Name: &#181;tongue: a microfluidics-based functional imaging platform for the tongue in vivo
Uploaded: 2021-04-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ã‚ÂµTongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Institute of Basic Science (IBS-R015-D1), dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal governo coreano (MSIT) (n. 2019M3A9E2061789) e dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal governo coreano (MSIT) (n. 2019M3E5D2A01058329). Siamo grati a Eunsoo Kim e Eugene Lee per la loro assistenza tecnica.

Tutte le procedure chirurgiche sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Sungkyunkwan University e della Seoul National University.
1. Preparazione di soluzioni: saliva artificiale e detastanti
<ol><li>Preparare la saliva artificiale sciogliendo 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3, 3 mM KHCO3, 0,25 mM CaCl2, 0,25 mM MgCl2, 0,12 mM K2HPO4, 0,12 mM KH2PO4e 1,8 mM HCl i...

<ol>
	<li>Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+subcellular+targeting+of+GCaMP-type+genetically-encoded+calcium+indicators.">Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators.</a> PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain.">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).</li><li>Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence+microscopy:+Lessons+from+observing+cell+behavior+in+their+native+environment.">In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment.</a> Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).</li><li>Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Ca2++imaging+reveals+neurotransmitter+receptors+for+glutamate+in+taste+receptor+cells.">In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells.</a> Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).</li><li>Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+and+taste+coding+in+mammalian+taste+buds.">Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds.</a> Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).</li><li>Dando, R., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+communication+in+intact+taste+buds+through+ATP+signalling+from+pannexin+1+gap+junction+hemichannels.">Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels.</a> The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).</li><li>Chandrashekar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cells+and+peripheral+representation+of+sodium+taste+in+mice.">The cells and peripheral representation of sodium taste in mice.</a> Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).</li><li>Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+salt+recruits+aversive+taste+pathways.">High salt recruits aversive taste pathways.</a> Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).</li><li>Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopic+interrogation+of+peripheral+taste+sensation.">Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation.</a> Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).</li><li>Han, J., Choi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+functional+screening+of+taste+sensation+in+vivo.">Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo.</a> bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).</li><li>Thestrup, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+ratiometric+calcium+sensors+for+functional+in+vivo+imaging+of+neurons+and+T+lymphocytes.">Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes.</a> Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).</li><li>Danilova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glossopharyngeal+nerves+to+taste+stimuli+in+C57BL+/+6J+mice.">Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice.</a> BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Tan, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut-brain+axis+mediates+sugar+preference.">The gut-brain axis mediates sugar preference.</a> Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).</li><li>Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+anion+in+salt+(NaCl)+detection+by+mouse+taste+buds.">The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).</li><li>Kusuhara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taste+responses+in+mice+lacking+taste+receptor+subunit+T1R1.">Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1.</a> Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).</li></ol>

Qui è descritto un protocollo dettagliato per applicare μTongue allo studio delle attività funzionali delle cellule del gusto in vivo. In questo protocollo, viene eseguita l'imaging funzionale sulle cellule del gusto utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati. Oltre all'uso di topi transgenici, il carico elettroforetico di coloranti di calcio (o coloranti sensibili alla tensione) sulle cellule del gusto può essere un'opzione alternativa.
In questo esperimento sono s...

Il microscopio a fluorescenza intravitale è ampiamente utilizzato per studiare le dinamiche spaziotemporali sui tessuti viventi. I ricercatori stanno rapidamente sviluppando sensori geneticamente codificati che forniscono trasformazioni specifiche e sensibili dei processi biologici in segnali di fluorescenza - che possono essere registrati facilmente utilizzando microscopi a fluorescenza che sono ampiamente disponibili1,2. Sebbene la maggior parte degli organi interni nei roditori siano stati studiati utilizzando il microscopio, la sua applicazione di successo alla lingua non ha ancora avuto successo3.
Precedenti studi sull'imaging del calcio delle cellule del gusto sono stati condotti ex vivo sezionando un tessuto della lingua per ottenere papille gustative circumvallate4,5,6 o staccando l'epitelio gustatico per ottenere papille gustative fungiformi7,8. La preparazione di questi campioni era inevitabilmente invasiva, quindi i microambienti naturali come l'innervazione dei nervi, le barriere di permeabilità e la circolazione sanguigna erano in gran parte perturbati. La prima finestra di imaging della lingua intravitale è stata segnalata nel 2015 da Choi et al., ma una registrazione funzionale affidabile non era raggiungibile a causa del movimento e degli artefatti ottici causati dagli stimoli tastanti fluidici9.
Recentemente, la microfluidica su una lingua (μTongue) è stata introdotta10. Questo dispositivo integra un sistema microfluidico con una finestra di imaging sulla lingua del mouse. Raggiungendo un flusso quasi stazionario di stimoli tastanti per tutto il periodo di imaging, gli artefatti del movimento fluidico potrebbero essere ridotti al minimo (Figura 1). La porta di ingresso è alimentata da una serie di regolatori di pressione multicanale, mentre la porta di uscita è collegata a una pompa a siringa, che mantiene 0,3 ml / min. Inoltre, gli artefatti ottici causati dalla differenza negli indici di rifrazione delle soluzioni tastant sono stati ridotti al minimo dall'analisi quantoometrica introducendo un indicatore insensibile al calcio (tdTomato) e l'indicatore del calcio (GCaMP6)11. Questo design ha fornito la stabilità microscopica delle cellule del gusto in vivo anche con bruschi passaggi tra canali fluidici. Di conseguenza, la μTongue implementa uno screening funzionale affidabile di più degustanti alle papille gustative del topo in vivo.
In questo protocollo, le procedure sperimentali sono spiegate in dettaglio per l'imaging del calcio delle papille gustative fungiformi del topo in vivo usando μTongue. In primo luogo, viene descritta la preparazione di saliva artificiale e soluzioni tastant. In secondo luogo, viene introdotta la creazione del sistema microfluidico per raggiungere il flusso quasi stazionario. In terzo luogo, vengono delineate le procedure utilizzate per montare la linguetta del mouse sulla μTongue per consentire l'acquisizione dell'immagine. Infine, viene specificato ogni passaggio per l'analisi delle immagini, compresa la correzione degli artefatti di movimento laterale e la ratiometria. Questo protocollo può essere adattato facilmente a qualsiasi laboratorio di ricerca con una struttura per topi e un microscopio a due fotoni o apparecchiature equivalenti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>acesulfame K</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>04054-25G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>21115-100ML</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0759-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>01810-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>denatonium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5765-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental glue</td>
			<td>Denkist</td>
			<td>P0000CJT-A2</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>57510-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>Loctite 4161, Henkel</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3786-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Yuhan</td>
			<td>Ketamine 50</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0662-25G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>237205-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathwork</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49601-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutiphoton microscope</td>
			<td>Thorlab</td>
			<td>&#160;Bergamo II</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>792519-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N16XLWD-PF</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octaflow</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>OCTAFLOW II</td>
			<td>Fluidic control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC</td>
			<td>LG</td>
			<td>Lg15N54</td>
			<td>Fluidic control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH meter</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>ORION STAR AZ11</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>806562</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quinine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Q1125-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Havard Apparatus</td>
			<td>PHD ULTRA 4400</td>
			<td>Fluidic control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>52194-1G</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafast fiber laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>FFultra920 01042</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer Korea</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

&#181;tongue: a microfluidics-based functional imaging platform for the tongue in vivo

La microscopia a fluorescenza intravitale è uno strumento ampiamente utilizzato per studiare la dinamica multicellulare in un animale vivo. Tuttavia, non è stato utilizzato con successo nell'organo sensoriale del gusto. Integrando la microfluidica nella finestra di imaging della lingua intravitale, μTongue fornisce immagini funzionali affidabili delle cellule del gusto in vivo sotto esposizione controllata a più detastanti. In questo documento, viene presentata una procedura dettagliata passo-passo per utilizzare il sistema μTongue. Ci sono cinque sottosezioni: preparazione di soluzioni tastant, creazione di un modulo microfluidico, montaggio del campione, acquisizione di dati di immagine funzionali e analisi dei dati. Vengono inoltre presentati alcuni suggerimenti e tecniche per risolvere i problemi pratici che possono sorgere quando si utilizza la μTongue.

Il topo Pirt-GCaMP6f-tdTomato è stato utilizzato per ottenere un'immagine delle papille gustative. La superficie della lingua del topo era ricoperta di papille filiformi autofluorescenti. Le papille gustative sono sparse sulla superficie della lingua (Figura 4A). Le immagini della papille gusta e della sua struttura sono state acquisite utilizzando tre diversi rilevatori di filtri. Utilizzando il set di filtri 607/70 nm, è stato ottenuto il segnale tdTomato dalle cellule del gusto per l'an...

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Ãƒâ€šÃ‚ÂµTongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

L'articolo introduce il dispositivo μTongue (microfluidica su una lingua) per l'imaging funzionale delle cellule gustative in vivo integrando la microfluidica in una finestra di imaging intravitale sulla lingua.

μTongue: una piattaforma di imaging funzionale basata sulla microfluidica per la lingua in vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...

Questo protocollo consente di osservare le funzioni delle cellule del gusto in un microambiente naturale con connessioni neurali e circolazione sanguigna che rimangono intatte. Utilizzando questa tecnica, la comunicazione cellula-cellula può essere studiata in vivo. Per iniziare, riempire i serbatoi del sistema di perfusione a flusso pressurizzato con saliva artificiale e detastanti.Collegare la linea dell'aria compressa all'ingresso del regolatore e impostare la pressione dell'aria nel sistema di erogazione fluidica su 30-50 libbre per pollice quadrato. Impostare la pressione di uscita del regolatore a 0,4 libbre per pollice quadrato e verificare se il liquido inizia a fuoriuscire dal tubo. Collegare il collettore dai serbatoi alla porta di ingresso della micro linguetta, quindi collegare la porta di uscita della micro lingua a una pompa a siringa e prelevare il liquido a circa 300 microlitri al minuto per stabilire una condizione di stato stazionario.Confermare che il volume della goccia appesa sotto la micro linguetta rimanga costante e regolare la pressione dell'aria e la portata per ottenere l'altezza del campione desiderata. Una volta impostato il sistema microfluidico, scollegare la linea dell'aria compressa e spegnere la pompa della siringa fino a quando il mouse non è stato preparato per l'imaging in vivo. Dopo aver somministrato l'anestesia al topo, iniettare per via endovenosa TRITC-destrano attraverso una via retro-orbitale per osservare la circolazione sanguigna durante l'imaging.Con il mouse posto in posizione supina, spruzzare il 70% di etanolo sulla sua testa. Usa una pinza per sollevare leggermente la pelle della testa, quindi usa le forbici per tagliare circa sette millimetri quadrati di pelle. Dopo aver pulito i capelli intorno al cuoio capelluto, rimuovere il periosteo da sotto la pelle e applicare un adesivo istantaneo sul cranio.Quindi collegare il fissatore di teste personalizzato. Una volta che l'adesivo istantaneo è indurito, applicare la colla dentale attorno al fissatore della testa e solidificarlo mediante illuminazione con una luce blu. Utilizzando l'adesivo istantaneo per incollare il labbro inferiore del mouse all'unità inferiore della micro lingua, quindi posizionare il mouse sulla scheda di preparazione del mouse e fissare l'unità inferiore alla micro linguetta ai montanti di tenuta allineando i fori sul bordo della micro lingua con i montanti.Stringere il fissatore della testa del mouse sul supporto del fissatore della testa sulla scheda e regolare la distanza tra la testa del mouse e il dispositivo. Quindi, utilizzando il supporto del fissatore della testa, ruotare la testa del mouse senza intoppi di circa 45 gradi. Dopo aver fissato il mouse alla scheda, utilizzare una pinzetta di plastica per disegnare delicatamente la lingua.Quindi, utilizzando l'adesivo istantaneo, collegare il lato ventrale della lingua al lato superiore dell'unità inferiore della micro lingua. Per mantenere la lingua umida, pulire la superficie con un batuffolo di cotone bagnato, quindi posizionare un pezzo di tessuto imbevuto di saliva artificiale sulla superficie esposta della lingua. Posizionare le rondelle curve sui montanti, tenendo la parte inferiore della micro lingua, quindi spostare la preparazione del mouse allo stadio del microscopio.Posizionare la linguetta esposta del mouse sotto il centro approssimativo dell'area dell'obiettivo del microscopio, assicurandosi di non deviare dalla gamma dinamica dello stadio, quindi stringere le viti per fissare saldamente la scheda del mouse sul palco. Posizionare una piastra riscaldante sotto il mouse per mantenere la temperatura corporea tra 36,5 e 37,5 gradi Celsius. Per evitare che il liquido penetri nella trachea del topo, posizionare un sottile pezzo di carta intrecciata all'interno della bocca del topo, quindi rimuovere il tessuto bagnato posto sulla superficie della lingua e posizionare la micro lingua preparata sulla lingua del topo, in modo tale che la superficie della lingua sia visibile attraverso la finestra di imaging.Fissare la micro linguetta avvitando delicatamente entrambe le estremità con una pressione di compressione minima. Per iniziare ad acquisire immagini, aprire il software del microscopio, quindi accendere il laser a due fotone da 920 nanometri. Montare l'obiettivo di immersione in acqua sul microscopio, quindi abbassare l'obiettivo sulla finestra di imaging della microlingua e immergere l'obiettivo.In modalità fotocamera, illuminare la superficie della lingua accendendo la luce blu di una lampada al mercurio. Per trovare il piano focale approssimativo, regolare l'asse Z e cercare un segnale di autofluorescenza dalle papille filiformi. Quindi, utilizzando la manopola di regolazione X e Y, individuare una papille gusta mobile.Passare alla modalità multi-fotone, quindi impostare la lunghezza d'onda di eccitazione, il set di filtri di emissione, la modalità di scansione e le dimensioni del fotogramma per l'acquisizione delle immagini. Con la papille gustatica al centro della finestra di imaging, individuare i vasi sanguigni che circondano la papille gustatica a circa due terzi dell'altezza della papille gustatica e visualizzare la circolazione sanguigna. Se il flusso sanguigno è intasato, allentare leggermente le viti di fissaggio per riprendere il flusso sanguigno.Regolare l'asse Z per trovare il piano Z di una papille gustativa contenente un numero adeguato di cellule gustative, quindi procedere con l'imaging del calcio da due a sei Hertz per 80 secondi. Dopo l'avvio dell'imaging, accendere il serbatoio del sistema fluidico per fornire una soluzione di gusto per 20 secondi. Dopo 20 secondi di stimolazione del gusto, riportare il serbatoio alla saliva artificiale.Durante l'imaging, attendere circa tre o quattro minuti tra le sessioni fornendo costantemente saliva artificiale per mantenere la lingua umida e lavare via il tastant rimanente dalla sessione precedente. La superficie della lingua del topo Pirt-GCaMP6f-tdTomato è ricoperta da papille filiformi autofluorescenti e papille gustative scarsamente diffuse. Le papille filiformi in giallo vengono catturate utilizzando un fotorilevatore a 500-550 nanometri e possono essere osservate dalla superficie stessa della lingua fino a circa 25 micrometri di profondità.I segnali GCaMP in verde rilevati dal filtro da 500 a 550 nanometri e i segnali tdTomato in rosso, rilevati dal filtro da 607 a 670 nanometri, rappresentano le cellule del gusto. Il segnale tdTomato è ottenuto per l'analisi metrica del rapporto. I vasi sanguigni che circondano la papille gustativa vengono acquisiti utilizzando il filtro da 500 a 550 nanometri impostato nel tessuto connettivo del collagene, che supporta strutturalmente la papille gustativa, viene acquisito utilizzando il set di filtri da 447 a 460 nanometri.In questo esempio rappresentativo di screening del gusto in vivo utilizzando l'imaging del calcio, ogni cellula del gusto è delimitata da linee tratteggiate. In questo studio, la cellula 2 ha risposto sia ai tastants dolci che a quello umami. E la cellula 3 ha risposto sia ai tastants a basso che ad alto contenuto di sale.Nessuna delle cellule di questa papille gusta l'ha risposto ai sapori aspri. Poiché lo scopo di questo esperimento è quello di osservare la funzione cellulare dei sapori nell'ambiente naturale, è importante consegnare le fluorescenti nei vasi sanguigni nella fase di preparazione e confermare la sua circolazione durante l'esperimento.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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