש Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

בו זמנית<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; בדיקות פונקציונליות של שתי הרשתיות על ידי<em&gt; In vivo</emמערכת electroretinogram&gt;

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

הדמיית תהודה מגנטית מבנית ברזולוציה גבוהה של תת-הקליפה&quot; האדם<I&gt; In vivo</I&gt; ולאחר המוות

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

בגישת ההדמיה התפקודי של מוח Vivo בהתבסס על סידן Bioluminescent המחוון GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

שיטה הנפחי עבור כימות Vasospasm המוחית במודל מאתר של דימום תת-עכבישי

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

אין ויוו שני הפוטונים הדמיה של נוירונים בקליפת המוח בעכברים Neonatal

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

ב Vivo הדמיה של התחבורה נוזל שדרתי דרך הגולגולת העכבר ללא שינוי באמצעות זריחה מאקרוסקופיה

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...